CN103041411A - 以磷脂酰丝氨酸为靶点的99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物及其标记技术和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种以磷脂酰丝氨酸为靶点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV,膜联蛋白AnnexinV 的羧基端连有半胱氨酸Cys,半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素99Tcm。可采用直接标记法对Cys-AnnexinV进行99Tcm标记,步骤包括:(1)取适量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亚锡化;(2)向步骤(1)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99TcmO4 -,混匀后放置,即形成99Tcm-Cys-AnnexinV。本发明所用标记方法更为简便实用,且能尽可能保持标记蛋白活性和生物功能,用于进行放射性核素显像,检测各种疾病中细胞凋亡发生的程度和范围,尤其是作为显像剂在检测细胞凋亡和血栓中的应用。
Description
技术领域
本发明属于放射性核素标记技术领域,具体涉及一种99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物及其标记技术和作为显像剂在急性心肌损伤、肿瘤疗效评价以及急性血栓探测方面的应用。
背景技术
细胞凋亡(apoptosis)是一种高度保守的细胞程序性死亡(PCD),在诸多生理和病理过程中起着重要的作用。过度凋亡会使组织功能丧失,如急性心肌梗死、慢性心力衰竭、移植排斥反应、中风、神经系统变性疾病等。相反,系统性红斑狼疮及类风湿关节炎以凋亡不充分为特征,使免疫细胞大量存活而不恰当地杀死和破坏正常组织,使组织脏器功能受损。凋亡抑制导致细胞过度增殖和肿瘤形成,许多化疗药物多是通过诱导凋亡来实现治疗目的的。
但目前常规的细胞凋亡检测方法还不能满足基础研究和临床实践的需要,已有的实验室检测手段只能从细胞形态学和生化改变方面进行体外的定性和定量分析,如电镜观察、流式细胞分析、DNA降解条带分析和相关蛋白表达水平检测等。在活体条件下观察细胞凋亡范围、时相和发展速度等,一直是研究的一大难题。特别是在心血管系统疾病的研究中,活体标本采集尤为困难,因此活体显像显得更为必要。
近年来,国内外已开展有关细胞凋亡放射性核素显像的研究,研究的关键是合成能与凋亡细胞特异结合的显像剂,且物理化学特性适于放射性核素标记,并具有血液清除快,靶器官显像清晰等特点。放射性核素标记磷脂结合蛋白V(Annexin V)是目前最受关注的细胞凋亡显像剂之一。
Annexin V是一种人体内源性蛋白,属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白家族,最早是从胎盘中分离出来,具有一些抗凝固及抗炎的作用,曾被作为一种抗凝剂研究。染色体定位分析显示,Annexin V是由位于人的第4条染色体4q26-q28上的Annexin V基因编码,含有319个氨基酸,包括个70-80氨基酸重复单元,分子量约为35kD。研究证实,Annexin V能与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸(PS)特异性结合,正常细胞的PS位于细胞膜内层,凋亡时表达在细胞膜外层,是细胞凋亡的特征性标志,Annexin V与PS的亲和力高达10-9mol/L。
Annexin V类显像剂的合成关键是放射性核素的标记,既要获得较高的放射化学纯度,同时又不能损伤Annexin V的结合活性。目前研究最成功的是99Tcm标记的Annexin V(99Tcm-Annexin V)。99Tcm具有优良的物理性质,且获取容易,价格低廉。
目前采用99Tcm标记Annexin V有多种方式:
1. 双功能鳌合剂法。使用双功能鳌合剂法选择连接剂非常重要,既要保证与99Tcm有很高的配位能力,又要保证不改变其原有生物活性。常用的有二硫二氮(N2S2)、乙二胺半胱氨酸(EC)、BTAP等,其中以肼基烟酰胺(Hynic)最为多见。目前,多数临床前研究采用Hynic为螯合剂进行99Tcm标记Annexin V,得到的99Tcm-Hynic-Annexin V比活度较高,放射性化学纯度大于90%,并且已经在凋亡动物模型中获得良好的评估,被认为是监控肿瘤治疗疗效潜在的有效的放射性药物。但双功能鳌合剂法过程比较复杂,对技术条件要求严格,制备成本高。
2. 直接还原标记法
直接还原标记法相对于双功能鳌合剂法更为简便、理想,以往的研究认为以SnCl2为还原剂、中性PH条件下,可得到标记率高(>95%)、稳定性好(>10h)的99Tcm-AnnexinV标记产物,且易于药盒化,但由于99Tcm与AnnexinV中的巯基相结合,会使AnnexinV的活性会受到影响,产生一些变性蛋白,使肝脏的放射性摄取增加。
3. 对Annexin V进行结构修饰
国外Tait JF等学者(Tait JF, Brown DS, Gibson DF, Blankenberg FG, Strauss HW. Development and characterization of annexin V mutants with endogenous chelation sites for 99mTc. Bioconjug Chem 2000;11:918–25)通过修饰Annexin V的结构,在Annexin V的N端延长了7个氨基酸(含一个或两个半胱氨酸残基)形成变异分子Annexin V116、117和118,三种蛋白可在大肠杆菌细胞质中表达并可纯化成同质体,与红细胞膜上的PS都有较高的亲和力。用在Annexin V上加肽序列的方法,使之形成了与99Tcm结合的内生螯合位点。以SnCl2为还原剂,葡庚糖酸盐(GH)为转换剂,三种蛋白可特异性结合99Tcm至少1850~3700MBq(50~100mCi),且标记后性质稳定,保持了与膜PS的亲和力。
发明内容
为克服已有技术的缺点,本发明的目的在于提供一种标记方法更为简便实用,且能尽可能保持标记蛋白活性和生物功能的标记化合物,用于进行放射性核素显像,检测各种疾病中细胞凋亡发生的程度和范围。
为达到上述目的,本发明的技术方案具体如下:
一种以磷脂酰丝氨酸为靶点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV,膜联蛋白AnnexinV 的羧基端连有半胱氨酸Cys,半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素99Tcm。
上述放射性药物为无色透明液体针剂。
本发明还提供了一种上述放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,采用直接标记法对Cys-Annexin V进行99Tcm标记,步骤包括:
(1)取适量的SnCl2加入Cys-Annexin V使蛋白亚锡化;
(2)向步骤(1)蛋白亚锡化后的Cys-Annexin V中加入99TcmO4 -,混匀后放置,即形成99Tcm-Cys-Annexin V。
上述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,可以具体为:
(1)取适量的SnCl2·2H2O,以浓度为0.05mol/L的HCl溶解,取已配制好的上述含SnCl2的100μL,总计亚锡量约25~30μg依次加入Cys-Annexin V 5~50μg后充分摇匀;
(2)向步骤(1)蛋白亚锡化后的Cys-Annexin V中加入99TcmO4 -0.8mL,10mg/mL维生素C 100μL,混匀后放置,即形成99Tcm-Cys-Annexin V。
本发明还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于检测心肌缺血损伤后心肌细胞凋亡即探测急性心肌损伤方面的用途。
本发明还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于化疗后检测肿瘤细胞凋亡即肿瘤化疗后疗效评价方面的用途。
本发明还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于探测活化血小板水平即检测急性血栓方面的用途。
本发明所述的99Tcm-Cys-AnnexinV显像剂采用了一种新的Annexin V衍生物Cys-Annexin V作为99Tcm标记的底物,首次采用直接标记法实现了Cys-Annexin V的99Tcm标记,由于本发明技术方案中99Tcm仅对AnnexinV羧基端的Cys上的巯基进行了标记,避开Annexin V的结合单位和功能区,保护膜联蛋白的生物学功能。本发明技术方案不仅保持了膜联蛋白的活性且提高标记效率,得到的标记化合物99Tcm-Cys-AnnexinV稳定性好,标记过程十分简便易行,且降低了显像剂制备的成本,有利于临床转化;动物实验表明,其生物分布理想,血液清除快,肝肾清除快。在心脏缺血再灌注损伤及肿瘤疗效及急性深静脉血栓相关研究发现: 99Tcm-Cys-AnnexinV SPECT可有效探测损伤心肌、化疗后肿瘤和血栓等,显像清晰,图像质量好。
附图说明
图1:99mTc-MIBI 心肌灌注显像(SPECT/CT)示:左室心尖部呈异常放射性稀疏区。
图2:99Tcm-Cys-AnnexinV凋亡显像(SPECT/CT)示:左室心尖部呈放射性高浓聚区。
图3:99mTc-MIBI 心肌灌注显像示心尖部异常放射性稀疏缺损区。
图4:99Tcm-Cys-AnnexinV高摄取的心肌组织的病理检查图,结果显示大量心肌细胞发生凋亡。
图5:99Tcm-Cys-AnnexinV乳腺癌裸鼠模型化疗前后micro SPECT/CT 显像。(A,B:化疗前显像:肿瘤部位未见放射性摄取;C,D:化疗后肿瘤部位有显著放射性摄取。)
图6:99Tcm-Cys-AnnexinV高摄取的乳腺癌肿瘤组织的病理检查图,结果显示大量肿瘤细胞发生凋亡。
图7:99mTC-Cys—Annexin V深静脉血栓犬靶向显像:下腔静脉及右侧股静脉血栓放射呈异常放射性浓聚。
图8:离体血栓及病理示血栓为混合血栓有大量血小板碎片和纤维素组成。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。
在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1.Cys-AnnexinV的99Tcm标记技术
Cys-AnnexinV由南京大学医药生物技术国家重点实验室提供,应用基因工程技术利用大肠杆菌中克隆、表达并纯化,在Annexin V的羧基端添带有巯基的半胱氨酸,用金属亲和层析纯化,重组制备Cys-AnnexinV。可参考申请号为201110072451.2,名称为“人膜联蛋白V变体及其表达、制备和应用”的中国专利申请公开的方法制备得到。
采用直接标记法对Cys-AnnexinV进行99Tcm标记。取适量的SnCl2·2H2O,以浓度为0.05mol/L的HCl溶解,pH7.4磷酸缓冲液稀释成1mg/mL。取已配制好的含SnCl2的柠檬酸缓冲液30μL,加入Cys-AnnexinV 5~10μg 充分摇匀亚锡化后,再加入99TcmO4 -0.8mL,10mg/mL维生素C 100μL,混匀后即可。
以纸色谱法进行标记检测,测定Cys-Annexin V的放射化学纯度及体外稳定性。采用两个体系:体系1采用新华1号层析纸作为固定相,以丙酮作为展开剂,99Tcm-Cys-Annexin V及99Tcm-胶体的比移值(Rf)为0,99TcmO4 -的Rf=0.7-0.8;体系2以2.5%牛血清白蛋白浸泡过的新华1号层析纸作为固定相,以乙醇:氨水:水(2:1:5 v/v)作为展开剂展开,99Tcm-胶体的Rf=0,而99Tcm-Cys-AnnexinV及99TcmO4 -的Rf=0.7-0.8。
纸色谱法测定Cys-AnnexinV的放射化学纯度可达(98.01±1.67)%,胶体含量为(3.31±1.37)%,室温放置3h后放射化学纯度仍保持在(95.45±1.34)%,达到临床应用的稳定性要求。
实施例2. 99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物的生物学分布特点符合作为显像剂的要求,通过小鼠体内器官分布实验进行说明。
取昆明种小白鼠40只,随机分为8组,每组5只。尾静脉注射99Tcm-Cys-AnnexinV,剂量为11.1MBq,体积为 0.2mL。分别于给药后5min、30min、1h、2h、4h、6h共6个时间点处死一组动物,取出血液、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、肌肉、骨等主要器官,称重并测定放射性计数,绘制各脏器的时间放射性曲线;计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g,每克组织或脏器放射性计数/注射入小鼠体内总放射性计数×100%)。以时间为横坐标,放射性计数为纵坐标绘制血液清除曲线,用DAS2.0软件拟合,分析在正常小鼠体内的药代动力学参数。
实验结果显示:肾脏对99Tcm-Cys-AnnexinV的摄取量最高,清除较快,其次是肝脏、脾脏,胃肠摄取较少,而脑基本不摄取(见表1)。99Tcm-Cys-AnnexinV在血液中清除迅速,DAS2.0软件拟合结果显示血液清除曲线符合二室模型特征,分布相半衰期(T1/2α)为21.18±5.95min,清除相半衰期(T1/2β)为69.32±0.10min,平均血浆清除率(CL)为0.008±0.002L/min/Kg,表观分布容积(Vd)为5.07±0.86L/Kg,由一室向二室的转移速率常数(K12)为0.031±0.010/min,由二室到一室的转移速率常数K21为0.016±0.002/min。
实施例3. 99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物作为显像剂用于检测细胞凋亡方面的应用。
本发明的技术方案是99Tcm-Cys-AnnexinV 标记化合物作为显像剂用于检测细胞凋亡方面的应用。上述的细胞凋亡理论上可以是生物体内任意一种正常或病变组织细胞的凋亡过程,如心肌细胞、肿瘤细胞等。下面以缺血再灌注-急性心肌梗死和肿瘤化疗分别造成的心肌细胞凋亡和肿瘤细胞凋亡及活化血小板为例进行说明。
1.99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物作为显像剂检测心肌细胞凋亡
实验小型猪6只(南京军区总医院实验动物中心提供),体重15~20 Kg,盐酸氯胺酮肌肉注射10mg/Kg麻醉后,静滴静安6mg/Kg/h维持麻醉。在X线监视下,股动脉穿刺,通过6F导管将球囊送入冠状动脉主要分支远端,球囊充气,阻断冠状动脉血流。血流阻断20至30min后,减压,撤去导管,造成心肌缺血再灌注-急性心肌梗死损伤。
模型制备后1h,耳缘静脉注射99Tcm-Cys-AnnexinV,剂量为370MBq(10mCi)3h进行发射型单光子断层显像(SPECT显像)和CT定位扫描。采用GE公司Millenium VG Hawkeye双探头显像仪,首先进行CT扫描,每层扫描15s,共扫描40层。随后进行SPECT显像,能峰140KeV,能窗20%,图像矩阵128×128,每6o采集1帧图像,共采集60帧图像,每帧采集45s,OSEM软件迭代重建后,分别得到SPECT和CT及融合图像。勾画“感兴趣”区(ROI)的方法计算靶器官(凋亡心肌)/(正常心肌)(T/NT)比值.
显像结束后,动物处死,立即取出心脏,取出缺血再灌注损伤,并取正常心肌组织作为对照,分别用γ计数仪分别测定放射性计数,并称重,计算两者的单位重量放射性摄取比值。
取再灌注损伤心肌和正常心肌,进行DNA含量分析,电镜检查。DNA分析采用Bec Ton Dickinson公司FACS Calibur型流式细胞仪。电镜(日本JEM-1010型),5%戊二醛固定,1%锇酸固定,丙酮逐级脱水,包埋,薄切片,醋酸油、柠檬酸铅染色后,上机观察。
实验结果显示:显像剂注射后3h,心肌部位可见明显的局部放射性异常浓聚(凋亡心肌摄取)(结果见图1-图3),血池影显影较淡,T/NT比值为3.89±0.84。体外测定,凋亡心肌与正常心肌的单位质量放射性摄取比值为10.35±4.33。
DNA含量分析可见明显的凋亡细胞峰,正常心肌组织未见明显的凋亡细胞峰形成。电镜检查也证实:再灌注损伤心肌有大量凋亡心肌细胞形成(结果见图4)。
结果表明:99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物作为显像剂可以显示心肌细胞的凋亡,而心肌细胞凋亡是急性心肌梗死、心肌病、心力衰竭、心脏移植后的心肌排斥反应等心肌疾病共同的病理特征,本发明的显像技术可用于上述疾病的诊断和疗效评价。
2.99Tcm-Cys-AnnexinV 标记化合物作为显像剂检测肿瘤化疗后细胞凋亡(以乳腺癌为例),用于早期评价肿瘤疗效。
建立荷MD231乳腺癌裸鼠模型。取人乳腺癌细胞株MD231, 15%小牛血清的RPMI-1640完全培养基,于37℃、体积分数5%CO2条件下培养,当细胞长到80%-90%融合时,用胰酶消化,保证活细胞率大于99%。取4至5周龄的BALB/C裸鼠,将含有1×106个肿瘤细胞的细胞悬液0.2mL注射于小鼠右侧前肢腋下。待瘤体直径长至1cm左右,经尾静脉注射紫杉醇诱导化疗,给药剂量按照175mg/m2,化疗后48h、72h用于显像实验。
未治疗对照组、化疗后48h、72h的荷MD231裸鼠各5只,尾静脉注射99Tcm-Cys-AnnexinV 18.5MBq/0.2mL,注射后1h、3h进行Micro SPECT/CT显像。采用Nano SPECT/CT PLUS 及Invivoscope 软件(Bioscan 公司),采集条件:采用9孔针孔准直器,空间分辨率约为0.74 mm,能峰140 keV, 窗宽为20%,矩阵为256×256,帧/30秒。CT管电压为55keV,曝光时间为1000 ms,180°投影。扫描时间约为45min。采集的SPECT数据经HiSPECT软件迭代重建,CT数据经Nucline软件实时重建,融合3D图像。利用其自带Invivoscope 软件勾画肿瘤部位与对侧正常肌肉感兴趣区(ROI),计算肿瘤与对侧肌肉感兴趣区的比值(T/NT值)并加以比较。显像后,将裸鼠断颈处死,解剖取出肿瘤,称重并测定放射性计数,计算每克组织百分注射剂量率(%ID/g)。
体外细胞凋亡检测。包括:
(1)流式细胞术(FCM)定量分析活化caspase-3:流式细胞术定量分析活化caspase-3具体步骤如下:①新鲜肿瘤组织剪碎,加5mL生理盐水,用吸管吸取组织悬液,以300目尼龙网过滤,1000r/min离心5min,再加pH7.4的0.01M PBS 2mL,500至800r/min离心5min洗2遍以去除细胞碎片,4℃保存备用。②离心管中加细胞悬液300μL(1×106个细胞),加1μL FITC-DEVD-FMK,37℃、5% CO2条件下孵育30min。③加1μL/mL caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK抑制caspase-3活化作为阴性对照组。④ 加缓冲液0.5 mL,3000r/min离心5min,弃上清。再重复一次。⑤加入缓冲液0.5mL,旋涡混匀。⑥上流式细胞仪进行定量分析。
(2)光镜及原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡:TUNEL法用于单细胞水平凋亡免疫组化检测和量化分析。其原理为标记DNA断裂位,详细步骤如下:①二甲苯脱蜡,梯度酒精水化后PBS冲洗2次,每次3min。②胃蛋白酶消化,PBS冲洗2次,每次3min。③擦干组织周围水份,每片加50μL的0.3%H2O2甲醇溶液,阻断内源性过氧化酶,PBS冲洗2次,每次3min。④每片加50ulTUNEL反应液,孵育盒中37℃,60min,PBS冲洗2次,每次3min。⑤每片加50μL辣根过氧化酶抗体,孵育盒中37℃,PBS冲洗3次,每次3min。⑥加新鲜配置的DAB一滴,室温孵育,PBS冲洗3次,每次3min。苏木素复染,酒精脱水,干燥。⑦中性树胶封片。光镜观察,细胞核棕色为阳性。
实验结果显示: 99Tcm-Cys-AnnexinV注射后2h,化疗组肿瘤部位即可见明显的高放射性摄取,随着时间延长而逐渐变浓;而对照组的肿瘤部位却未见明显放射性摄取(结果见图5)。
化疗后48h、72h组的T/NT比值分别为3.41±0.90和3.85±0.62,对照组的T/NT仅为1.42±0.19,明显低于化疗组(P<0.01)。化疗后48h和72h,肿瘤放射性摄取值(%ID/g)分别为3.60±1.09和3.73±0.97,对照组肿瘤仅有少量的放射性摄取,为1.09±0.18,明显低于化疗组(P<0.01)。
FCM定量分析活化caspase-3,对照组为3.70%±0.74%;紫杉醇诱导化疗后,大量caspase-3被激活, 48h和72h化疗组分别为62.85%±6.13%和70.44±6.09%,与对照组相比,均有显著性差异(P<0.01)。
光镜及TUNEL法检测细胞凋亡结果见图6。对照组的肿瘤组织仅出现少量细胞凋亡,苏木素伊红(HE)染色和TUNEL法仅可见数个散在凋亡小体,细胞轮廓完整包绕核碎片。而化疗诱导后24h,片状或多灶性的细胞凋亡,HE染色见大的核碎片、核固缩,TUNEL示大量黄染的凋亡细胞。10个高倍视野中凋亡细胞数占总细胞数的百分比,取平均值即为细胞凋亡指数(apoptotic index),对照组的凋亡指数为3.31%±0.61%, 48h和72h化疗组的凋亡指数分别为70.42%±7.54%和83.23%±9.71%,与对照组相比均有显著性差异(P<0.01)。
结果表明:99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物作为显像剂能够显示化疗后肿瘤细胞的凋亡情况,由于诱发肿瘤细胞凋亡是紫杉醇等许多化疗药物的治疗目的,因此,本发明的显像技术可用于恶性肿瘤化疗疗效的评价。
3. 99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于检测下肢深静脉血栓方面的用途。
犬静脉血栓模型的建立。在数字血管减影机的引导下,利用导丝、球囊导管及外源性凝血酶制造犬深静脉模型。血管造影复查示:所有9条犬均见深静脉血栓成功形成,右股静脉9支,下腔静3支,左侧髂静脉1支。具体血栓形成的分布情况见(表1),“+”表示血栓形成, “-”表示未见明显血栓形成。
表2. 9只犬体内血栓形成的分布
99mTC-Cys-Annexin V 在深静脉血栓犬体内靶向显像。深静脉血栓模型体内靶向显像示,99mTC-Cys-Annexin V 和血栓高度特异性结合,对血栓显像清晰,有较好的摄取和滞留,最佳显像时间约在2-2.5小时,血栓与对侧组织的最高放射性比值达3.60,血池的放射性摄取下降迅速。
犬股静脉血栓观察及病理学检查。9只犬右侧股静脉内均见大量白色血栓形成,右侧股静脉内膜重度损伤,管腔完全闭塞。5只犬下腔静脉内见血栓,其中3只犬的下腔静脉内膜损伤,管腔重度狭窄,2只犬下腔静管壁附着少量血栓。1只犬左侧髂静脉内见大量血栓,内膜完整,管腔闭塞(结果见图7和图8)。
结果表明:99mTC-Cys-Annexin V 和血栓高度特异性结合,对血栓显像清晰,有望成为一种新型的应用于临床血栓靶向显像剂。
Claims (8)
1.一种以磷脂酰丝氨酸为靶点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV,其特征在于膜联蛋白AnnexinV 的羧基端连有半胱氨酸Cys,半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素99Tcm。
2.如权利要求1所述的 放射性药物,其特征在于所述放射性药物为无色透明液体针剂。
3.一种如权利要求1所述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,其特征在于采用直接标记法对Cys-Annexin V进行99Tcm标记,步骤包括:
(1)取适量的SnCl2加入Cys-Annexin V使蛋白亚锡化;
(2)向步骤(1)蛋白亚锡化后的Cys-Annexin V中加入99TcmO4 -充分混匀后放置,即形成99Tcm-Cys-Annexin V。
4.如权利要求3所述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,其特征在于所述步骤(2)还加入维生素C保持溶液稳定性。
5.如权利要求3或4所述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,其特征在于所述步骤具体包括:
(1)取适量的SnCl2·2H2O,以浓度为0.05mol/L的HCl溶解,取已配制好的上述含SnCl2的100μL,总计亚锡量约25~30μg依次加入Cys-Annexin V 5~50μg后充分摇匀;
(2)向步骤(1)蛋白亚锡化后的Cys-Annexin V中加入99TcmO4 -0.8mL,10mg/mL维生素C 100μL,混匀后放置,即形成99Tcm-Cys-Annexin V。
6.99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于检测心肌缺血损伤后心肌细胞凋亡方面的用途。
7.99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于化疗后检测肿瘤细胞凋亡方面的用途。
8.99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于探测急性血栓方面的用途。
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