CN112079900B - 一种环状ngr多肽、放射性核素标记分子探针及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环状NGR多肽、放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针及其应用，所述分子探针是以放射性核素标记该环状NGR多肽得到；或先将环状NGR多肽与双功能螯合基团偶联，再以放射性核素对其进行标记得到。该放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针可以用于制备诊断氨肽酶N(CD13)高表达肿瘤的显像剂或用于制备生物靶向治疗氨肽酶N(CD13)高表达肿瘤的药物。其能够在体内准确定位整合素受体，通过核医学显像，实现肿瘤分子影像目的，能够显著提高其体内的靶向性和滞留时间；并可作为放射性治疗核素的载体，准确定位氨肽酶N(CD13)肿瘤，实现对肿瘤的治疗目的。所述环状NGR多肽的结构式为：

Description

一种环状NGR多肽、放射性核素标记分子探针及其应用

技术领域

本发明属于氨肽酶靶向多肽及放射性药物标记分子探针和核医学技术领域，具体涉及一种环状NGR多肽、放射性核素标记分子探针及其应用。

背景技术

氨肽酶N(CD13)是一类被称为肿瘤标记物的金属蛋白酶，其不仅在肿瘤血管迅速增长的部分过度表达，同时也在乳腺癌、肺癌、肝癌等恶性肿瘤膜细胞膜表面有高表达，在肿瘤侵袭转移及新生血管生成中发挥重要作用。

NGR(由天门冬酸-甘氨酸-精氨酸组成的三肽)能与氨肽酶N(CD13)特异性结合。NGR-hTNF(重组人肿瘤坏死因子)结合的肿瘤新生血管靶向治疗药物已经完成三期临床，并向EMA提出申请。环状NGR(GG-CNGRC)特异性好于直链NGR(GNGRGGYC)肽。

含有NGR序列的环状肽c(NGR)与肿瘤坏死因子(TNF)结合可以将治疗效果提高12-15倍。但由于NGR环状衍生物c(NGR)结构过小，作为放射性药物在体内会被肾脏快速代谢，特别当其被用于长半衰期的治疗型放射性核素(如¹⁷⁷Lu)结合时，其体内快速代谢的缺点，将无法实现肿瘤治疗且对肾脏等代谢器官带来极大的副作用。

因此，如何对环状NGR—c(NGR)多肽结构进行修饰以提高其体内的靶向性和滞留时间对于提高治疗性核素在肿瘤中的滞留和聚集，成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种环状NGR多肽、放射性核素标记分子探针及其应用。本发明提供了一种环状NGR多肽及含有该多肽结构的一种新型的氨肽酶N(CD13)特异性受体结合的分子探针结构，通过放射性核素标记后，可以在体内准确定位整合素受体，通过核医学显像，实现肿瘤分子影像目的。本发明所提出的新型分子探针还可以作为放射性治疗核素的载体，准确定位氨肽酶N(CD13)肿瘤，实现对肿瘤的治疗目的。

本发明的目的之一是提供一种环状NGR多肽，环状NGR多肽记为KGCYGGC*NGRC*，其分子结构如下式<Ⅰ>所示：

本发明的目的之二是提供一种放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针，该分子探针是以放射性核素标记如上的环状NGR多肽得到；或先将环状NGR多肽与双功能螯合基团偶联，再以放射性核素对其进行标记得到。

进一步的是，所述放射性核素选自¹³¹I、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁸Re、¹⁸F[AlF]、⁶⁸Ga或^99mTc。

本发明的目的之三是提供一种放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针的应用，所述应用包括上述分子探针在制备诊断氨肽酶N(CD13)高表达肿瘤的显像剂中的应用；或上述分子探针在制备生物靶向治疗氨肽酶N(CD13)高表达肿瘤的药物中的应用。

本发明的目的之四是提供一种用于诊断氨肽酶N(CD13)高表达肿瘤的显像剂，其含有本发明的上述放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针。

本发明的目的之五是提供一种用于生物靶向治疗氨肽酶N(CD13)高表达肿瘤的药物，其含有本发明的上述放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针。

本发明还提供了上述放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针的制备方法，其制备方法包括以下步骤：

(1)配制氨肽酶靶向多肽溶液1000μg/mL；Iodogen溶液500μg/mL；放射性核素10～1000mCi/mL；

(2)取10μL～50μL的氨肽酶靶向多肽溶液加入到含有Iodogen涂层的离心管中，再加入放射性核素0.5～10mCi，补充超纯水至反应总体积至100μL，振荡器上反应10～30min；然后，通过HPLC对反应进行纯化，纯化后放化纯度>95％，化学纯度>95％，即得。

具体的，在步骤(2)中所述含有Iodogen涂层的离心管的制作方法为：取100μL的Iodogen溶液置于1.5mL塑料离心管中，真空泵<10mBar抽20min，离心管底部形成Iodogen膜。

具体的，所述放射性核素选自¹³¹I或¹²⁵I。

本发明还提供了上述放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针的另一种制备方法，其包括以下步骤：

(1)取氨肽酶靶向多肽溶液10μmol溶于80μL N,N-二甲基甲酰胺中，加入双功能螯合基团11μmol、二异丙基乙胺30μmol进行偶联，室温搅拌反应1～2h，使用高效液相色谱仪(HPLC)对所得产物进行分离纯化，冻干得到偶联产物，通过高效液相色谱仪(HPLC)检定所得偶联产物的化学纯度>95％；

(2)配制步骤(1)所得偶联产物的溶液2μmol/mL；醋酸钠缓冲液0.25M,pH＝5.5；放射性核素10～1000mCi/mL；

(3)取40μl的醋酸钠缓冲液，分别依次加入10μL～20μL偶联产物的溶液，0.5～10mCi放射性核素，置于85℃的水浴锅中加热，反应30-60min即得到偶联产物-放射性核素粗产物溶液，通过HPLC对粗产物进行纯化，纯化后放化纯度>95％，化学纯度>95％，即得。

具体的，步骤(1)中所述双功能螯合基团为Mal-DOTA、Mal-NOTA、Mal-DTPA或Mal-Hynic，所述偶联产物分别记为：DOTA-I、NOTA-I、DTPA-I或Hynic-I。

具体的，上述制备方法中步骤(2)所述放射性核素选自¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁸Re、¹⁸F[AlF]、⁶⁸Ga或^99mTc。

本发明的上述技术方案的技术构思是：通过在c(NGR)的末端进行修饰，延长末端支链，并在末端支链上设计带有多个悬挂基团可用于后续功能基团及标记配体修饰。该策略被证明能够延长放射性标记的NGR衍生物在生物体内的生物半衰期，降低其被肾脏代谢的速度，提高放射性治疗核素在肿瘤的聚集，提高肿瘤治疗效果。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供了一种新型的氨肽酶N(CD13)特异性受体结合的分子探针结构；

(2)通过对本发明提供的新型的氨肽酶N(CD13)分子探针结构进行放射性核素标记后，可以在体内准确定位整合素受体，通过核医学显像，实现肿瘤分子影像目的，能够显著提高其体内的靶向性和滞留时间；

(3)本发明所提供的分子探针结构可以作为放射性治疗核素的载体，准确定位氨肽酶N(CD13)肿瘤，实现对肿瘤的治疗目的。

附图说明

图1为实施例1所示的DOTA-I环状多肽化学结构式；

图2为实施例1所示的DOTA-I环状多肽的质谱图；

图3为实施例2所示的¹⁷⁷Lu-DOTA-I的iTLC图谱；

图4为实施例3所示的¹⁷⁷Lu-DOTA-I的体外稳定性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行具体描述，有必要指出的是，以下实施例仅仅用于对本发明进行解释和说明，并不用于限定本发明。本领域技术人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

一种DOTA-NGR环状多肽DOTA-I的合成

其化学结构式如图1所示：

其制备方法为：取NGR多肽I溶液10μmol，溶于80μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入双功能螯合基团11μmol(Mal-DOTA)、二异丙基乙胺30μmol进行偶联，室温搅拌反应1～2h，使用高效液相色谱仪(HPLC)对所得产物进行分离纯化，冻干得到偶联产物，通过高效液相色谱仪(HPLC)检定所得偶联产物的化学纯度>95％，记为DOTA-I。

上述DOTA-I多肽的质谱图如图2所示。

实施例2

DOTA-I的¹⁷⁷Lu放射性标记

实验方法：

1)将DOTA-I溶于乙酸钠(NaOAc)缓冲液(0.25M，pH＝5.5)中，配制成浓度为2nmol/μL的溶液；

2)在铅罐中取已知活度(100μCi/μL，3.7MBq/μL)的¹⁷⁷LuCl₃溶液400μCi(14.8MBq)，与2μL的DOTA-I溶液充分混合，并加入20μl NaOAc缓冲液调节pH值，随后将反应混合物置入到80℃的金属浴中处理30分钟。

3)采用瞬时硅胶薄层色谱法(Instantaneous silica thin layerchromatography,iTLC-SG)确定标记物的放射化学纯度。使用0.1M的柠檬酸溶液(pH＝5.5)作为展开剂进行展开，用放射性色谱扫描仪(TLC)扫描，计算标记物的放射性标记率。

¹⁷⁷Lu-DOTA-I都保留在光谱的原点位置(Rf＝0)，其中游离¹⁷⁷Lu与展开剂一起移动到前缘(Rf＝0.62)，放射性标记率均超过95％。

上述¹⁷⁷Lu-DOTA-I分子探针的放射性iTLC图谱如图3所示。

实施例3

¹⁷⁷Lu-DOTA-I分子探针的体外稳定性试验

试验方法：取10μL(30μCi,1.11MBq)¹⁷⁷Lu标记的DOTA-I样品，将其与290μL的FBS或生理盐水均匀混合后，放置在37℃、300rpm的金属浴中摇动孵育，分别于1、4、24、48和72小时用iTLC-SG法检测标记物的放射化学纯度以评估药物前体的体外稳定性。

上述¹⁷⁷Lu-DOTA-I分子探针体外稳定性结果如图4所示。结果表明该分子探针在生理盐水和FBS溶液中24小时内稳定性均大于90％，其在生理盐水中72小时的稳定性依然能大于90％。而该分子探针在FBS溶液中72小时稳定性大于65％。考虑到实际使用时体内环境中血清(FBS)含量多为10％左右，该探针分子的稳定性完全能达到应用要求。

实施例4

¹⁷⁷Lu-DOTA-I分子探针的体内生物学分布试验

试验方法：A549、HT1080和H1688肿瘤荷瘤鼠每组2只，每只由尾静脉注射¹⁷⁷Lu-DOTA-I药物前体(3.7MBq，100μL)，对照组尾静脉注射等体积的生理盐水。注射24小时后将裸鼠脱颈处死并解剖，收集心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胰、胃、肠道、骨、肌肉组织、肿瘤以及血液等组织和器官，称重后用γ计数器检测其CPM值，并计算每克组织百分注射剂量率(Percentage activity of injection dose pergram of tissue,％ID/g)值，用均数±标准差表示。

¹⁷⁷Lu-DOTA-I分子探针的体内分布结果如表1所示。该探针的主要代谢器官为肝、脾、肾，其在肿瘤组织上具有较高的摄取，在骨、血液等组织上几乎不滞留，肿瘤与肌肉比值高达6-12倍，其体内靶向效果较好。

表1 ¹⁷⁷Lu-DOTA-I分子探针的体内分布

除上述实施例示例的环状多肽DOTA-I和¹⁷⁷Lu-DOTA-I分子探针外，本发明还可采用双功能螯合基团Mal-NOTA、Mal-DTPA和Mal-Hynic分别制备得到环状多肽DOTA-I、NOTA-I、DTPA-I和Hynic-I以及相应的分子探针，其制备方法与上述实施例相同。可以预见的是，上述分子探针同样具有与上述实施例中¹⁷⁷Lu-DOTA-I分子探针相似的效果。

Claims (9)

1.一种环状NGR多肽，其特征在于，所述环状NGR多肽记为KGCYGGC*NGRC*，其分子结构如下式<Ⅰ>所示：

2.一种放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针，其特征在于，所述分子探针是以放射性核素标记权利要求1所述的环状NGR多肽得到；或先将权利要求1所述的环状NGR多肽与双功能螯合基团偶联，再以放射性核素对其进行标记得到，所述双功能螯合基团为Mal-DOTA、Mal-NOTA、Mal-DTPA或Mal-Hynic。

3.根据权利要求2所述的放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针，其特征在于，所述放射性核素选自¹³¹I、¹²⁵I、¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁸Re、¹⁸F[AlF]、⁶⁸Ga或^99mTc。

4.一种根据权利要求2或3所述的放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针的应用，其特征在于，所述应用包括该分子探针在制备诊断氨肽酶N(CD13)高表达肿瘤的显像剂中的应用。

5.一种用于诊断氨肽酶N(CD13)高表达肿瘤的显像剂，其特征在于，含有权利要求2或3所述的放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针。

6.一种根据权利要求2或3所述的放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)配制由权利要求1所述的环状NGR多肽得到的氨肽酶靶向多肽溶液1000μg/mL；Idogen溶液500μg/mL；放射性核素10～1000mCi/mL；

(2)取10μL～50μL步骤(1)配制的氨肽酶靶向多肽溶液加入到含有Idogen涂层的离心管中，再加入放射性核素0.5～10mCi，补充超纯水至反应总体积至100μL，振荡器上反应10～30min；然后，通过HPLC对反应进行纯化，纯化后放化纯度>95％，化学纯度>95％，即得；其中，所述含有Idogen涂层的离心管的制作方法为：取100μL步骤(1)配制的Idogen溶液置于1.5mL塑料离心管中，真空泵<10mBar抽20min，离心管底部形成Idogen膜。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述放射性核素选自¹³¹I或¹²⁵I。

8.一种根据权利要求2或3所述的放射性核素标记的氨肽酶靶向分子探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)取由权利要求1所述的环状NGR多肽配制的氨肽酶靶向多肽溶液10μmol溶于80μLN,N-二甲基甲酰胺中，加入双功能螯合基团11μmol、二异丙基乙胺30μmol进行偶联，室温搅拌反应1～2h，使用高效液相色谱仪(HPLC)对所得产物进行分离纯化，冻干得到偶联产物，通过高效液相色谱仪(HPLC)检定所得偶联产物的化学纯度>95％；其中，所述双功能螯合基团为Mal-DOTA、Mal-NOTA、Mal-DTPA或Mal-Hynic，其偶联产物分别记为：DOTA-I、NOTA-I、DTPA-I或Hynic-I；

(2)配制步骤(1)所得偶联产物的溶液2μmol/mL；醋酸钠缓冲液0.25M,pH＝5.5；放射性核素10～1000mCi/mL；

(3)取40μl的醋酸钠缓冲液，分别依次加入10μL～20μL偶联产物的溶液，0.5～10mCi放射性核素，置于85℃的水浴锅中加热，反应30-60min即得到偶联产物-放射性核素粗产物溶液，通过HPLC对粗产物进行纯化，纯化后放化纯度>95％，化学纯度>95％，即得。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述放射性核素选自¹¹¹In、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁸Re、¹⁸F[AlF]、⁶⁸Ga或^99mTc。

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