RU2619556C2

RU2619556C2 - Новая метящая композиция для ракового поражения

Info

Publication number: RU2619556C2
Application number: RU2015131003A
Authority: RU
Inventors: Сеок Ки КИМ; Се Хун КАНГ; Сеок Вон КИМ; Со Йоун ДЗУНГ
Original assignee: Нэшнл Кэнсэр Сентер
Priority date: 2012-12-26
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2017-05-16
Also published as: JP6174713B2; JP2016511745A; EP2940474A1; RU2015131003A; CN104919319B; EP2940474A4; US20150328345A1; CA2896464C; KR20140083727A; CN104919319A; EP2940474B1; US10166302B2; KR101552138B1; WO2014104605A1; ES2725352T3; CA2896464A1

Abstract

Группа изобретений относится к: метящей композиции для непосредственного введения в раковую ткань для идентификации места и размера ракового поражения в режиме реального времени во время хирургического вмешательства по удалению рака, содержащей комплекс, в котором макроагрегат альбумина (МАА) связан с пигментом для окрашивания живых тканей, радиоактивным изотопом или их комбинацией, где МАА дополнительно связан с фибрином; способу предоставления информации о месте и размере ракового поражения с применением метящей композиции для ракового поражения; набору для идентификации места и размера ракового поражения в режиме реального времени во время хирургического вмешательства по удалению рака, содержащему вышеуказанную метящую композицию. Метящая композиция согласно настоящей группе изобретений связывается с раковым поражением с целью обнаружения места, размера и т.п. ракового поражения в режиме реального времени, посредством чего улучшается частота успеха хирургической операции для ракового поражения и также предотвращается чрезмерная потеря здоровых тканей. Следовательно, настоящая группа изобретений может широко применяться для эффективной терапии против рака. 4 н. и 9 з.п. ф-лы, 14 ил., 1 табл., 5 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001] Настоящее изобретение относится к новой метящей композиции для ракового поражения. Более конкретно, настоящее изобретение относится к метящей композиции для ракового поражения, содержащей комплекс, в котором макроагрегат альбумина (MAA) связан с пигментом для окрашивания живых тканей, радиоактивным изотопом, или их комбинацией; способу для предоставления информации об области ракового поражения посредством применения метящей композиции для ракового поражения; набору, содержащему метящую композицию для ракового поражения для мечения ракового поражения; и комплекс, в котором пигмент для окрашивания живых тканей связан с MAA, содержащемся в метящей композиции для ракового поражения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Для терапии против рака был разработан способ с применением различных средств против рака, однако хирургический операционный способ удаления раковых клеток все еще является наиболее часто используемым способом. Когда применяется хирургический операционный способ, методика для минимизации объема хирургического вмешательства является необходимой для послеоперационного здоровья и благосостояния пациентов. В частности, для рака молочной железы поражение, иссеченное во время хирургии, должно быть меньшим для корейских женщин, чем женщин в других странах, размер груди которых является малым, чтобы достигнуть цели терапии сохранения груди. Объем хирургического вмешательства определяется как поражение и граничные краевые области вокруг поражения. В случае, когда оперирующий хирург точно не знает объема и области поражения, должен требоваться большой размер граничных краевых областей вокруг поражения. Причина состоит в том, что, когда объем хирургии уменьшается вслепую, опухоль может остаться в рассеченной стороне. Однако в реальной клинической хирургии существует мало способов, позволяющих оперирующему хирургу точно идентифицировать поражение в режиме реального времени во время хирургии. Несмотря на то, что был разработан очень точный диагностический способ, этот диагностический способ не может применяться во время хирургии. Таким образом, во время реальной хирургии, главным образом используются осязательное ощущение и зрение операционного хирурга. Однако, в таком случае, редко можно ясно отличить поражение. В частности, в случае, когда поражение мало, его труднее отличить. Для того, чтобы достигнуть целей микроинвазивной хирургии и сохраняющей хирургии, необходима методика для информирования оперирующего хирурга о поражении в режиме реального времени во время хирургического вмешательства.

[0003] В типичной хирургии для удаления опухоли, в частности, хирургии рака молочной железы, место микропоражения пациента идентифицируется перед хирургией посредством ультразвуковых волн, маммографии или магнитно-резонансной визуализации. Затем идентифицированное место поражения отмечается, и после этого ткань в отмеченной области удаляется. В качестве способа для отметки идентифицированного места поражения применяются следующие способы: способ рисования изображения на поверхности кожи, способ использования провода и способ впрыскивания черного пигмента, такого как активированный уголь. Хотя способ рисования изображения на коже посредством использования ручки для того, чтобы отметить место поражения, может легко быть применен, способ имеет недостаток, заключающийся в низкой точности, потому что, из-за очень гибкой характеристики ткани молочных желез, форма груди значительно изменяется во время хирургии по сравнению с формой в момент диагностики, и, в случае поражения глубоко в груди, метка на поверхности кожи является недостаточной. Кроме того, недостаток способа вставки провода в поражение груди заключается в более низкой точности, чем ожидается, потому что, по существу, провод должен быть вставлен вертикально в поверхность кожи, но вертикальная вставка провода может повлиять на ультразвуковой зонд, в результате чего провод будет неизбежно вставлен наклонно; и потому что расположение провода может перемещаться в соответствии с перемещением груди. Кроме того, другой недостаток способа заключается в том, что вставленный провод мешает хирургии; и процедура для иссечения места вставки провода должна быть выполнена дополнительно. Наконец, способ впрыскивания пигмента, такого как активированный уголь, выгоден в том, что введенный пигмент связывается с поражением таким образом, что место поражения может быть точно помечено. Однако, в случае поражения глубоко в груди, имеются недостатки, заключающиеся в том, что черный пигмент не может быть идентифицирован снаружи, и область хирургии может быть загрязнена пигментом. Эти недостатки также становятся ограничением для хирургической операции по удалению раковой ткани рядом с раком молочной железы.

[0004] Таким образом, с помощью методик, разработанных до настоящего времени, трудно точно определить объем хирургии для хирургического удаления ракового поражения. Следовательно, когда раковое поражение удаляется хирургически, иссеченная область должна быть большей по размеру, чем необходимо, и также после хирургии является необходимым проведение исследования по идентификации того, было ли нормально удалено поражение или нет.

[0005] Поэтому авторы настоящего изобретения выполнили настоящее изобретение посредством демонстрации того, что когда раковое поражение удаляется хирургически, средство мечения, содержащее макроагрегат альбумина, с которым связан пигмент для окрашивания живых тканей, эффективно адсорбируется раковым поражением таким образом, что место поражения может быть точно помечено; и таким образом, что пигмент может быть отслежен в режиме реального времени, с тем чтобы величина поражения, которое должно быть удалено, могла быть точно идентифицирована.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

[0006] Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить метящую композицию для ракового поражения, содержащую комплекс, в котором макроагрегат альбумина (MAA) связан с пигментом для окрашивания живых тканей, радиоактивным изотопом, или комбинацией указанного.

[0007] Другая цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить способ предоставления информации о месте ракового поражения посредством применения метящей композиции для ракового поражения.

[0008] Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить набор для мечения ракового поражения, при этом набор содержит метящую композицию для ракового поражения.

[0009] Еще одна цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предоставить комплекс, в котором пигмент для окрашивания живых тканей связан с MAA, содержащимся в метящей композиции для ракового поражения.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

[0010] Для того, чтобы достигнуть цели, настоящее изобретение предоставляет метящую композицию для ракового поражения, содержащую комплекс, в котором макроагрегат альбумина (MAA) связан с пигментом для окрашивания живых тканей, радиоактивным изотопом, или их комбинацией. Рак, который может быть помечен с помощью композиции, может являться любым раком, содержащим ткань, в которую MAA может проникнуть и на которой он может быть зафиксирован, без ограничения. Однако, рак предпочтительно представляет собой солидный рак, имеющий ткань, в которую MAA может проникнуть и на которой он может быть зафиксирован. Примеры могут включать рак предстательной железы, рак молочной железы, рак матки, рак кожи, рак шейки матки, рак легких, опухоль головного мозга, желудочно-кишечную опухоль, рак печени, саркому мягкой ткани и лимфому, и т.д.

[0011] Формулировка "макроагрегат альбумина (MAA)" при использовании в настоящем описании означает белковые частицы, которые имеют диаметр от 10 до 50 мкм и приготовляются посредством нагревания и коагуляции человеческого сывороточного альбумина. Структура и физические свойства MAA отличаются от человеческого сывороточного альбумина, имеющего диаметр менее чем 10 нм. Когда MAA вводится внутривенно, MAA может оставаться в легочном капилляре, который составляет 8 мкм, таким образом, вызывая микроэмбол. За счет использования такого свойства MAA, меченный радиоактивным изотопом, применялся для скеннограммы легкого (для диагностики нарушений в легочном кровотоке, шунте справа налево или увеличенного венозного давления в легком, такого как легочная эмболия, легочный кровяной сгусток, болезнь отсутствия пульса, пневмония, и рак легких), венозного сканирования (для диагностики на месте венозной крови центральных нервов) или венозного сканирования (для диагностики нарушений кровотока периферической артерии, таких как болезнь Фаза). MAA по настоящему изобретению инъецируется в ткань ракового поражения и используется в качестве медиатора для связывания метящего вещества с тканью ракового поражения. MAA по настоящему изобретению может синтезироваться посредством применения рекомбинантного HSA или неаутогенного HSA. Кроме того, имеющийся в продаже MAA может быть куплен и применен. MAA по настоящему изобретению инъецируется в ткань ракового поражения и используется в качестве медиатора для связывания метящего вещества с тканью ракового поражения, при этом медиатор адсорбирует метящее вещество, чтобы предотвратить диффузию метящего вещества в ткань ракового поражения.

[0012] Формулировка "пигмент для окрашивания живых тканей", при использовании в настоящем описании означает вещество, которое связывается с живыми тканями, посредством чего осуществляя мечение участка связывания, чтобы обеспечить возможность идентификации помеченного участка невооруженным глазом или посредством применения инструмента обнаружения. Для целей настоящего изобретения, в качестве пигмента для окрашивания живых тканей, метящее вещество, которое может связываться с раковой тканью и применяться для мечения участка, где образовался рак. Предпочтительно, видимый пигмент, или флуоресцентный пигмент, который генерирует флуоресценцию в месте связывания и является поддающимся обнаружению посредством применения устройства, такого как камера флуоресценции, может применяться один или в комбинации, но не ограничивается указанным.

[0013] Формулировка "видимый пигмент" при использовании в настоящем описании означает тип пигмента, в котором метящее вещество, связанное с живыми тканями, демонстрирует цвет с длиной волны видимого света, в результате чего меченая область может быть идентифицирована невооруженным глазом. Для целей настоящего изобретения видимый пигмент может быть инъецирован в место, где образовался рак, в результате чего, когда рак удаляется хирургически, раковое поражение, которое будет иссечено, может быть точно идентифицировано, и, таким образом, может быть увеличена частота успеха хирургии рака. Предпочтительно, в качестве видимого метящего вещества, природный красный, нильский синий, бисмарк коричневый, литиевый кармин, трипановый синий, янус зеленый, метиловый фиолетовый, o-ламин, малахитовый зеленый, сафранин, эозин, конго красный, эритроцин, нигрозин, гематоксилина альциановый синий, анилиновый синий, светло-зеленый может использоваться один или в комбинации, но не ограничен указанным, если цель, заключающаяся в возможности идентификации ткани ракового поражения, может быть достигнута.

[0014] Формулировка "флуоресцентный пигмент" при использовании в настоящем описании означает органическое соединение, которое испускает флуоресценцию с целью обеспечения максимальной длины проникновения света и обеспечения минимальной ошибки сигнала из-за влажности после того, как было создано состояние возбуждения посредством поглощения света, имеющего определенную длину волны. Флуоресцентный пигмент может представлять собой флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона, который является органическим соединением, которое предпочтительно испускает флуоресценцию в ближнем инфракрасном диапазоне с длиной волны от 700 нм до 3000 нм, и, предпочтительно, от 750 нм до 900 нм. Флуоресценция с длиной волны в ближнем инфракрасном диапазоне, сгенерированная флуоресцентным пигментом ближнего инфракрасного диапазона, может быть получена в форме изображения или контролироваться в режиме реального времени посредством применения устройства, такого как флуоресцентная камера и обнаруживающий флуоресценцию зонд (PCT/KR2011/009271). Поглощение в естественных условиях флуоресценции с длиной волны в ближнем инфракрасном диапазоне по настоящему изобретению сравнительно ниже, чем поглощение флуоресценции при других длинах волн, в результате чего излучение в ближнем инфракрасном диапазоне, сгенерированное в относительно глубокой части тела, может быть обнаружено ex vivo. Для целей настоящего изобретения флуоресцентный пигмент с длиной волны в ближнем инфракрасном диапазоне может быть инъецирован в место, где образовался рак, чтобы обеспечить возможность точной идентификации места ракового поражения до иссечения, когда рак удаляется хирургически, и, таким образом, может быть увеличена частота успеха хирургического лечения рака. В частности, в отличие от видимого пигмента, место поражения может быть обнаружено ex vivo до непосредственной идентификации поражения через иссечение, в результате чего может быть достигнута быстрая и точная хирургия рака. В качестве флуоресцентного пигмента в ближнем инфракрасном диапазоне предпочтительно используется индоцианин зеленый. Однако, если он подходит для применения в человеческом теле, любой флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона может быть включен в объем настоящего изобретения.

[0015] Комплекс, в котором флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона связан с MAA, является выгодным в том, что безопасность и точность обнаруженного флуоресцентного сигнала лучше, чем таковые в комплексе, в котором флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона связан с другими веществами, которые, как известно, накапливаются в опухоли. Таким образом, уровень возможности обнаружить микропоражение является высоким, и точность иссечения поражения может быть увеличена.

[0016] Формулировка "индоцианин зеленый (ICG)" при использовании в настоящем описании означает флуоресцентный краситель визуализации в ближней инфракрасной области, который широко используется в области биологии и медицины. Так как ICG разлагается и затем удаляется или выделяется с мочой и калом спустя приблизительно один час после инъецирования в человеческое тело, ICG является выгодным в клиническом применении в качестве флуоресцентного красителя, применимого к человеческому телу. Действительно, о случаях применения ICG к человеческому телу сообщалось во многих журналах. Например, сообщалось, что в клинических условиях ICG безопасно применялся для 18 больных раком молочной железы (см. T. Kitai и соавт., Breast Cancer, 12:211-215, 2005). Кроме того, поглощение и связывание флуоресцентного пигмента ближнего инфракрасного диапазона могут быть достигнуты посредством смешивания флуоресцентного пигмента ближнего инфракрасного диапазона с MAA по настоящему изобретению.

[0017] Согласно примера по настоящему изобретению во время приготовления комплекса, в котором MAA связан с ICG (ICG-MAA), было обнаружено, что подходящая пропорция смешивания для приготовления комплекса, демонстрирующего высокий уровень флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне, составляет 3,9 мкМ ICG на 0,23 мг/мл MAA, 6,5 мкМ ICG на 2,3 мг/мл MAA и 6,5 мкМ ICG на 11,5 мг/мл MAA (таблица 1 и фиг. 4). При инъецировании в тело, поскольку концентрации являются различными вследствие диффузии в естественных условиях, точная концентрация не может быть определена в момент инъецирования. Однако, было экспериментально найдено, что самое высокое флуоресцентное значение наблюдалось при 65 мкМ, что является в 10 раз более высокой концентрацией. Кроме того, в результате исследования, демонстрирует ли созданный комплекс стабильность как в условиях in vitro, так и в условиях in vivo, можно обнаружить, что относительно высокий уровень интенсивности флуоресцентного сигнала и устойчивости демонстрируются и в условиях in vivo, и в условиях in vitro (фиг. 5 и 6).

[0018] Формулировка "радиоактивный изотоп" при использовании в настоящем описании означает элемент, который имеет такой же атомный номер, но другую атомную массу, в результате чего являясь способным к испусканию радиоактивного излучения, при этом радиоактивный изотоп также обычно используется в качестве важного средства мечения для диагностирования заболевания посредством применения свойства испускания гамма-луча и других субатомных частиц для радиоактивного распада. Для целей настоящего изобретения радиоактивный изотоп может быть инъецирован в место образования рака в глубокой ткани, где флуоресценция, сгенерированная посредством флуоресцентного пигмента ближнего инфракрасного диапазона, не обнаруживается, с целью обеспечения возможности точной идентификации ракового поражения, перед иссечением, когда рак удаляется хирургически, и, таким образом, частота успеха хирургии рака может быть увеличена. Радиоактивный изотоп может являться любым радиоактивным изотопом, который дает возможность мечения MAA, способного к связыванию с раковым поражением, но конкретно не ограничивается указанным. Предпочтительно, радиоактивный изотоп может представлять собой H-3, C-14, P-32, S-35, Cl-36, Cr-51, Co-57, Co-58, Cu-64, Fe-59, Y-90, I-124, I-125, Re-186, I-131, Tc-99m, Мо-99, P-32, CR-51, Ca-45, Ca-68, и т.д. Более предпочтительно, в медицине может применяться радиоактивный изотоп I-124, I-125, I-131, Cu-64, Tc-99m Мо-99, CR-51, Ca-45 и Ca-68, и т.д. Наиболее предпочтительно, может применяться Tc-99m. Рак может представлять собой любой рак, который может быть удален посредством хирургической резекции, без ограничения. Рак может представлять собой большинство солидных раков, таких как рак предстательной железы, рак молочной железы, рак матки, рак кожи, рак шейки матки, рак легких, опухоль головного мозга, желудочно-кишечная опухоль, рак печени, саркома мягкой ткани, и лимфома, но не ограничивается указанным.

[0019] Формулировка "Tc-99m" при использовании в настоящем описании представляет собой радиоактивный изотоп технеция (Tc), который имеет малый период полураспада, составляющий 6 часов, испускает гамма-излучение, в результате чего может быть использован для визуализации, демонстрирует очень небольшую дозу облучения и превосходный уровень проникновения через ткань, и не вызывает аллергическую реакцию, которая была показана для некоторых пигментов. Таким образом, Tc-99m широко применяется в медицинских исследованиях.

[0020] Согласно примера по настоящему изобретению, когда MAA реагирует с [Tc-99m]Tc0₄ ^-, который является радиоактивным изотопом, может быть создан комплекс, в котором радиоактивный изотоп связывается с MAA с выходом 99% или более. Когда комплекс инъецируется в тело, место инъецирования может быть идентифицировано в течение 20 часов после инъецирования (фиг. 3). Когда MAA последовательно реагирует с [Tc-99m]Tc0₄ ^-, который является радиоактивным изотопом, и ICG, который является инфракрасным пигментом ближнего инфракрасного диапазона, может быть создан комплекс, с которым связаны радиоактивный изотоп и флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона ([Tc-99m]Tc-ICG-MAA (фиг. 10). Место инъецирования созданного комплекса может быть идентифицировано после 20 часов инъецирования в тело (фиг. 11).

[0021] Для того, чтобы максимизировать применимость комплекса, в котором пигмент для окрашивания живой ткани связан с MAA по настоящему изобретению в качестве средства мечения in vivo, физические параметры комплекса могут быть улучшены посредством применения фибрина. А именно, комплекс по настоящему изобретению инъецируется в область поражения в теле, чтобы играть роль метящего поражение средства с целью обеспечения возможности ясного распознавания области поражения во время хирургического вмешательства. Для того, чтобы комплекс легко достигал цели в качестве метящего средства, описанного выше, диффузия должна быть максимально предотвращена в месте поражения, в котором выполнялась инъекция. В качестве инструмента для достижения цели может применяться фибрин (фиг. 1). Фиг. 1 представляет собой схематическую диаграмму, показывающую, что когда фибрин добавляется к комплексу, содержащему MAA и ICG, удержание комплекса в ткани in vivo увеличивается посредством добавления фибрина. Как показано на фиг. 1, фибрин играет роль в связывании комплексов, инъецированных в тело, друг с другом, и, таким образом, может быть максимально предотвращена диффузия комплексов, инъецированных в тело. Таким образом, комплекс по настоящему изобретению может дополнительно содержать фибрин.

[0022] Согласно примера по настоящему изобретению комплекс ICG-MAA-фибрин, с которым связан фибрин коагуляции крови, создается посредством смешивания и реагирования смеси 1 и смеси 2 с созданным комплексом (ICG-MAA), в котором MAA связан с ICG, при этом смесь 1 содержит тромбин и апротинин, и смесь 2 содержит фибриноген и CaCl₂. Было исследовано, демонстрирует ли комплекс ICG-MAA-фибрина, созданный таким образом, стабильность в условиях in vitro и in vivo, и, в результате, было обнаружено, что относительно высокий уровень интенсивности флуоресцентного сигнала ближнего инфракрасного диапазона и стабильности демонстрируется в условиях как in vitro, так и in vivo (фиг. 5 и 6). Кроме того, поскольку степень диффузии с течением времени комплекса ICG-MAA-фибрин ниже, чем степень диффузии комплекса, в котором MAA связан с ICG (ICG-MAA) в условиях in vitro и in vivo, было обнаружено, что комплекс ICG-MAA-фибрин демонстрирует предпочтительное свойство в качестве метящего средства для ракового поражения (фиг. 7, 8, и 9).

[0023] Кроме того, как описано выше, в качестве другого инструмента для достижения цели предотвращения диффузии комплекса в естественных условиях, может применяться желатиновая губка. Когда используется желатин, который обладает превосходной совместимостью в естественных условиях и может легко образовывать гель при комнатной температуре, можно сформировать конструкцию, в которой комплекс заключен в агрегированной форме в пределах желатина. Посредством инъецирования сформированной таким образом конструкции в тело, диффузия комплекса в месте инъекции может быть максимально подавлена желатином. Однако, желатин имеет ограничение, заключающееся в том, что желатин легко растворяется в среде in vivo, и в результате конструкция может быть уничтожена. Для того, чтобы преодолеть ограничение, желатиновая губка применяется вместо желатина, в результате ограничение может быть преодолено.

[0024] Желатиновая губка представляет собой конструкцию, в которой изопептидная связь образуется между аминной группой боковой цепи лизина и карбоксильной группой боковой цепи глутамата или аспартата в желатине посредством нагревания раствора желатина до высокой температуры. Желатиновая губка демонстрирует такую же совместимость в естественных условиях, как совместимость желатина, при этом имеет относительно низкую растворимость в воде, и, таким образом, желатиновая губка не является легкорастворимой в теле. Таким образом, при формировании конструкции, в которой комплекс по настоящему изобретению заключен в агрегированной форме, посредством применения желатиновой губки, и инъецирования конструкции в тело, поскольку желатиновая губка не растворяется в теле, инъецированная конструкция не разрушается. Таким образом, диффузия комплекса в месте инъекции может подавляться эффективнее.

[0025] Согласно примера по настоящему изобретению желатиновая губка, содержащая перекрестную структуру, приготовляется посредством нагревания раствора желатина в течение 3 часов при 160^oC, и как желатин, так и желатиновая губка погружаются в дистиллированную воду и оставляются в ней в течение 24 часов. В результате было обнаружено, что желатин полностью растворяется в дистиллированной воде, в то время как желатиновая губка не растворяется в воде, демонстрируя более высокую стабильность (фиг. 12).

[0026] Когда применяется желатиновая губка, описанная выше, может быть подготовлена конструкция, которая содержит флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона и радиоактивный изотоп вместе. А именно, может быть создана конструкция, которая содержит комплекс, в котором MAA связан с флуоресцентным пигментом ближнего инфракрасного диапазона ICG (ICG-MAA), или комплекс, в котором MAA связан с радиоактивным изотопом [Tc-99m] Tc и флуоресцентным пигментом ближнего инфракрасного диапазона ICG ([Tc-99m]Tc-ICGMAA) в желатиновой губке. Кроме того, может быть создана конструкция, которая отдельно содержит радиоактивный изотоп, и комплекс, в котором MAA связан с флуоресцентным пигментом ближнего инфракрасного диапазона ICG (ICG-MAA) в желатиновой губке. Также, в случае, когда комплекс и радиоактивный изотоп включены отдельно, может быть дополнительно включен инструмент для эффективной фиксации радиоактивного изотопа в губке желатина. В качестве инструмента фиксации может применяться связанная с радиоактивным изотопом катушка золотой фольги, но конкретно не ограничивается указанным, если инструмент фиксации достигает цели фиксации радиоактивного изотопа (фиг. 2). Фиг. 2 представляет собой схематичную диаграмму, показывающую структуру и способ инъецирования метящего средства твердого типа, созданного посредством добавления связанной с радиоактивным изотопом катушки золотой фольги и желатина к комплексу, содержащему MAA и ICG. Как показано на фиг. 2, метящее средство может быть создано посредством применения комплекса, с которым не связан радиоактивный изотоп (ICG-MAA), и добавления радиоактивного изотопа по мере необходимости. Поэтому, посредством применения желатиновой губки, применимость основанного на MAA средства мечения может быть увеличена.

[0027] Согласно примера по настоящему изобретению создавалось метящее средство твердого типа, содержащее связанную с радиоактивным изотопом катушку золотой фольги, ICG, MAA и желатиновую губку, и его стабильность сравнивалась в условиях in vitro и in vivo со стабильностью контрольного метящего средства твердого типа, которое содержит только желатиновую губку и ICG. В результате было обнаружено, что в условиях in vitro ICG в контрольном метящем средстве мечения твердого типа диффундирует, и, таким образом, флуоресцентный сигнал ближнего инфракрасного диапазона обнаруживается в дистиллированной воде сам по себе после 8 и 24 часов, в то время как скорость диффузии ICG метящего средства твердого типа по настоящему изобретению находится на относительно низком уровне (фиг. 13). Кроме того, было обнаружено, что в условиях in vivo больше не было обнаружено флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне для контрольного метящего средства твердого типа после трех недель, в то время как флуоресцентный сигнал ближнего инфракрасного диапазона все еще обнаруживался для метящего средства твердого типа по настоящему изобретению (фиг. 14).

[0028] Согласно другому аспекту настоящего изобретения настоящее изобретение предоставляет способ предоставления информации о месте ракового поражения, включающий в себя: (a) введение метящей композиции для ракового поражения в раковое поражение, образовавшееся у субъекта; и (b), идентификацию места, генерирующего сигнал, выбираемый из группы, состоящей из цвета, флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона, радиоактивности и комбинации указанного, у субъекта.

[0029] Формулировка "субъект", при использовании в настоящем описании означает живой организм, в котором может образоваться рак, который будет демонстрировать поражение, и в который могут быть введены метящий комплекс или композиция для ракового поражения по настоящему изобретению.

[0030] Когда метящая композиция для ракового поражения, представленная в настоящем изобретении, вводится в ткань ракового поражения тела, введенная композиция связывается с раковым поражением, и, таким образом, место поражения может быть помечено с помощью цвета, флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона, радиоактивности или комбинации указанного. Посредством обнаружения метки можно обнаружить место и размер ракового поражения в режиме реального времени во время хирургии. Следовательно, точность может быть увеличена, и чрезмерная потеря нормальной ткани может быть предотвращена во время хирургического удаления ракового поражения.

[0031] Кроме того, комплекс, содержащийся в композиции по настоящему изобретению, может оставаться в раковом поражении в теле в течение длительного периода времени относительно комплекса, в котором пигмент для окрашивания живой ткани связывается с другими материалами, и, таким образом, точность иссечения ракового поражения может быть легко проверена во время хирургической операции, а также хирургического иссечения ракового поражения. Например, с помощью ультразвука, место микропоражения идентифицируют перед хирургией. Затем комплекс по настоящему изобретению инъецируют в область поражения, чтобы обеспечить возможность стабильной и точной идентификации области поражения во время хирургии, которая выполняется спустя несколько часов после этого.

[0032] В качестве еще одного аспекта настоящего изобретения настоящее изобретение предоставляет набор, содержащий композицию для мечения ракового поражения и комплекс, в котором пигмент для окрашивания живой ткани связан с MAA, содержащимся в композиции. Набор или комплекс могут применяться для идентификации места и размера ткани ракового поражения в режиме реального времени во время удаляющей рак хирургической операции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0033] Фиг. 1 представляет собой схематичную диаграмму, показывающую, что, когда фибрин добавляется к комплексу, содержащему MAA и ICG, удержание комплекса в ткани in vivo увеличивается за счет добавления фибрина.

[0034] Фиг. 2 представляет собой схематичную диаграмму, показывающую структуру и способ инъецирования метящего средства твердого типа, созданного посредством добавления связанной с радиоактивным изотопом катушки золотой фольги и желатина к комплексу, содержащему MAA и ICG.

[0035] Фиг. 3 представляет собой гамма-изображение, показывающее, изменяется ли [Tc-99m] Tc-MAA или нет с течением времени в «голой» мыши, которой был инъецирован [Tc-99m] Tc-MAA.

[0036] Фиг. 4 представляет собой график, показывающий изменения в интенсивности сигнала флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона комплексов ICG-MAA в зависимости от изменений концентрации ICG и MAA.

[0037] Фиг. 5 представляет собой график, показывающий изменения в интенсивности сигналов флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона комплексов ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-фибрин и ICG-гликольхитозан с течением времени в условиях in vitro.

[0038] Фиг. 6 представляет собой график, показывающий изменения с течением времени в интенсивности сигналов флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона комплексов ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-фибрин и ICG-гликольхитозан, которые инъецируют в «голых» мышей.

[0039] Фиг. 7 представляет собой изображения, показывающие форму каждого комплекса, наблюдаемого в подбрюшине свиньи или куриной грудке, в которые был инъецирован комплекс ICG-MAA-фибрин или комплекс ICG-MAA.

[0040] Фиг. 8 представляет собой флуоресцентное изображение, показывающее уровни диффузии комплекса ICG-MAA-фибрин и комплекса ICG-MAA, инъецированных в мышечную ткань, с течением времени.

[0041] Фиг. 9 представляет собой флуоресцентное изображение, показывающее уровни диффузии комплекса ICG-MAA-фибрин и комплекса ICG-MAA, инъецированных в «голых» мышей, с течением времени.

[0042] Фиг. 10 представляет собой график, показывающий уровень мечения комплекса, в котором MAA связан с Tc-99m.

[0043] Фиг. 11 представляет собой изображение, показывающее изменения во флуоресцентном сигнале каждого метящего средства у мышей с течением времени, при этом мышам, соответственно, вводятся [Tc-99m]Tc-ICG-MAA и [Tc-99m]Tc-ICG-HAS, которые представляют собой метящие средства для ракового поражения.

[0044] Фиг. 12 представляет собой изображение, показывающее результат сравнения уровней диффузии желатина и желатиновой губки с течением времени.

[0045] Фиг. 13 представляет собой изображение, показывающее изменения в интенсивности сигналов флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона метящего средства твердого типа и контроля ICG-спонгостан с течением времени, при этом метящее средство твердого типа содержит связанную с радиоактивным изотопом катушку золотой фольги, ICG, MAA и желатиновую губку.

[0046] Фиг. 14 представляет собой изображение, показывающее интенсивность сигналов флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона метящего средства твердого типа, ICG-спонгостана и ICG желатина, которые вводятся в «голых» мышей, с течением времени.

СПОСОБ ВЫПОЛНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0047] Ниже настоящее изобретение будет описано более подробно в отношении следующих примеров. Однако, эти примеры предназначены только для того, чтобы иллюстративно описать настоящее изобретение, и объем изобретения ими не ограничивается.

[0048]

[0049] ПРИМЕР 1: СОЗДАНИЕ МАКРОАГРЕГАТА АЛЬБУМИНА (MAA)

[0050]

[0051] 10 мл 2%-ого человеческого сывороточного альбумина, разбавленного в 0,1М ацетатном буфере (pH 5,4), были смешаны с 50 мг хлорида олова, и энергично размешаны в течение 10 минут при комнатной температуре, после чего следовало дополнительное перемешивание в течение 20 минут при 70°C для реакции. После того, как реакция была остановлена, реагент был охлажден. Затем было добавлено 0,35 мл 20%-го человеческого сывороточного альбумина, и продукт реакции размешивался снова в течение 10 минут. Реагент был распределен аликвотами по стеклянным пробиркам (2 мг для каждой, на основании MAA) и лиофилизирован с целью приготовления тиолового MAA.

[0052]

[0053] ПРИМЕР 2: СВЯЗАННЫЙ С РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ КОМПЛЕКС MAA И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО ДОСТУПНОСТИ

[0054]

[0055] 2 мл [Tc-99m]Tc0₄ ^- (10 мКи/мл), который является радиоактивным изотопом, было добавлены к тиоловому MAA, созданному в примере 1. Полученная в результате смесь реагировала в течение 10 минут при комнатной температуре с целью создания связанного с радиоактивным изотопом комплекса MAA ([Tc-99m]Tc-MAA). В целях исследования, связывается ли радиоактивный изотоп нормально с MAA, комплекс наносился на мгновенную тонкослойную хроматографию (ITLC), и проявлялся посредством применения ацетона в качестве растворителя, и в результате было обнаружено, что по меньшей мере 99% тиолового MAA связывается с радиоактивным изотопом, в результате чего формируется комплекс.

[0056] Кроме того, в целях исследования того, может ли созданный комплекс применяться в качестве метящего средства in vivo, эксперимент выполнялся следующим образом: созданный [Tc-99m] Tc-MAA 1 мКи/50мл был введен в левую ягодицу «голой» мыши. Гамма-изображение «голой» мыши было получено посредством применения устройства для животных SPECT (NanoSPECT, Bioscan) непосредственно после инъецирования (0 ч) и спустя 20 часов после инъецирования (20 ч) (фиг. 3). Фиг. 3 представляет собой гамма-изображение, показывающее, изменяется ли [Tc-99m] Tc-MAA или нет с течением времени в «голой» мыши, которой был инъецирован [Tc-99m] Tc-MAA. Как показано на фиг. 3, было обнаружено, что сразу после (0 ч) и спустя 20 часов после (20 ч) инъекции [Tc-99m] Tc-MAA продолжал постоянно оставаться в подвергнутом инъекции поражении.

[0057]

[0058] ПРИМЕР 3: ПРИГОТОВЛЕНИЕ СВЯЗАННОГО С ИНДОЦИАНИНОМ ЗЕЛЕНЫМ ОСНОВАННОГО НА MAA МЕТЯЩЕГО СРЕДСТВА (ICG) И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО ДОСТУПНОСТИ

[0059]

[0060] Так как ожидалось, что комплекс, в котором MAA связан с индоцианином зеленым (ICG), способным генерировать флуоресцентный сигнал в ближнем инфракрасном диапазоне, может применяться в качестве средства мечения, устойчиво действующего в естественных условиях, был создан комплекс и была исследована его доступность в качестве метящего средства in vivo.

[0061]

[0062] ПРИМЕР 3-1: ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОШЕНИЯ СМЕСИ ICG И MAA

[0063]

[0064] Для того, чтобы подготовить основанное на MAA метящее средство, демонстрирующее флуоресценцию в ближнем инфракрасном диапазоне, индоцианин зеленый, демонстрирующий флуоресценцию в ближнем инфракрасном диапазоне, была связан с созданным MAA с целью создания комплекса (ICG-MAA).

[0065] Для того, чтобы определить отношение смеси MAA и ICG, которое позволяет получить самую сильную флуоресценцию в ближнем инфракрасном диапазоне, проводилась реакция ICG в концентрации от 1,3 до 1032 мкM и MAA в концентрации от 0 до 11,5 мг/мл в различных отношениях при создании соответствующего комплекса ICG-MAA. Затем была измерена интенсивность сигнала флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона, сгенерированного каждым созданным комплексом ICG-MAA (таблица 1 и фиг. 4). Фиг. 4 представляет собой график, показывающий изменения в интенсивности сигнала флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона комплекса ICG-MAA в зависимости от изменений концентрации ICG и MAA.

[0066]

[Таблица 1] Интенсивность сигнала флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона комплекса ICG-MAA в зависимости от изменения концентрации ICG и MAA
ICG (мкM)	MAA (мг/мл)
ICG (мкM)	0	0,23	2,3	11,5
1,3	18	42	238	530
3,9	120	52	424	931
6,5	212	38	456	979
9,0	289	32	444	942
12,9	363	27	342	915
25,8	466	12	255	563
38,7	425	8	162	366
51,6	399	7	101	280
64,5	374	13	75	244
77,4	332	16	55	182
103	289	23	39	94
258	139	30	16	60
516	71	13	2	20
774	39	6	2	9
1032	30	6	1	4

[0067]

[0068] Как показано в таблице 1 и на фиг. 4, когда MAA не обрабатывался, 25,8 мкМ ICG показали самое высокое значение интенсивности сигнала флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона. Когда обрабатывалось 0,23 мг/мл MAA, 3,9 мкM ICG показали самое высокое значение интенсивности сигнала флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона. Когда обрабатывалось 2,3 мг/мл MAA, 6,5 мкМ ICG показали самое высокое значение интенсивности сигнала флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона. Когда обрабатывалось 11,5 мг/мл MAA, 6,5 мкM ICG также показали самое высокое значение интенсивности сигнала флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона.

[0069] Для инъецирования in vivo концентрация была изменена из-за диффузии in vivo, и т.д., в результате чего точная концентрация не могла быть определена в момент инъецирования. Однако, было экспериментально обнаружено, что 65 мкM, что является 10-кратной концентрацией, показала самое высокое значение флуоресценции.

[0070]

[0071] ПРИМЕР 3-2: СОЗДАНИЕ СВЯЗАННОГО С ICG КОМПЛЕКСА

[0072]

[0073] Посредством использования результатов, полученных из примеров, были созданы различные ICG-связанные комплексы.

[0074] Сначала, 65 мкМ ICG было добавлено и реагировало с человеческим сывороточным альбумином (HSA), гликольхитозаном или MAA, с целью создания соответствующих комплексов (ICG-HSA, ICG-MAA и ICG-гликольхитозан).

[0075] ICG-MAA, созданный таким образом, был смешан и реагировал со смесью 1 и смесью 2 с целью создания комплекса ICG-MAA-фибрин, с которым был связан фибрин коагуляции крови, при этом смесь 1 содержала тробин и апротинин, и смесь 2 содержала фибриноген и CaCl₂. Уровни смешивания фибриногена, апротинина, тробина и CaCl₂ составляли 25 мг/мл, 500 KIU/мл, 250 IU/мл и 4 мг/мл, соответственно.

[0076]

[0077] ПРИМЕР 3-3: ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БЛИЖНЕГО ИНФРАКРАСНОГО ДИАПАЗОНА ICG-СВЯЗАННОГО КОМПЛЕКСА

[0078]

[0079] Вследствие характеристик применения, поскольку метящая композиция для ткани, имеющая более длительный промежуток времени испускания флуоресценции, является выгодной при использовании в операционной, когда композиция инъецируется в живую ткань и помечает место инъецирования, была исследована стабильность флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона in vitro или in vivo для 4 комплексов, созданных выше.

[0080]

[0081] ПРИМЕР 3-3-1: ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ IN VITRO

[0082]

[0083] Интенсивность флуоресцентных сигналов ближнего инфракрасного диапазона, испускаемых четырьмя комплексами, созданными в примере 3-2, в условиях in vitro, измерялась в течение 800 часов (фиг. 5). Фиг. 5 представляет собой график, показывающий изменения в интенсивности сигналов флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона комплексов ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-фибрин и ICG-гликольхитозана с течением времени в условиях in vitro. Как показано на фиг. 5, было обнаружено, что комплексы, содержащие ICG-MAA, показали относительно высокий уровень интенсивности и стабильности флуоресцентных сигналов ближнего инфракрасного диапазона. Кроме того, можно обнаружить, что ICG-MAA-фибрин показал относительно высокий уровень интенсивности и стабильности флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне по сравнению с ICG-MAA.

[0084]

[0085] ПРИМЕР 3-3-2: ИССЛЕДОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ IN VIVO

[0006]

[0087] 50 мл четырех комплексов, созданных в примере 3-2, были, соответственно, инъецированы в бедро «голых» мышей. Затем, изменения во флуоресцентных сигналах ближнего инфракрасного диапазона, сгенерированных в каждой «голой» мыши, были измерены посредством применения устройства Xenogen Lumina в течение 3 недель (фиг. 6). Фиг. 6 представляет собой изображение, показывающее изменения с течением времени в интенсивности сигналов флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона комплексов ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-фибрин и ICG-гликольхитозана, инъецированных в «голых» мышей. Как показано на фиг. 6, высокие уровни флуоресцентных сигналов ближнего инфракрасного диапазона были показаны во всех четырех комплексах сразу после инъецирования. Однако, после одной недели, флуоресцентные сигналы ближнего инфракрасного диапазона, показанные в комплексах ICG-HSA и ICG-гликольхитозан, быстро уменьшались. После трех недель практически не было обнаружено флуоресцентного сигнала ближнего инфракрасного диапазона в комплексах ICG-HSA и ICG-гликольхитозан. В отличие от этого, было обнаружено, что флуоресцентные сигналы ближнего инфракрасного диапазона, показанные в комплексах ICG-MAA и ICG-MAA-фибрин, остались на определенном уровне после трех недель.

[0088]

[0089] На основании результатов примеров можно обнаружить, что комплексы, содержащие ICG-MAA, показали относительно высокий уровень интенсивности и стабильности сигнала ближнего инфракрасного диапазона in vitro и in vivo. Ожидалось, что, хотя использовался один и тот же флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона, будут получены различные результаты, поскольку комплексы, которые не содержали ICG-MAA, были бы разложены и поглощены в теле в пределах относительно короткого периода времени. В частности, можно обнаружить, что ICG-MAA-фибрин продемонстрировал очень выгодное свойство в качестве метящего средства для ракового поражения, посредством демонстрации высокой стабильности поддержания формы вследствие добавленного фибрина коагуляции крови помимо MAA.

[0090]

[0091] ПРИМЕР 3-4: СРАВНЕНИЕ ДОСТУПНОСТИ КОМПЛЕКСА ICG-MAA-ФИБРИН И КОМПЛЕКСА ICG-MAA

[0092]

[0093] Так как было обнаружено, что комплекс ICG-MAA-фибрин и комплекс ICG-MAA, которые содержат ICG-MAA, продемонстрировали очень выгодное свойство в качестве метящего средства для ракового поражения на основании результатов примера 3-3, было проведено сравнение эффективности каждого комплекса в качестве метящего средства для ракового поражения.

[0094]

[0095]ПРИМЕР 3-4-1: СРАВНЕНИЕ ИНЪЕЦИРОВАННЫХ ФОРМ В ТКАНИ

[0096]

[0097] Каждый комплекс был инъецирован в куриную грудку, которая представляет собой мышечный тип ткани, или свиную подбрюшину, которая представляет собой ткань жирового типа. Затем, ткань, в которую проводилось инъецирование, анализировалась на толщине 1-2 мм. После этого, проводилось сравнение форм каждого комплекса, наблюдаемого в каждой анализируемой ткани (фиг. 7). Фиг. 7 представляет собой изображения, показывающие форму каждого комплекса, наблюдаемого в свиной подбрюшине или куриной грудке, в которые был введен комплекс ICG-MAA-фибрин или комплекс ICG-MAA. Как показано на фиг. 7, было обнаружено, что возникает феномен, заключающийся в том, что когда был инъецирован комплекс ICG-MAA-фибрина, комплекс был сразу же коагулирован в ткани и поддерживал овальную форму, однако, когда был инъецирован комплекс ICGMAA, комплекс диффундировал в мышечную ткань наряду с мышечным волокном, и комплекс диффундировал в жировой ткани наряду с меткой иглы.

[0098]

[0099] Таким образом, можно обнаружить, что, когда ICG-MAA-фибрин, который коагулирован с фибрином коагуляции крови, был инъецирован в живую ткань, комплекс меньше диффундировал, чем ICG-MAA, даже в плотной соединительной ткани, и, таким образом, было возможно более мягко пометить поражение.

[00100]

[00101] ПРИМЕР 3-4-2: СРАВНЕНИЕ УРОВНЯ ДИФФУЗИИ В ТКАНИ С ТЕЧЕНИЕМ ВРЕМЕНИ

[00102]

[00103] Ожидалось, что, когда каждый комплекс, инъецированный в живую ткань, был диффундирован в ткани, область, демонстрирующая флуоресцентный сигнал ближнего инфракрасного диапазона, стала расширяться, в результате чего роль мягкого мечения области поражения могла быть ограничена.

[00104] В целях изучения этого, комплекс ICG-MAA-фибрин и комплекс ICG-MAA были введены в куриную грудку, и уровни диффузии флуоресцентных сигналов ближнего инфракрасного диапазона, демонстрируемых каждым комплексом, сравнивались в момент инъецирования и спустя два дня после инъецирования (фиг. 8). Фиг. 8 представляет собой флуоресцентное изображение, показывающее уровни диффузии комплекса ICG-MAA-фибрина и комплекса ICG-MAA, инъецированных в мышечную ткань, с течением времени. Как показано на фиг. 8, можно обнаружить, что коагуляция происходила после инъецирования комплекса ICG-MAA-фибрина, в результате чего ICG-MAA был заблокирован в фибрине, и, таким образом, даже по прошествии времени, приращения в размере области, демонстрирующей флуоресцентный сигнал ближнего инфракрасного диапазона, вызванный диффузией, не происходило, однако область демонстрации флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне для комплекса ICG-MAA увеличивалась с течением времени.

[00105]

[00106] ПРИМЕР 3-4-3: СРАВНЕНИЕ УРОВНЯ ДИФФУЗИИ В МЫШИ С ТЕЧЕНИЕМ ВРЕМЕНИ

[00107]

[00108] В целях изучения того, могут ли результаты примеров быть применены в естественных условиях, «голой» мыши был подкожно инъецирован комплекс ICG-MAA-фибрин или комплекс ICG-MAA. Затем, уровни диффузии флуоресцентных сигналов ближнего инфракрасного диапазона, демонстрируемые каждым комплексом, были измерены посредством применения устройства Xenogen Lumina в момент инъецирования и спустя два дня после инъецирования (фиг. 9). Фиг. 9 представляет собой изображение, показывающее уровни диффузии комплекса ICG-MAA-фибрин и комплекса ICG-MAA, инъецированных в «голых» мышей, с течением времени. Как показано на фиг. 9, аналогично результату фиг. 8, можно обнаружить, что коагуляция происходила после инъецирования комплекса ICG-MAA-фибрин, в результате чего ICG-MAA был заблокирован в фибрине, и, таким образом, даже по прошествии времени, приращения в размере области, демонстрирующей флуоресцентный сигнал ближнего инфракрасного диапазона, вызванный диффузией, не происходило, однако область демонстрации флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне для комплекса ICG-MAA увеличивалась с течением времени.

[00109]

[00110] Таким образом, было обнаружено, что комплекс ICG-MAA-фибрин показал низкий уровень диффузии с течением времени, и он также продемонстрировал самую выдающуюся флуоресценцию и стабильность в естественных условиях, таким образом, демонстрируя выгодное свойство в качестве метящего средства для ракового поражения.

[00111]

[00112] ПРИМЕР 4: ПРИГОТОВЛЕНИЕ [Tc-99m]Tc-ICG-MAA И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ

[00113]

[00114] ПРИМЕР 4-1: ПРИГОТОВЛЕНИЕ [Tc-99m]Tc-ICG-MAA

[00115]

[00116] К MAA, созданному в примере 1, был добавлен [Tc-99m]Tc04^- 20 мКи/2 мл. Затем, в полученной в результате смеси происходила реакция в течение 10 минут при комнатной температуре. После того, как реакция была остановлена, было добавлено 42 мкг/мкл индоцианина зеленого (ICG), после чего проводилась дополнительная реакция в течение 10 минут при комнатной температуре для приготовления комплекса, в котором MAA был помечен флуоресцентным пигментом ближнего инфракрасного диапазона, то есть, ICG и радиоактивного изотопа, то есть, Tc-99m.

[00117] В целях изучения того, был ли созданный комплекс нормально помечен Tc-99m, комплекс был нанесен на мгновенную тонкослойную хроматографию (ITLC) и проявлен с применением ацетона в качестве растворителя (фиг. 10). Фиг. 10 представляет собой график, показывающий уровень мечения комплекса, в котором MAA был связан с Tc-99m. Как показано на фиг. 10, можно обнаружить, что уровень мечения составлял по меньшей мере 99%. Кроме того, флуоресцентный сигнал ближнего инфракрасного диапазона ICG был измерен посредством применения флуоресцентного устройства Safire II (RFU 7612).

[00118] Таким образом, было обнаружено, что комплекс [Tc-99m] Tc-ICG-MAA может быть приготовлен посредством применения MAA.

[00119]

[00120] ПРИМЕР 4-2: ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ [Tc-99m] Tc-ICG-MAA

[00121]

[00122] С точки зрения уровня разбавления в живых тканях с течением времени, комплекс по настоящему изобретению сравнивался с типичным метящим средством для ракового поражения с целью исследования того, может ли комплекс по настоящему изобретению быть применен в качестве метящего средства для ракового поражения.

[00123]

[00124] Конкретно, комплекс ([Tc-99m] Tc-ICG-HSA), в котором человеческий сывороточный альбумин был помечен флуоресцентным пигментом ближнего инфракрасного диапазона, то есть, ICG, и радиоактивным изотопом, то есть, Tc-99m, был приготовлен в качестве типичного средства мечения для ракового поражения.

[00125] 1 мКи/50 мкл созданного комплекса ([Tc-99m] Tc-ICG-HSA) было инъецировано в правую ягодицу «голой» мыши, и 1 мКи/50 мкл комплекса, созданного в примере 4-1 ([Tc-99m] Tc-ICG-MAA), было инъецировано в левую ягодицу «голой» мыши. Затем, гамма-изображение «голой» мыши было получено посредством применения устройства SPECT для животных (NanoSPECT, Bioscan) сразу после инъецирования (0 ч) и спустя 20 часов после инъецирования (20 ч) (фиг. 11). Фиг. 11 представляет собой изображение, показывающее изменения во флуоресцентных сигналах с течением времени для каждого метящего средства у мышей, которым был введен, соответственно [Tc-99m] Tc-ICG-MAA и [Tc-99m] Tc-ICG-HSA, которые представляют собой метящие средства для ракового поражения. Как показано на фиг. 11, было обнаружено, что сразу после инъецирования (0 ч), оба комплекса оставались только в поражении, в которое были инъецированы, однако, через 20 часов после инъецирования (20 ч), [Tc-99m] Tc-ICG-HSA диффундировал в смежные ткани, в результате чего флуоресцентный сигнал стал более слабым, в то время как [Tc-99m] Tc-ICG-MAA продолжал постоянно оставаться в поражении, в которое он был инъецирован.

[00126]

[00127] ПРИМЕР 5: ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОСНОВАННОГО НА MAA МЕТЯЩЕГО СРЕДСТВА С ПРИМЕНЕНИЕМ ЖЕЛАТИНА И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО ДОСТУПНОСТИ

[00128]

[00129] Так как ожидалось, что метящее средство, которое действует в естественных условиях более стабильным образом, может быть создано посредством использования желатиновой губки, которая демонстрирует высокую совместимость в естественных условиях, во время приготовления комплекса, в котором MAA связан с индоцианином зеленым (ICG), способным к генерации флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне; и одновременно демонстрирует стабильность (что означает, что комплекс не является легко разлагаемым в естественных условиях), был создан комплекс с применением желатиновой губки и исследовалась его доступность в естественных условиях в качестве метящего средства.

[00130]

[00131] ПРИМЕР 5-1: ПРИГОТОВЛЕНИЕ СВЯЗАННОЙ С РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ КАТУШКИ ЗОЛОТОЙ ФОЛЬГИ

[00132]

[00133] К катушке с металлическим материалом (в клиническом анализе), которую можно легко увидеть на снимках КТ (рентгеновских) (например, UltraClip), было добавлены 1,8 мкл 0,44M HAuCl₄, 3 г CTAB, 2,5 г бутанола и 1,0 г октана, чтобы позолотить поверхность с целью получения катушки золотой фольги. [I-125] NaI 100 мкКи было добавлены к катушке золотой фольги, и продукт реакции реагировал в течение 5 минут при комнатной температуре с перемешиванием с целью получения катушки золотой фольги, с которой был связан радиоактивный изотоп.

[00134]

[00135] ПРИМЕР 5-2: ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЖЕЛАТИНОВОЙ ГУБКИ

[00136]

[00137] 10 мкл дистиллированной воды было добавлено к 0,6 г высушенной пластинке желатина, и продукт реакции нагревался при 60°C, пока желатин не был полностью растворен, чтобы получить раствор желатина. Раствор желатина выдерживался при 4°C в течение одного часа, чтобы подготовить желатин. Подготовленный желатин нагревался при 160°C в течение 3 часов, чтобы приготовить желатиновую губку, содержащую перекрестную структуру. Перекрестная структура была сформирована посредством формирования изопептидной связи, образованной между аминной группой боковой цепи лизина и карбоксильной группой боковой цепи глутамата или аспартата, присутствующих в желатине при высокой температуре.

[00138]

[00139] В целях изучения того, какой материал из приготовленного желатина и желатиновой губки демонстрирует стабильность в естественных условиях, желатин и желатиновая губка были погружены в дистиллированную воду и выдержаны в течение 24 часов, при этом измерялась их растворимость (фиг. 12). Фиг. 12 представляет собой изображение, показывающее результат сравнения уровней растворения желатина и желатиновой губки с течением времени. Как показано на фиг. 12, было обнаружено, что желатин, не имеющий перекрестных структур, был полностью растворен в воде в течение одного дня, в то время как желатиновая губка, имеющая перекрестную структуру, не была растворена в воде после одного дня.

[00140]

[00141] Таким образом, можно обнаружить, что желатиновая губка, а не желатин, продемонстрировала стабильность в естественных условиях.

[00142]

[00143] ПРИМЕР 5-3: ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОСНОВАННОГО НА MAA МЕТЯЩЕГО СРЕДСТВА ТВЕРДОГО ТИПА ПОСРЕДСТВОМ ПРИМЕНЕНИЯ ЖЕЛАТИНОВОЙ ГУБКИ И ОЦЕНКА ЕГО ДОСТУПНОСТИ

[00144]

[00145] Метящее средство твердого типа было создано посредством применения MAA, созданного в примере 1, связанной с радиоактивным изотопом катушки золотой фольги, созданной в примере 5-1, желатиновой губки, созданной в примере 5-2, и ICG, и были измерены характеристики флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне, сгенерированные этим средством.

[00146]

[00147] ПРИМЕР 5-3-1: КОНСТРУКЦИЯ МЕТЯЩЕГО СРЕДСТВА ТВЕРДОГО ТИПА

[00148]

[00149] MAA, созданный в примере 1, был смешан с 6,5, 65 или 650 мкМ ICG. Затем, связанная с радиоактивным изотопом катушка золотой фольги, созданная в примере 5-1, была добавлена к смеси с целью получения смеси. Желатин был добавлен к смеси, и полученная в результате смесь нагревалась при 160°C в течение 3 часов для приготовления метящего средства твердого типа, содержащего связанную с радиоактивным изотопом катушку золотой фольги, ICG, MAA и желатиновую губку (губка радиозолотойкатушки/EB-ICG-MAA-желатин).

[00150]

[00151] Каждое созданное метящее средство твердого типа было погружено в дистиллированную воду, и оставлено в течение одного дня, при этом интенсивность флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона была измерена сразу после погружения (0 часов), и 8 часов и спустя 24 часа после погружения, и сравнивалась с аналогичными значениями для контроля (фиг. 13). В качестве контроля, был приготовлен ICG-спонгостан и применялся посредством смешивания спонгостана, который является одной из традиционно имеющихся желатиновых губок, с 6,5, 65 или 650 мкM раствора ICG. Фиг. 13 представляет изображение, показывающее изменения в интенсивности сигналов флуоресценции ближнего инфракрасного диапазона для контроля ICG-спонгостана и метящего средства твердого типа, содержащего связанную с радиоактивным изотопом катушку золотой фольги, ICG, MAA и желатиновую губку, с течением времени. Как показано на фиг. 13, при одной и той же концентрации ICG, метящее средство мечения твердого типа продемонстрировало относительно высокий уровень интенсивности флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне по сравнению с контролем. После 8 и 24 часов ICG в контроле диффундировал, в результате чего флуоресцентный сигнал ближнего инфракрасного диапазона был обнаружен в дистиллированной воде сам по себе, в то время как скорость диффузии ICG метящего средства твердого типа была на низком уровне.

[00152] Кроме того, метящие средства мечения твердого типа, которые содержат различные концентрации ICG, соответственно, можно обнаружить, что твердый тип средства мечения, содержащий 650 мкМ ICG, показал высший уровень интенсивности флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне.

[00153]

[00154] ПРИМЕР 5-3-2: СРАВНЕНИЕ УРОВНЯ ДИФФУЗИИ ICG И ИНТЕНСИВНОСТИ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО СИГНАЛА В БЛИЖНЕМ ИНФРАКРАСНОМ ДИАПАЗОНЕ В МЫШИ С ТЕЧЕНИЕМ ВРЕМЕНИ

[00155]

[00156] ICG-желатин, ICG-спонгостан, и каждое метящее средство твердого типа, созданное посредством способа, приведенного в примерах, посредством применения ICG в отличающихся друг от друга концентрациях (6,5, 65 или 650 мкМ), были подкожно введены в «голых» мышей. Каждая «голая» мышь была исследована в устройстве Xenogen Lumina непосредственно после инъецирования (0 ч), или через один день (1 день), одну неделя (1 неделю) или три недели (3 недели) после инъецирования, чтобы измерить интенсивность флуоресцентных сигналов ближнего инфракрасного диапазона, демонстрируемых в каждом месте инъецирования (фиг. 14). Фиг. 14 представляет собой изображение, показывающее интенсивность флуоресцентных сигналов ближнего инфракрасного диапазона метящего средства твердого типа, ICG-спонгостана и ICG-желатина, инъецированных в «голых» мышей, с течением времени. Как показано на фиг. 14, для метящего средства твердого типа по настоящему изобретению, флуоресцентный сигнал ближнего инфракрасного диапазона был обнаружен после 3 недель, однако, для ICG-спонгостана и ICG-желатина, практически не было обнаружено флуоресцентного сигнала ближнего инфракрасного диапазона после 3 недель. Кроме того, когда метящее средство твердого типа по настоящему изобретению было инъецировано, можно обнаружить, что высокий уровень флуоресцентного сигнала в ближнем инфракрасном диапазоне был обнаружен в случае, когда высокий уровень концентрации ICG использовался во время подготовки метящего средства твердого типа.

[00157]

[00158] Обобщая сказанное, можно обнаружить, что комплекс по настоящему изобретению обладает выгодным свойством в качестве метящего средства, поскольку комплекс остается в поражении, в которое был инъецирован, в течение длительного периода времени, в результате чего уровень обнаружения микропоражения был высоким; и также точность иссечения поражения превосходна вследствие мощного сигнала.

ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ

[00159] Метящая композиция для ракового поражения по настоящему изобретению связывается с раковым поражением, чтобы обеспечить возможность обнаружения размера и места ракового в режиме реального времени во время хирургии, в результате чего частота успеха хирургической операции ракового поражения будет увеличена, и избыточная потеря нормальных тканей может быть предотвращена. Следовательно, композиция может быть широко применена для эффективной терапии против рака.

Claims

1. Метящая композиция для непосредственного введения в раковую ткань для идентификации места и размера ракового поражения в режиме реального времени во время хирургического вмешательства по удалению рака, содержащая комплекс, в котором макроагрегат альбумина (МАА) связан с пигментом для окрашивания живых тканей, радиоактивным изотопом или их комбинацией, где МАА дополнительно связан с фибрином.

2. Композиция по п. 1, в которой пигмент для окрашивания живых тканей представляет собой видимый пигмент или флуоресцентный пигмент.

3. Композиция по п. 2, в которой видимый пигмент выбран из группы, состоящей из природного красного, нильского синего, бисмарка коричневого, литиевого кармина, трипанового синего, януса зеленого, метилового фиолетового, о-ламина, малахитового зеленого, сафранина, эозина, конго красного, эритроцина, нигрозина, гематоксилина альцианового синего, анилинового синего, светло-зеленого и комбинаций указанного.

4. Композиция по п. 2, в которой флуоресцентный пигмент представляет собой флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона.

5. Композиция по п. 4, в которой флуоресцентный пигмент ближнего инфракрасного диапазона представляет собой индоцианин зеленый (ICG).

6. Композиция по п. 1, в которой радиоактивный изотоп выбран из группы, состоящей из Н-3, С-14, Р-32, S-35, С1-36, Cr-51, Со-57, Со-58, Cu-64, Fe-59, Y-90, I-124, I-125, Re-186, I-131, Тс-99m, Мо-99, Р-32, CR-51, Са-45, Са-68 и их комбинации.

7. Композиция по п. 1, в которой комплекс заключен в желатин или желатиновую губку.

8. Композиция по п. 7, в которой желатиновая губка представляет собой конструкцию, в которой изопептидная связь образуется между аминной группой боковой цепи лизина и карбоксильной группой боковой цепи глутамата или аспартата, присутствующих в желатине.

9. Композиция по п. 1, в которой рак представляет собой солидный рак.

10. Композиция по п. 10, в которой солидный рак выбран из группы, состоящей из рака предстательной железы, рака молочной железы, рака матки, рака кожи, рака шейки матки, рака легких, опухоли головного мозга, желудочно-кишечной опухоли, рака печени, саркомы мягкой ткани, лимфомы и комбинации указанного.

11. Метящая композиция для непосредственного введения в раковую ткань для идентификации места и размера ракового поражения в режиме реального времени во время хирургического вмешательства по удалению рака, содержащая комплекс, в котором МАА связан с (а) пигментом для окрашивания живых тканей, радиоактивным изотопом или их комбинацией; и (b) фибрином, при этом комплекс заключен в желатиновой губке.

12. Способ предоставления информации о месте и размере ракового поражения, при этом способ включает:

(a) непосредственное введение композиции по любому из пп. 1-11 в раковую ткань, которая должна быть удалена у субъекта; и

(b) идентификацию сигнала, выбранного из группы, состоящей из цвета, флуоресценции в ближней инфракрасной области, радиоактивности и их комбинации, полученного от раковой ткани в режиме реального времени во время хирургического вмешательства по удалению рака.

13. Набор для идентификации места и размера ракового поражения в режиме реального времени во время хирургического вмешательства по удалению рака, содержащий метящую композицию по любому из пп. 1-11.