CN105294841A - 基于CendR内化增效序列的放射性核素标记肿瘤靶向分子影像探针及其合成方法与应用 - Google Patents

基于CendR内化增效序列的放射性核素标记肿瘤靶向分子影像探针及其合成方法与应用 Download PDF

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康飞
汪静
赵明玄
张明如
李国权
马温惠
梁万胜
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Abstract

本发明涉及基于CendR内化增效序列的放射性核素标记肿瘤靶向分子影像探针及其合成方法与应用。现有NGR等多肽类小分子探针在肿瘤的摄取水平较低，滞留时间较短，较大影响了肿瘤显影的信噪比和显像的时间窗宽度，不利于肿瘤早期探测的灵敏度。本发明提供了基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR单体及其二聚体，可作为针对肿瘤新生血管标志物CD13的肿瘤靶向放射性核素标记探针，用于PET/CT或SPECT/CT的临床实践，在肿瘤中的摄取水平和滞留时间都可得到改善，从而提高多肽类NGR肿瘤靶向性探针的显像效果。

Description

基于CendR内化增效序列的放射性核素标记肿瘤靶向分子影像探针及其合成方法与应用
技术领域
本发明属于医学分子影像探针技术领域，具体涉及基于CendR内化增效序列的放射性核素标记肿瘤靶向分子影像探针及其合成方法与应用。
背景技术
肿瘤靶向分子影像探针是实现肿瘤早期诊断、精确分期、疗效监测的关键。放射性核素标记的肿瘤靶向分子影像探针可用于PET/CT或SPECT/CT临床实践，是目前生物安全性最高、灵敏度最好、临床应用最成熟的一类分子影像探针。多肽类放射性核素标记探针因其结构可塑性强、生物相容性好而成为了临床研究的热点。其中，靶向肿瘤新生血管的多肽类探针是最具潜力的一类。
然而，在实验中我们发现，NGR等多肽类小分子探针由于其分子量小因而机体排泄快，且其靶点数量少、与靶点亲和力有限，造成了多肽类探针在肿瘤的摄取水平较低，且滞留时间较短，较大影响了肿瘤显影的信噪比和显像的时间窗宽度，不利于肿瘤早期探测的灵敏度。
最新研究表明，CendR多肽序列可特异性结合肿瘤新生血管的NRP-1受体，显著提高肿瘤组织对外源分子的通透性，提升多肽的肿瘤靶向性和滞留时间。另一类基于RGD序列的肿瘤新生血管探针在添加了CendR序列后，也分别在光学和磁共振显像的动物实验中取得了更好的肿瘤靶向效果。受此启发，本课题组在NGR原有基础上对其加入了CendR序列，提出新的iNGR（internalizedNGR）放射性核素标记肿瘤靶向分子影像探针，并在动物模型中验证了该类新探针的显像效果。
发明内容
本发明的目的是提供了基于CendR内化增效序列的放射性核素标记肿瘤靶向分子影像探针及其合成方法与应用，提高传统NGR类探针在肿瘤中的摄取水平和滞留时间，以改善其显像效果。
本发明所采用的技术方案为：
基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR单体，其特征在于：
具有以下结构：
所述的基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR单体的合成方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
将4.2mgp-SCN-Bn-DOTA溶于25μL二甲亚砜中，加入5.0mgG3-iNGR多肽单体，与溶解20μLN,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液200μL，混合反应1h后，加入含4%乙酸的水溶液500μL中止反应，经分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集反应液并冻干，获得产物为DOTA-iNGR；
所述G3-iNGR多肽单体的氨基酸序列为GGGCRNGRGPDC。
所述的基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR单体的应用，其特征在于：
所述DOTA-iNGR单体作为针对肿瘤新生血管标志物CD13的肿瘤靶向放射性核素标记探针的应用。
基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR二聚体，其特征在于：
具有以下结构：
所述的基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR二聚体的合成方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：合成Boc-E(G3-iNGR)2：
将2.05mg由Boc保护的谷氨酸活化酯Boc-E(OSu)2与12.0mgG3-iNGR多肽单体混合后溶于N,N-二甲基甲酰胺，调节pH至8，室温搅拌8-12小时，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为Boc-E(G3-iNGR)2；
所述G3-iNGR多肽单体的氨基酸序列为GGGCNGRC，4’及8’两个半胱氨酸缩合成环；
步骤二：合成E(G3-iNGR)2：
将Boc-E(G3-iNGR)2溶于0.5mL、体积比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95:2.5:2.5的溶液中，室温搅拌1小时，蒸干溶剂，残渣用0.5mL水重新溶解，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为E(G3-iNGR)2；
步骤三：合成DOTA-E(G3-iNGR)2：
将0.446mgp-SCN-Bn-DOTA溶于25μL二甲亚砜中加入1.2mgE(G3-iNGR)2，与溶解20μLN,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液200μL，混合反应1h后，加入4%乙酸水溶液500μL中止反应，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为DOTA-iNGR2。
所述的基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR二聚体的应用，其特征在于：
所述DOTA-iNGR二聚体作为针对肿瘤新生血管标志物CD13的肿瘤靶向放射性核素标记探针的应用。
本发明具有以下优点：
1、本发明DOTA-iNGR多肽探针由肿瘤CD13靶向多肽NGR（靶向元件）与C端CendR序列（增效元件）以及标记显像核素的螯合剂DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸）组成。在NGR单体中加入CendR基序，该基序可在肿瘤血管NRP-1分子的介导下，引导核素标记的NGR进入肿瘤组织内部，实现肿瘤内化，较之传统NGR类探针，其在肿瘤中的摄取水平和滞留时间都可得到改善，从而提高多肽类NGR肿瘤靶向性探针的显像效果。二聚体分子量较大、结合位点较多，具有比单体更优的肿瘤靶向效果。
2、本发明中的放射性核素标记螯合剂DOTA，不仅可标记68Ga、64Cu等多种正电子显像类放射性金属核素及177Lu、90Y等治疗类放射性金属核素；较之于传统的18F等化合标记法，该策略标记率高、反应简便、方法成熟、产率稳定、成本低廉。
附图说明
图1为DOTA-iNGR单体结构图
图2为DOTA-iNGR二聚体结构图。
图3为CendR基序介导iNGR类探针进入肿瘤细胞的原理示意图。
图4为iNGR及传统NGR类探针在同一只动物肿瘤活体模型的PET显像效果对比图及量化结果。左侧虚线圈内为CD13阳性肿瘤，右侧为CD13阴性肿瘤。
图5为同一动物肿瘤活体模型的大剂量非标记CD13抑制显像结果，以证实该探针的CD13靶向性。
图6为同一动物肿瘤活体模型的NRP-1抗体抑制显像结果，以证实该探针的增效作用与NRP-1有关。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明涉及一种新型的放射性核素标记肿瘤靶向分子影像探针，包括基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR单体及其二聚体。
所述DOTA-iNGR单体具有以下结构：
上述DOTA-iNGR单体的合成方法，由以下步骤实现：
将4.2mgp-SCN-Bn-DOTA溶于25μL二甲亚砜中，加入5.0mgG3-iNGR多肽单体，与溶解20μLN,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液200μL，混合反应1h后，加入含4%乙酸的水溶液500μL中止反应，经分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集反应液并冻干，获得产物为DOTA-iNGR。所述G3-iNGR多肽单体的氨基酸序列为GGGCRNGRGPDC。
所述DOTA-iNGR二聚体具有以下结构：
上述DOTA-iNGR二聚体的合成方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：合成Boc-E(G3-iNGR)2：
将2.05mg由Boc保护的谷氨酸活化酯Boc-E(OSu)2与12.0mgG3-iNGR多肽单体混合后溶于N,N-二甲基甲酰胺，调节pH至8，室温搅拌8-12小时，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为Boc-E(G3-iNGR)2；
所述G3-iNGR多肽单体的氨基酸序列为GGGCNGRC，4’及8’两个半胱氨酸缩合成环；
步骤二：合成E(G3-iNGR)2：
将Boc-E(G3-iNGR)2溶于0.5mL、体积比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95:2.5:2.5的溶液中，室温搅拌1小时，蒸干溶剂，残渣用0.5mL水重新溶解，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为E(G3-iNGR)2；
步骤三：合成DOTA-E(G3-iNGR)2：
将0.446mgp-SCN-Bn-DOTA溶于25μL二甲亚砜中加入1.2mgE(G3-iNGR)2，与溶解20μLN,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液200μL，混合反应1h后，加入4%乙酸水溶液500μL中止反应，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为DOTA-iNGR2。
所述DOTA-iNGR单体及其二聚体均可作为针对肿瘤新生血管标志物CD13的肿瘤靶向放射性核素标记探针，用于PET/CT或SPECT/CT的临床实践。
以下内容，以标记68Ga为例描述DOTA-iNGR的放射性核素标记过程：
DOTA-iNGR用去离子水溶解成1μg/μL。取2μLDOTA-iNGR水溶液加入至200μL新鲜68GaCl3淋洗液（92.5-129.5MBq）中，1.25M醋酸钠调pH值至4.0，反应温,90-100℃、反应时间10min。室温冷却后过0.22μm无菌液体滤膜后收集。
产物标记率及放射化学纯度的测定步骤：
a.高效液相色谱法（HPLC）。流动相A：含0.05%三氟乙酸的去离子水；流动相B：含0.05%三氟乙酸的乙腈。选择210nm紫外检测器，色谱柱为C18分析柱，采用梯度洗脱：0-3min：5-5%B相；3-20min：5-65%B相，流速1mL/min。
b.薄层色谱法（TLC）。采用快速硅胶层析纸作为固定相，展开剂为丙酮:醋酸钠（1M）=1:1。
（3）肿瘤靶向显像或治疗应用：
以下内容，以移植CD13阳性的HT-1080肿瘤及CD13阴性的HT29肿瘤的裸鼠动物模型PET显像为例，介绍放射性核素标记的DOTA-iNGR用于肿瘤靶向显像的过程。DOTA-iNGR2的显像应用步骤与之相同。
取对数生长期的HT-1080及HT-29细胞2×106分别经皮下注射至裸鼠两侧肩部建立荷瘤裸鼠模型，待瘤体长至0.5-1cm3大小时，通过尾静脉注射约7.4MBq(0.1mL)68Ga-DOTA-iNGR后60min用小动物正电子断层成像仪（MicroPET）采集10min静态图像。图像经迭代法重建。
本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

Claims (6)

1.基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR单体，其特征在于：
具有以下结构：
。
2.根据权利要求1所述的基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR单体的合成方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
将4.2mgp-SCN-Bn-DOTA溶于25μL二甲亚砜中，加入5.0mgG3-iNGR多肽单体，与溶解20μLN,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液200μL，混合反应1h后，加入含4%乙酸的水溶液500μL中止反应，经分离纯化，收集目标物的馏分，合并收集反应液并冻干，获得产物为DOTA-iNGR；
所述G3-iNGR多肽单体的氨基酸序列为GGGCRNGRGPDC。
3.根据权利要求1所述的基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR单体的应用，其特征在于：
所述DOTA-iNGR单体作为针对肿瘤新生血管标志物CD13的肿瘤靶向放射性核素标记探针的应用。
4.基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR二聚体，其特征在于：
具有以下结构：
。
5.根据权利要求4所述的基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR二聚体的合成方法，其特征在于：
由以下步骤实现：
步骤一：合成Boc-E(G3-iNGR)2：
将2.05mg由Boc保护的谷氨酸活化酯Boc-E(OSu)2与12.0mgG3-iNGR多肽单体混合后溶于N,N-二甲基甲酰胺，调节pH至8，室温搅拌8-12小时，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为Boc-E(G3-iNGR)2；
所述G3-iNGR多肽单体的氨基酸序列为GGGCNGRC，4’及8’两个半胱氨酸缩合成环；
步骤二：合成E(G3-iNGR)2：
将Boc-E(G3-iNGR)2溶于0.5mL、体积比为三氟乙酸:三异丙基硅烷:水=95:2.5:2.5的溶液中，室温搅拌1小时，蒸干溶剂，残渣用0.5mL水重新溶解，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为E(G3-iNGR)2；
步骤三：合成DOTA-E(G3-iNGR)2：
将0.446mgp-SCN-Bn-DOTA溶于25μL二甲亚砜中加入1.2mgE(G3-iNGR)2，与溶解20μLN,N-二异丙基乙胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液200μL，混合反应1h后，加入4%乙酸水溶液500μL中止反应，分离纯化后收集目标物的馏分，合并收集液并冻干，获得产物为DOTA-iNGR2。
6.根据权利要求4所述的基于CendR内化增效序列的DOTA-iNGR二聚体的应用，其特征在于：
所述DOTA-iNGR二聚体作为针对肿瘤新生血管标志物CD13的肿瘤靶向放射性核素标记探针的应用。
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