CN102286074B - 一种cd13靶向肽ngr及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CD13的NGR靶向肽及其应用，所述NGR靶向肽的氨基酸序列为：CNGRVSTNGRC；还提供一种融合蛋白NGR-TNFα，所述NGR-TNFα为所述NGR靶向肽和TNFα所构成的融合蛋白。所述CD13靶向肽NGR通过常规组织化学染色方法设计筛选，再通过基因重组的方法将所述NGR肽与人TNFα融合获得融合蛋白NGR-TNFα。本发明人通过大量实验分析后发现，所述NGR-TNFα可以靶向的以抑制肿瘤内新生血管生长的方式抑制肿瘤细胞生长，起到抗肿瘤的效果。
Description
技术领域
本发明提供一种CD13靶向肽NGR、其制备方法及其在制备诊断或治疗肿瘤靶向药物或制剂中的应用；本发明还提供一种融合蛋白NGR-TNFα、其制备方法及其在制备诊断或治疗肿瘤靶向药物或制剂中的应用。
背景技术
恶性肿瘤严重危害人类健康。世界卫生组织发表的一项研究报告表明，目前，全世界恶性肿瘤每年发病1100多万人，病死800多万人，并预测，到2020年，恶性肿瘤的发病率将提高50％，新增恶性肿瘤患者将达到每年2000万人。在我国，近年来恶性肿瘤已经成为城市居民死亡的第一原因，每年新发病患者为220万人。全人类与癌症的斗争已经进入攻艰阶段。与这种情况背离的是，目前恶性肿瘤的治疗，尤其是晚期恶性肿瘤的治疗，尚缺乏有效的药物和方法。因此，开发新的有效的抗肿瘤药物，具有重大的经济效益的同时，也具有重要的社会效益。
人肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)是由活化的单核-巨噬细胞产生的一种细胞因子。通过与靶细胞膜上肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factorreceptor，TNFR)结合，实现其细胞毒性、抗病毒、免疫调节等生物学功能。由于大多数细胞肿瘤细胞膜上表达肿瘤坏死因子α，因此，TNFα对多种肿瘤细胞具有杀伤效应。而且，TNFα可以作用于肿瘤内新生血管内皮细胞，导致血管功能紊乱，从而进一步体现其抗肿瘤作用。然而，TNFα对细胞的这种杀伤作用缺乏肿瘤特异性，因为在许多正常组织细胞，均有TNFR的表达。当TNFα的浓度达到体现抗肿瘤作用时，对正常组织细胞也体现了杀伤作用，表现为严重的毒副作用。在我国，TNFα的数种突变体均在临床使用过，但均由于产生严重的毒副作用而受到限制。
NGR(Asn-Gly-Arg)是通过噬菌体展示技术筛选出来的能够和肿瘤新生血管特异结合的三肽模体，可以通过内皮细胞上的氨肽酶N(aminopeptidase N，亦称CD13)与新生血管发生特异性的结合。NGR多肽可以将多种药物分子和病毒载体靶向运输到肿瘤或者进行血管再生的组织中。NGR模体上的天冬酰胺脱酰胺后生成异天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸异构体(isoDGR)。isoDGR是整联蛋白αvβ3的配体，可以作为一种新的肿瘤新生血管靶向肽用于肿瘤靶向治疗的研究。
NGR-hTNF(NGR-human tumour necrosis factor-alpha)是一种开发中的肿瘤靶向性药物，NGR可以选择性地与肿瘤血管上过度表达的CD13结合，从而使NGR-hTNF在肿瘤部位富集，达到在低剂量下破坏肿瘤新生血管、杀伤肿瘤细胞的作用。NGR-hTNF目前已处于II期临床研究阶段。在早期的临床前研究过程中发现，NGR-hTNF在0.2ug/m2的剂量下，体现了良好的抗肿瘤作用，而在相同的剂量下，hTNF则未体现抗肿瘤活性。I期和II期的临床研究结果表明，NGR-hTNF在0.8ug/m2的有效治疗剂量下，显示出良好的耐受性，未发现3-4级毒副反应，仅观察到轻微的血压一过性升高和轻度的与局部灌注给药相关的一过性寒颤反应。在进行的晚期经一线治疗药物失败的肝细胞肝癌、结肠癌/术后复发和恶性胸膜间皮瘤的II期临床研究中NGR-hTNF均体现了良好的疗效。
发明内容
本发明提供一种CD13靶向肽NGR和一种融合蛋白NGR-TNFα，以及所述靶向肽NGR和融合蛋白NGR-TNFα在制备诊断或治疗肿瘤靶向药物或制剂中的应用。所述CD13靶向肽NGR和TNFα(Genbank编码：AAC03542.1)构成NGR-TNFα融合蛋白。所述NGR-TNFα融合蛋白的基因全长507，编码168个氨基酸。
本发明的设计思路为：首先通过常规组织化学染色方法设计筛选与CD13具有良好结合能力的NGR肽，通过基因重组的方法将所述NGR肽与人TNFα融合获得融合蛋白NGR-TNFα，并在大肠杆菌中实现所述融合蛋白NGR-TNFα的高表达。再通过一系列的方法进行纯化获得纯度＞95％(HPLC分析和SDS-PAGE分析)的NGR-TNFα，并通过药效和药理毒理的研究，检测所述NGR-hTNFα的生物学活性和抗肿瘤作用。
为了达到上述目的，本发明采用以下方法，包括：
本发明第一方面提供了一种CD13的NGR靶向肽，所述NGR靶向肽的氨基酸序列为：CNGRVSTNGRC。
本发明第二方面提供一种融合蛋白NGR-TNFα，所述NGR靶向肽和TNFα的融合蛋白。
优选的，所述融合蛋白NGR-TNFα的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明第三方面提供一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码所述融合蛋白NGR-TNFα。
优选的，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明第四方面提供了所述融合蛋白NGR-TNFα的制备方法，具体步骤如下：
A.按照分子克隆技术将编码NGR-TNFα的多核苷酸克隆入表达载体构建获得重组表达载体；
B.将步骤A获得的重组表达载体转化入宿主细胞，并诱导宿主细胞表达所述融合蛋白NGR-TNFα；
C.表达产物的分离纯化。
优选的，步骤B中所述宿主细胞为大肠杆菌。
本发明第五方面提供了所述的NGR靶向肽在制备诊断或治疗肿瘤靶向药物或制剂中的应用。
本发明第六方面提供了所述的融合蛋白NGR-TNFα在制备诊断或治疗肿瘤靶向药物或制剂中的应用。
附图说明
图1所述融合蛋白NGR-TNFα在大肠杆菌中的表达结果
图2纯化的所述融合蛋白NGR-TNFα的SDS-PAGE图
图3所述融合蛋白NGR-TNFα与肿瘤新生血管的结合图
图4所述NGR-TNFα抑制人胰腺癌生长对照图
图5所述NGR-TNFα抑制人肝癌生长对照图
图6所述NGR-TNFα抑制人结肠癌生长对照图
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。
实施例1：
通过常规组织化学染色方法设计筛选与CD13具有良好结合能力的NGR肽：
(1)人工化学合成下列C端标记有生物素的多肽(N端→C端顺序)：
CNGRVSTNGRC(SEQ ID NO：1)、CNGRNGRC(SEQ ID NO：4)、CNGRVSTC(SEQ ID NO：5)、CNGRNGRNGRC(SEQ ID NO：6)、CNGRVSTNGRVSTNGRC(SEQ ID NO：7)；
(2)通过常规组织化学染色方法进行筛选：将上述多肽分别以PBS稀释至1000pM、100pM、10pM、1pM和0.1pM，各样品(多肽稀释物)与人肝细胞癌石蜡组织切片(经常规预处理)室温保湿孵育30分钟；用PBS缓冲液(磷酸缓冲液)清洗；再加入稀释的HRP标记的SA(SA-HRP)室温孵育15分钟；用PBS缓冲液清洗；再加入DAB(二氨基联苯胺)溶液孵育15分钟；用PBS缓冲液清洗复染后树脂封片；
(3)显微镜下观察各个多肽稀释物对应切片的染色情况，以显色强和稀释终浓度低的多肽为目标，各多肽人肝细胞癌染色情况如表1所示：
表1各多肽在不同浓度下与肿瘤新生血管的结果情况
| 多肽序列 | 1000nM | 100nM | 10nM | 1nM | 0.1nM |
| CNGRVSTNGRC | +++ | +++ | ++ | ± | - |
| CNGRNGRC | + | + | ± | - | - |
| CNGRVSTC | ++ | ++ | + | ± | - |
| CNGRNGRNGRC | + | + | - | - | - |
| CNGRVSTNGRVSTNGRC | +++ | ++ | + | ± | - |
注：+++表示染色强阳性；++表示染色中等强度阳性；+表示染色阳性；
±表示染色弱阳性；-表示染色阴性
如表1所述，多肽CNGRVSTNGRC与人肝细胞癌的染色最强，染色所需的多肽浓度最低(＜1.0nM)。进一步观察后确认，染色部位为肝细胞癌内血管内皮细胞。
实施例2：
NGR-TNFα融合蛋白在大肠杆菌中的表达与检测：
(1)重组表达载体的构建：
(2)按照常规分子克隆技术进行。由所述CD13靶向肽NGR和TNFα构成。本发明所提供的NGR-TNFα基因全长507，编码168个氨基酸，其基因序列如SEQ ID NO：2所示。对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
(3)所述NGR-TNFα融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达：
(4)A.化学合成方法获得目的基因；
B.构建重组表达载体：将表达质粒pBV220，用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切，酶切后在连接酶作用下连接入载体pBV220。连接反应体系为：
C.获得含重组表达质粒的表达菌种：将所述连接载体产物转化大肠杆菌，根据重组载体的标志(抗Amp)作筛选，挑取单斑。
D.诱导表达：构建的工程菌在LB培养基中，1∶100接种后30℃震荡培养6小时后，在42℃震荡培养4小时，离心收获菌体，超声裂解菌体，离心，取上层清液。通过SDS-PAGE检测NGR-TNFα融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达，结果如图1所示。图1中：1.Marker；2.TNFα对照；3.未诱导对照；4.诱导6个小时；5.诱导5个小时；6.诱导4小时；7.诱导5小时；8.诱导6小时；9.未诱导对照。
如图1所示，NGR-TNFα融合蛋白在大肠杆菌中于42℃诱导4-6小时可以实现高表达。
实施例3：
所述NGR-TNFα融合蛋白的纯化：
按照常规方法进行，过程为：阳离子交换柱层析；硫酸铵盐析；疏水柱层析；阴离子交换柱层析。简要实验步骤如下：
A.诱导表达NGR-TNFα的工程菌；
B.将步骤A所得工程菌冰浴下超声破碎，离心，待其沉淀后取上清；
C.将步骤B所得上清液以10mMPB(pH6.0)稀释10倍，所得稀释液用阳离子交换柱层析纯化；
D.将步骤C所得纯化物加入50％硫酸铵中沉淀(4℃，过夜)；
E.将步骤D所得溶液离心，并取沉淀，所得沉淀加入2M硫酸铵中溶解；
F.将步骤E所得硫酸铵溶液通过疏水柱层析纯化；
G.将步骤F所得纯化物以10mMPB(pH8.5)稀释10倍，所得稀释液通过阴离子离子交换柱层析既得最终纯化物。
最终纯化的所述NGR-TNFα的SDS-PAGE结果如图2所示，所述NGR-TNFα的纯度＞95％。
实施例4：
NGR-TNFα的活性检测(对照样为TNFα)：
在96孔细胞培养板上考察样品在不同浓度下对L929细胞的杀伤作用来评价所述NGR-TNFα的生物学活性。结果如表2所示：
表2不同浓度rhTNFα和所述NGR-TNFα对L929细胞的杀伤作用
如表2所述，作为对照的rhTNFα(标示比活性＝2.4*E8IU/mg)杀伤L929细胞的IC50为31.97pg/ml，而NGR-TNFα为38.75pg/ml，计算出NGR-TNFα的比活性是rhTNFα的82.50％，表明NGR-TNFα很好地保留了rhTNFα的活性。
实施例5：
所述NGR-TNFα的NGR靶向肽与肿瘤新生血管的亲和力的检测：
采用组织化学染色方法进行。以PBS分别稀释所述NGR-TNF和rhTNFα至1000、100、10、1nM，如前所述与人肝细胞癌石蜡切片室温保湿孵育30分钟；用PBS缓冲液清洗；加入稀释的小鼠抗人TNFα；室温孵育1小时；用PBS缓冲液清洗；加入HRP标记的羊抗小鼠IgG，室温孵育30分钟；用PBS缓冲液清洗；加入DAB溶液孵育15分钟；用PBS缓冲液清洗复染后树脂封片；在显微镜下观察各个样品稀释物对应切片的染色情况，结果如表3所示：
表3不同浓度的所述NGR-TNFα与人肝细胞癌内新生血管的结合
| 样品 | 1000nM | 100nM | 10nM | 1nM |
| NGR-TNFα | +++ | + | ± | - |
| rhTNFα | - | - | - | - |
注：+++表示染色强阳性；+表示染色阳性；
±表示染色弱阳性；-表示染色阴性
如表3所述，所述NGR-TNFα在100nM浓度时，其与肿瘤新生血管的结合能被检测出来(如图3所示，NGR-TNFα的浓度为100nM)，而rhTNFα在1-1000nM范围内与肿瘤新生血管的结合不能被检测出来，这表明TNFα经过所述NGR修饰，大大增强了与肿瘤新生血管(内皮细胞)的结合能力和特异性。
实施例6：
所述NGR-TNFα对人肝细胞癌、人结肠癌和人胰腺癌在裸鼠体内生长的抑制作用：
采用常规的裸鼠移植瘤抑制试验进行。简要步骤如下：
对6周龄的Balb/c裸鼠进行腋下皮下接种肿瘤细胞5*10E6/鼠；10天后测定所述裸鼠肿瘤体积，并将所述裸鼠随机分成4组；对各组以2次/周的频率分别给予生理盐水、100pg/m2NGR-TNFα、500pg/m2NGR-TNFα和500pg/m2rhTNFα，并以2次/周的频率测定肿瘤体积。
所述NGR-TNFα对人胰腺细胞癌、人肝癌和人结肠癌的抑制作用检测结果分别如图4、图5和图6所示。分析后发现所述NGR-TNFα在100pg/m2剂量下即显效，对人肝细胞癌、人结肠癌和人胰腺癌的抑瘤率分别为33.0％、39.7％和47.6％；所述NGR-TNFα在500pg/m2剂量下，抑瘤率分别为67.4％、67.0％和71.6％，结果如表4所示：
表4所述NGR-TNFα对恶性肿瘤生长的抑制作用
实施例7：
所述NGR-TNFα对人肝细胞癌、人结肠癌和人胰腺癌内新生血管的破坏作用的检测：
采用如实施例6所述的常规的裸鼠移植瘤试验进行。试验终点分析所述NGR-TNFα治疗后肿瘤内新生血管的密度(MVD)。其结果如表5所示：
表5所述NGR-TNFα对癌细胞新生血管生长的抑制作用
如表5所示，所述NGR-TNFα可以显著抑制肿瘤内新生血管的生长，100pg/m2和500pg/m2的NGR-TNFα对3种肿瘤内的血管的平均抑制率分别达到66.3％和77.8％。说明所述NGR-TNFα抑制肿瘤生长的一个重要机制是通过破坏肿瘤内的新生血管得以实现的。
本发明人通过常规组织化学染色方法设计筛选与CD13具有良好结合能力的NGR肽，通过基因重组的方法将所述NGR肽与人TNFα融合获得融合蛋白NGR-TNFα。再通过大量实验分析后证明，所述NGR-TNFα可以以抑制肿瘤内新生血管生长的方式抑制肿瘤细胞生长，起到抗肿瘤的效果。
Claims (8)
1.一种CD13的NGR靶向肽，其特征在于，所述NGR靶向肽的氨基酸序列为：CNGRVSTNGRC。
2.一种融合蛋白NGR-TNFα，为权利要求1所述NGR靶向肽和TNFα的融合蛋白。
3.如权利要求2所述融合蛋白NGR-TNFα，其特征在于，所述NGR-TNFα的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求2所述融合蛋白NGR-TNFα。
5.如权利要求4所述多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO:2所示。
6.一种如权利要求2所述融合蛋白NGR-TNFα的制备方法，具体步骤如下：
A.按照分子克隆技术将编码NGR-TNFα的多核苷酸SEQ ID NO:2克隆入表达载体构建获得重组表达载体；
B.将步骤A获得的重组表达载体转化入宿主细胞，并诱导宿主细胞表达所述融合蛋白NGR-TNFα；
C.表达产物的分离纯化。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤B中所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.如权利要求2所述的融合蛋白NGR-TNFα在制备诊断或治疗肿瘤靶向药物或制剂中的应用。
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