WO2014104605A1 - 신규한 암 병변 표지용 조성물 - Google Patents

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maa
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김석기
강세훈
김석원
정소연
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Definitions

  • the present invention relates to a novel composition for labeling cancer lesions, and more particularly, the present invention includes a complex in which a dye for biological tissue staining, a radioisotope, or a combination thereof is bound to a macroaggregated albumin (MAA).
  • a composition for labeling cancer lesions a method for providing information on the location of cancer lesions using the composition for labeling cancer lesions, a kit for labeling cancer lesions comprising the composition for labeling cancer lesions and a composition for labeling cancer lesions It relates to a complex in which the dye for biological tissue stain is bound to the corresponding albumin.
  • the location of the patient's micro lesions is confirmed by ultrasound, mammography, or magnetic resonance imaging before the operation, the location of the identified lesion is marked, and the tissue of the marked area is removed.
  • a method of drawing on the surface of the skin, using a wire, or injecting a black pigment such as charcoal is used.
  • the method of drawing with a pen on the skin to indicate the location of the lesion is that the shape of the breast changes a lot in the operating room unlike when diagnosed due to the characteristics of very flexible breast tissue.
  • the display is insufficient only by marking on the surface of the skin, which can be easily used, but has a disadvantage of low accuracy.
  • the use of wire to pierce breast lesions requires the wire to be inserted vertically into the skin surface but must be inserted obliquely as it may affect the ultrasound probe, and the location of the wire is the movement of the breast. Due to the fact that it can move according to the lower accuracy than expected, the inserted wire interferes with the surgery, there is a disadvantage that the procedure to remove the insertion portion of the wire must be performed additionally.
  • the method of injecting a pigment such as charcoal has the advantage that the injected pigment binds to the lesion and accurately marks the location of the lesion, whereas in the case of a deep breast, black pigment cannot be identified from the outside.
  • the surgical site may be contaminated by pigments. This disadvantage is also equally problematic in surgical operations to remove cancerous tissues other than breast cancer.
  • the marker including the corresponding albumin combined with the pigment for biotissue staining can be effectively adsorbed to the lesion of the cancer to accurately label the location of the lesion, the pigment in real time After confirming that the scope of the lesion to be removed can be accurately identified, and completed the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a composition for labeling cancer lesions comprising a complex in which a dye for biological tissue staining, a radioisotope, or a combination thereof is bound to a macroaggregated albumin (MAA).
  • MAA macroaggregated albumin
  • Another object of the present invention to provide a method for providing information on the location of cancer lesions using the composition for labeling cancer lesions.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for labeling cancer lesions comprising the composition for labeling cancer lesions.
  • Still another object of the present invention is to provide a complex in which a dye for biological tissue dye is combined with corresponding albumin included in the cancer lesion labeling composition.
  • the present invention provides a composition for labeling cancer lesions comprising a complex in which a dye for biological tissue staining, a radioisotope or a combination thereof is bound to a macroaggregated albumin (MAA).
  • the cancer labeled by the composition is not particularly limited as long as it contains a tissue that can be fixed by penetrating the MAA, but is preferably a solid cancer that can be fixed by penetrating the MAA in the tissue, for example, the prostate Cancer, breast cancer, uterine cancer, skin cancer, cervical cancer, lung cancer, brain tumor, gastrointestinal tumor, liver cancer, soft tissue sarcoma, lymphoma and the like.
  • the term "macroaggregated albumin (MAA)” refers to protein particles having a diameter of 10 to 50 ⁇ m prepared by heating and coagulating human serum albumin, compared with human serum albumin having a diameter of less than 10 nm. The structure and physical properties are different. When the MAA is injected intravenously, it shows a characteristic that can be retained in the lung capillary tube of about 8 ⁇ m and cause microembolization. Using this characteristic, the MAA labeled with radioisotope is a lung sinogram (obstruction).
  • Pulmonary blood flow abnormalities such as anterior, pulmonary thrombosis, ocular disease, pneumonia, lung cancer, diagnosis of right / left shant or pulmonary venous hypertension, venous scan (central venous hemodiagnosis at that site), or venous scan (peripheral artery blood flow such as paja disease) Diagnosis).
  • the MAA of the present invention is used as a medium for injecting cancer markers into the cancer lesion tissue and binding the marker to the cancer lesion tissue.
  • the MAA of the present invention can be synthesized using recombinant HSA, and can also be synthesized using non-self-derived HSA. It is also possible to purchase and use a commercially available one.
  • the MAA of the present invention is used as a mediator for binding a marker to cancer lesion tissue by injecting it into a cancer lesion tissue, and the mediator serves to prevent the marker from spreading into the cancer lesion tissue by adsorbing the marker substance. To perform.
  • the term "pigment for dyeing biological tissues” refers to a substance which allows a labeled position to be identified by binding to biological tissues and visually or using a detection tool.
  • the dye for biological tissue dyeing may be a labeling substance that can be used for labeling cancer-generating sites by binding to cancer tissues. Fluorescent dyes that can be detected using equipment such as fluorescent cameras can be used alone or in combination, but are not particularly limited thereto.
  • the "pigmentally identifiable pigment” means a kind of pigment that allows the labeling substance bound to the biological tissue to show the color of the visible light region so that the labeled portion can be visually identified.
  • the visually identifiable pigment is injected into the site where the cancer has occurred to remove the cancer by a surgical method, so that the cancer lesion to be resected can be clearly identified, thereby improving the success rate of cancer surgery. Can be performed.
  • the visually identifiable labeling substance is preferably neutral, nile blue, bismarck brown, lithium carmine, trypan blue, janus green, methyl violet, o-lamin, marragite green, safranin, eosin, congo red, erythrosin , Nigrosine, alkyan blue hematoxylin, aniline blue, light green and the like can be used alone or in combination, but as long as it can achieve the purpose of identifying cancer lesion tissue is not particularly limited.
  • fluorescent dye refers to an organic compound that absorbs light of a certain wavelength and forms an excited state, whereby a light penetration distance is maximized and generates fluorescence capable of minimizing error signals caused by moisture.
  • it may be a near-infrared fluorescent dye, which is an organic compound that generates fluorescence of a near infrared wavelength of preferably 700 nm to 3000 nm, preferably 750 nm to 900 nm. Fluorescence of near-infrared wavelengths generated from the near-infrared fluorescent dye may be photographed or monitored in real time using equipment such as a fluorescent camera and a fluorescence sensing probe (PCT / KR2011 / 009271).
  • the fluorescence of the near-infrared wavelength of the present invention is relatively less absorbed in vivo than other wavelength bands, so that near-infrared radiation generated in a deep region of the living body can be detected outside of the body.
  • the near-infrared region fluorescent dye is injected into the site where the cancer is generated to remove the cancer by a surgical method, so that the lesion site of the cancer can be accurately identified before the incision, thereby improving the success rate of the cancer surgery. It can play a role.
  • the location of the lesion can be detected in vitro before the incision is made to confirm the direct lesion, thereby enabling rapid and accurate cancer surgery to be performed.
  • the near-infrared fluorescent dye may preferably be indocyanine green and the like, and may be included in the scope of the present invention as long as it is a near-infrared fluorescent dye usable to the human body.
  • the complex with the near-infrared fluorescent dye bound to the MAA exhibits the superior stability and accuracy of the detected fluorescence signal compared to the complex with the near-infrared fluorescent dye combined with another substance known to accumulate in the tumor, and thus, microscopic lesions may be found.
  • the rate can be high, and the accuracy of lesion resection can be improved.
  • indocyanine green refers to a dye for fluorescence imaging in the near-infrared region widely used in the biological or medical field, and disintegrates or disappears after an hour after being injected into the human body. Fluorescent dyes that can be used in the human body are advantageous for clinical application. Indeed, cases of indocyanine green application to humans have been reported in several papers, and have been reported to be clinically safe for use in 18 breast cancer patients, for example (T. Kitai, et al., Breast Cancer, 12: 211-215, 2005).
  • the adsorption coupling of the near-infrared fluorescent dye may be achieved through the step of mixing the near-infrared fluorescent dye with the MAA of the present invention.
  • a suitable mixing ratio for preparing a complex having a high near-infrared fluorescence signal in the preparation of the ICG-coupled complex (ICG-MAA) to the MAA is 3.9 for a MAA of 0.23 mg / ml. It was confirmed that the ICG of ⁇ M, the ICA of 6.5 ⁇ M for 2.3mg / ml MAA and the ICG of 6.5 ⁇ M for 11.5mg / ml MAA (Table 1 and Figure 4), in vivo when injected in vivo As the concentration changes due to diffusion, it is not possible to determine the exact concentration at the time of injection.
  • the composite produced this way was found that in vitro, and the results confirmed whether representing the stability in the in vivo conditions, in vitro, and indicates the strength and stability of the near infrared fluorescent signal of relatively high levels of both the in vivo conditions (Fig. 5 And FIG. 6).
  • the term "radioisotope” refers to an element having the same atomic number but different atomic weights and capable of emitting radiation, and generally uses a property of emitting radioactive attenuation by emitting gamma rays or other subatomic particles, thereby preventing disease. It is also used as an important marker for diagnosis.
  • the radioisotope is injected into a deep-tissue tissue where the fluorescence generated by the near-infrared fluorescent dye is not detected, and the cancer is removed by a surgical method. By accurately identifying the lesion site, it can play a role in improving the success rate of cancer surgery.
  • the radioisotope is not particularly limited as long as it exhibits a property capable of labeling MAA that can bind to cancerous lesions, but preferably H-3, C-14, P-32, S-35, and Cl-36. , Cr-51, Co-57, Co-58, Cu-64, Fe-59, Y-90, I-124, I-125, Re-186, I-131, Tc-99m, Mo-99, P -32, CR-51, Ca-45, Ca-68 and the like, more preferably medically used I-124, I-125, I-131, Cu-64, Tc-99m, Mo- 99, CR-51, Ca-45, Ca-68 and the like, and most preferably Tc-99m can be used.
  • the cancer is not particularly limited, but is not particularly limited as long as it exhibits a characteristic that can be removed by surgical resection, but is not limited to prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, skin cancer, cervical cancer, lung cancer, brain tumor, gastrointestinal tumor, liver cancer, soft tissue sarcoma, It can be most solid cancers, including lymphoma.
  • a radioisotope when the radioisotope [Tc-99m] TcO 4 ⁇ is reacted with the MAA, a radioisotope is conjugated to the MAA in a yield of 99% or more, and these complexes are prepared.
  • the radioisotope is reacted with the radioisotope [Tc-99m] TcO 4 - and the near - infrared fluorescent dye ICG sequentially in the MAA.
  • a near-infrared fluorescent dye-combined complex [Tc-99m] Tc-ICG-MAA) can be prepared (FIG. 10), and the prepared complex can be confirmed injected even after 20 hours in vivo. (FIG. 11).
  • fibrin can be used to enhance the physical properties of the complex.
  • the complex of the present invention is injected into the lesion site in vivo to play a role of clearly identifying the lesion site at the time of surgery by displaying the lesion, such complex in order to smoothly carry out the purpose as the above-described markers Proliferation at the site of injected lesions should be prevented as much as possible. Fibrin can be used as one means to achieve this goal (FIG. 1).
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing that when fibrin is added to a complex including MAA and ICG, tissue retention in vivo of the complex is enhanced by the added fibrin.
  • the fibrin may serve to connect the complexes injected in vivo to each other, thereby preventing the complexes injected into the living body from spreading as much as possible.
  • the complex of the present invention may further comprise fibrin.
  • ICG-MAA-fibrin complex prepared with blood coagulation fibrin (fibrin) was prepared.
  • ICG-MAA ICG-coupled complexes
  • a gelatin sponge may be used as another means for achieving the object of preventing the complex from being diffused in vivo.
  • the complex may be formed to form a structure collected inside the gelatin in an aggregated form. The diffusion of the complex at the site injected by gelatin can be suppressed as much as possible.
  • the gelatin since the gelatin has a disadvantage in that it is easily dissolved in the environment in vivo and the structure may collapse, it may be overcome by using a gelatin sponge instead of gelatin to solve this disadvantage.
  • a gelatin sponge is a structure in which an isopeptide bond is formed between a side chain amine group of lysine and a side chain carboxyl group of glutamate or aspartate by heating the gelatin solution at a high temperature.
  • the gelatin sponge exhibits the same biocompatibility as gelatin but relatively low solubility in water, and thus does not readily dissolve in vivo.
  • the gelatin sponge is used to collect the complex of the present invention in an aggregated form. Forming and injecting the structure into the living body, the gelatin sponge does not dissolve in vivo, so that the injected structure does not collapse, it is possible to more effectively suppress the diffusion of the complex at the injected site.
  • the gelatin solution is heated at 160 ° C. for 3 hours to prepare a gelatin sponge including a cross structure, and the gelatin and gelatin sponges are immersed in distilled water and left for 24 hours. While completely dissolved in distilled water, it was confirmed that the gelatin sponge did not dissolve in water and showed high stability (FIG. 12).
  • the gelatin sponge described above When using the gelatin sponge described above, it may be configured to include near-infrared fluorescent dyes and radioisotopes simultaneously. That is, in the gelatin sponge, a complex in which the ICA is combined with the near-infrared fluorescent dye (MAG) in the MAA or [Tc-99m] Tc in which the radioisotope is the radioisotope in the MAA and the complex in which the ICG is combined with the near infrared fluorescent dye ([Tc] -99m] Tc-ICGMAA) may also be constructed.
  • MAG near-infrared fluorescent dye
  • Tc-99m] Tc-ICGMAA the complex in which the ICG is combined with the near infrared fluorescent dye
  • the gelatin sponge may be manufactured to include a complex of a combination of ICG, which is a near-infrared fluorescent dye (MAG), and a radioisotope in the gelatin sponge, such that the complex and the radioisotope may be separately included.
  • ICG which is a near-infrared fluorescent dye (MAG)
  • MAG near-infrared fluorescent dye
  • the gelatin sponge may further comprise means for more effectively immobilizing the radioisotope in the gelatin sponge.
  • the immobilization means a gold foil coil in which radioisotopes are combined may be used, but the immobilization means is not particularly limited as long as the purpose of immobilizing the radioisotope can be achieved (FIG. 2).
  • the present invention comprises the steps of (a) administering the composition for labeling cancer lesions to lesions of cancer developed in a subject; And (b) identifying a location from which the signal is selected from the group consisting of color, near infrared fluorescence, radiation and combinations thereof, wherein the location of the cancer lesion is provided. do.
  • the term "individual” means a living organism in which cancer may develop and represent a lesion, and to which the complex or composition for cancer lesion labeling of the present invention may be administered.
  • composition for labeling cancer lesions provided by the present invention When the composition for labeling cancer lesions provided by the present invention is administered to a cancerous lesion tissue in vivo, it may bind to the administered cancerous lesion and label the location of the lesion through color, near-infrared fluorescence, radioactivity, or a combination thereof.
  • detecting the marker, the position, size, and the like of the cancer lesion can be detected in real time during surgery, thereby improving accuracy in removing the surgical cancer lesion and preventing excessive loss of normal tissue.
  • the complex contained in the composition of the present invention can remain for a long time in cancer lesions in vivo, compared to the complex in which the dye for biological tissue staining in combination with other substances, so that not only during surgical resection of the cancer lesion, but also surgical The accuracy of cancer lesion resection by the procedure can be easily confirmed.
  • the complex of the present invention is injected into the lesion site, and after several hours, the lesion site can be stably and accurately confirmed during surgery.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing that when fibrin is added to a complex including MAA and ICG, tissue retention in vivo of the complex is enhanced by the added fibrin.
  • Figure 2 is a schematic diagram showing the structure and injection method of the solid-type marker prepared by adding the radioisotope-bound gold foil coil and gelatin in a complex containing MAA and ICG.
  • FIG. 3 is a gamma image photograph showing whether [Tc-99m] Tc-MAA changes over time in nude mice injected with [Tc-99m] Tc-MAA.
  • Figure 4 is a graph showing the change of the near infrared fluorescence signal intensity of the ICG-MAA complex with the change of the concentration of ICG and MAA.
  • Figure 6 is a photograph showing the change in intensity of near-infrared fluorescence signal over time of ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-fibrin and ICGglycol chitosan complex injected into nude mice.
  • Figure 7 is a photograph showing the form of each complex observed in chicken breast or pork belly injected with the ICG-MAA-fibrin complex or ICG-MAA complex.
  • Figure 9 is a fluorescence picture showing the diffusion level over time of the ICG-MAA-fibrin complex and ICG-MAA complex injected in nude mice.
  • FIG. 10 is a graph showing the labeling rate of the complex conjugated with Tc-99m in MAA.
  • Figure 13 is a photograph showing the change in intensity of the near-infrared fluorescence signal over time of the radioactive isotope-bound gold foil coil, ICG, MAA and gelatin sponge and control group ICG-Spongostan.
  • the complex was subjected to instant thin layer chromatography (ITLC) and developed using acetone as a solvent. As a result, more than 99% of thiol MAA is bound to the radioisotope. It was confirmed that the complex was formed.
  • ICG indocyanine green
  • MAA conjugates were expected to be used as markers that stably function in vivo, thus preparing the complexes and their usefulness as in vivo markers. Confirmed.
  • ICG-MAA inocyanine green conjugated complex
  • each ICG-MAA complex was prepared by reacting 1.3-1032 ⁇ M of ICG and 0-11.5 mg / ml of MAA in various ratios. Signal intensity of near-infrared fluorescence appearing in each of the prepared ICG-MAA complex was measured (Table 1 and FIG. 4).
  • Figure 4 is a graph showing the change of the near infrared fluorescence signal intensity of the ICG-MAA complex with the change of the concentration of ICG and MAA.
  • the ICG of 25.8 ⁇ M showed the highest value of near-infrared fluorescence signal intensity when the MAA was not treated, and the 3.9 ⁇ M ICG when the MAA was treated with 0.23 mg / ml.
  • the highest value of near-infrared fluorescence signal intensity was shown, and when 2.3 mg / ml of MAA was treated, 6.5 ⁇ M of ICG showed the highest value of near-infrared fluorescence signal, and when treated with 11.5 mg / ml of MAA.
  • the ICG of 6.5 ⁇ M also showed the highest NIR signal intensity.
  • each complex (ICG-HSA, ICG-MAA and ICG-glycol chitosan) was prepared by adding 65 ⁇ M ICG to human serum albumin (HSA), glycol chitosan or MAA and reacting.
  • HSA human serum albumin
  • MAA glycol chitosan
  • the ICG-MAA- to which blood coagulation (fibrin) is bound. fibrin complexes were prepared.
  • the mixing ratio of fibrinogen, aprotinin, thrombin and CaCl 2 was set to 25 mg / ml, 500 KIU / ml, 250 IU / ml and 4 mg / ml, respectively.
  • composition for tissue labeling is advantageous for use at the operating room when the injection site is labeled by injection into biological tissue and the injection site is longer, and thus the near-infrared fluorescence stability of the four complexes prepared in It was confirmed in vitro or in vivo .
  • Example 3-3-2 in vivo Check stability
  • Example 3-3 It was confirmed from the results of Example 3-3 that the ICG-MAA-fibrin complex and ICG-MAA complex including ICG-MAA exhibited very advantageous properties as cancer lesion markers. Compared.
  • Figure 8 is a fluorescence picture showing the diffusion level over time of the ICG-MAA-fibrin complex and ICG-MAA complex injected into the muscle tissue.
  • the ICG-MAA-fibrin complex is agglomerated after injection, causing the ICG-MAA to be trapped in the fibrin, but the size of the site showing the near infrared fluorescence signal due to diffusion does not increase, whereas ICG-MAA does not increase.
  • the complex was found to increase in size over time with the near infrared fluorescence signal.
  • ICG-MAA-fibrin complex or ICG-MAA complex was injected subcutaneously in nude mice, and from each complex at the time of injection and 2 days after the injection, The diffusion level of the appearing near infrared fluorescence signal was measured using Xenogen Lumina equipment (FIG. 9).
  • Figure 9 is a fluorescence picture showing the diffusion level over time of the ICG-MAA-fibrin complex and ICG-MAA complex injected in nude mice.
  • ICG-MAA-fibrin complex is the size of the site showing the near-infrared fluorescence signal due to diffusion even after time due to the aggregation after ICG-MAA is trapped in the fibrin injection
  • ICG-MAA complex was found to increase the size of the site showing the near infrared fluorescence signal over time.
  • FIG. 10 is a graph showing the labeling rate of the complex conjugated with Tc-99m in MAA. As shown in Figure 10, it was confirmed that the labeling rate is more than 99%.
  • ICG near infrared fluorescence signal was measured using Safire II fluorescence equipment (RFU 7,612).
  • the complex of the present invention was compared with conventional cancer lesion markers to determine whether the complex of the present invention could be utilized as a cancer lesion marker.
  • FIG. 11 is a photograph showing the change in fluorescence signal of each marker over time in mice treated with [Tc-99m] Tc-ICG-MAA and [Tc-99m] Tc-ICG-HSA.
  • gelatin sponges showed stability in the body rather than gelatin.
  • Example 1 Using the MAA prepared in Example 1, the gold foil coil bonded to the radioisotope prepared in Example 5-1, the gelatin sponge and ICG prepared in Example 5-2 to prepare a solid marker, The characteristics of the near-infrared fluorescence signal resulting therefrom were verified.
  • the MAA prepared in Example 1 was mixed with an ICG of 6.5, 65 or 650 ⁇ M, and the mixture was obtained by adding the radioisotope-bound gold foil coil prepared in Example 5-1 to the mixture to obtain a mixture.
  • Gelatin was added to the mixture and heated at 160 ° C. for 3 hours, thereby preparing solid markers (Radiogoldcoil / EB-ICG-MAA-Gelatin sponge) including radioactive isotope bound gold foil coil, ICG, MAA and gelatin sponge. .
  • FIG. 13 is a photograph showing the change in intensity of the near-infrared fluorescence signal over time of the radioactive isotope-bound gold foil coil, ICG, MAA and gelatin sponge and control group ICG-Spongostan. As shown in FIG.
  • the solid-type marker showed a relatively high level of near-infrared fluorescence signal compared to the control group, and after 8 and 24 hours, ICG was diffused in the control group, and distilled water itself. The near infrared fluorescence signal was detected at, whereas the ICG diffusion rate at the solid marker was low.
  • the solid markers containing 650 ⁇ M of ICG showed the highest level of near infrared fluorescence signal intensity.
  • Example 5-3-2 Comparison of Intensity and ICG Diffusion Levels of Near-Infrared Fluorescence Signals over Time in Mice
  • FIG. 14 is a photograph showing the intensity of the near infrared fluorescence signal over time of the solid markers, ICG-Spongostan and ICG-gelatin injected into nude mice. As shown in FIG.
  • the near-infrared fluorescence signal was detected in the solid-type marker of the present invention even after three weeks, whereas the near-infrared fluorescence signal was hardly detected in the three-week-old ICG-Spongostan and ICG-gelatin.
  • the solid marker of the present invention was injected, it was found that the near-infrared fluorescent signal detected when the ICG concentration used in the preparation of the solid marker was high.

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Abstract

대응집알부민(macroaggregated albumin, MAA)에 생체조직 염색용 색소, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합이 결합된 복합체를 포함하는 암 병변 표지용 조성물, 상기 암 병변 표지용 조성물을 이용하여 암 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법, 상기 암 병변 표지용 조성물을 포함하는 암 병변 표지용 키트 및 상기 암 병변 표지용 조성물에 포함된 대응집알부민에 생체조직 염색용 색소가 결합된 복합체에 관한 것이다. 본 발명의 암 병변 표지용 조성물은 암의 병변에 결합하여 암 병변의 위치, 크기 등을 실시간으로 검출할 수 있어, 암 병변의 외과적 수술의 성공률을 향상시킬 뿐만 아니라, 정상조직의 과다한 손실을 방지할 수 있으므로, 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 암 병변 표지용 조성물
본 발명은 신규한 암 병변 표지용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 대응집알부민(macroaggregated albumin, MAA)에 생체조직 염색용 색소, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합이 결합된 복합체를 포함하는 암 병변 표지용 조성물, 상기 암 병변 표지용 조성물을 이용하여 암 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법, 상기 암 병변 표지용 조성물을 포함하는 암 병변 표지용 키트 및 상기 암 병변 표지용 조성물에 포함된 대응집알부민에 생체조직 염색용 색소가 결합된 복합체에 관한 것이다.
항암치료의 경우, 다양한 항암제를 이용하는 방법이 개발되고 있으나, 아직까지는 외과수술적인 방법을 통해 암세포를 제거하는 방법이 가장 많이 사용되고 있다. 그러나, 외과수술적인 방법을 사용할 경우, 수술 후 환자의 건강 및 복지를 위하여 수술 중에 수술범위를 최소화하는 기술이 필수적이다. 특히 유방암의 경우, 유방이 작은 국내여성의 수술시 절제하는 병변이 다른 나라에 비해 적어야 유방보존적 치료법의 목표를 달성할 수 있다. 수술범위는 병변과 병변 주위의 가장자리 여분 부위로 결정된다. 집도의가 병변 부위와 범위를 정확히 알지 못하면 병변 주위의 가장자리 여분을 크게 두지 않을 수 없다. 왜냐하면 무작정 수술범위를 줄이다가는 종양이 절제면에 남을 수도 있기 때문이다. 그런데, 실제 임상수술에서는 수술집도의가 수술중에 병변을 정확하게 실시간으로 확인하기 위한 방법이 많지 않다. 매우 정밀한 진단방법이 개발되었음에도 이러한 진단방법은 수술 중에는 사용하지 못해 실제 수술 중에는 주로 수술자의 촉감이나 시각에 의존하게 되는데 이 경우 병변이 뚜렷하게 구별되는 경우는 드물다. 특히, 병변이 작은 경우는 더욱 구별되지 않는다. 미세침습수술 및 보존적 수술의 목적을 달성하기 위하여, 수술자에게 병변을 수술 중에 실시간으로 알려주는 기술이 필요하다.
종래의 종양제거 수술, 특히 유방암 수술시에는 환자의 미세병변의 위치를 수술 전에 초음파, 맘모그라피, 혹은 자기공명영상으로 확인하고, 확인된 병변의 위치를 표시한 다음, 표시된 부위의 조직을 제거하게 되는데, 확인된 병변의 위치를 표시하는 방법으로는 피부 표면에 그림을 그리는 방법, 와이어를 이용하는 방법, 차콜(charcoal)과 같은 검은 색소를 주사하는 방법 등이 사용되고 있다. 그러나, 병변의 위치를 표시하기 위하여 피부 위에 펜을 이용하여 그림으로 그리는 방법은, 매우 유연한 유방조직의 특성상 진단할 때와 달리 수술장에서 유방의 모양이 많이 변화한다는 점, 유방 심부의 병변인 경우에는 피부 표면에 표시한 것만으로는 표시가 불충분하다는 점 등의 문제가 있어, 용이하게 사용할 수는 있지만 정확도가 낮은 단점이 있다. 다음으로, 와이어를 이용하여 유방 병변에 찌르는 방법은, 본래 와이어를 피부 표면으로 수직으로 삽입시켜야 하지만, 초음파 탐침에 영향을 줄 수 있기에 부득이하게 사선으로 삽입시켜야 한다는 점, 와이어의 위치가 유방의 움직임에 따라 이동할 수 있다는 점 등 때문에 예상보다 낮은 정확도를 나타내고, 삽입된 와이어는 수술에 방해가 되며, 와이어의 삽입부위를 절제하는 시술이 추가적으로 수행되어야 한다는 단점이 있다. 끝으로, 차콜과 같은 색소를 주사하는 방법은, 주사된 색소가 병변에 결합하여 병변의 위치를 정확히 표지할 수 있다는 장점이 있는 반면, 유방 심부의 병변인 경우 외부에서는 흑색의 색소를 확인할 수 없고, 색소에 의하여 수술부위가 오염될 수도 있다는 단점이 있다. 또한, 이러한 단점은 유방암 이외의 암 조직을 제거하기 위한 외과적 수술시에도 동일하게 문제가 된다.
이처럼 현재까지 개발된 기술로는 외과적으로 암 병변을 제거하기 위한 수술범위를 정밀하게 결정하기 어렵기 때문에, 아직까지는 외과적으로 암 병변을 제거할 경우 절제 범위가 필요 이상으로 확대될 수 밖에 없고, 수술후에도 병변이 정상적으로 제거되었는지를 확인하기 위한 검사가 수반되어야만 한다.
이에 본 발명자들은 암 병변을 외과적으로 제거할 때 생체조직 염색용 색소가 결합된 대응집알부민을 포함하는 표지자가 암의 병변에 효과적으로 흡착되어 병변의 위치를 정확히 표지할 수 있고, 상기 색소를 실시간으로 추적하여 제거하고자 하는 병변의 범위를 정확하게 확인할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 대응집알부민(macroaggregated albumin, MAA)에 생체조직 염색용 색소, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합이 결합된 복합체를 포함하는 암 병변 표지용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 암 병변 표지용 조성물을 이용하여 암 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암 병변 표지용 조성물을 포함하는 암 병변 표지용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 암 병변 표지용 조성물에 포함된 대응집알부민에 생체조직 염색용 색소가 결합된 복합체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 대응집알부민(macroaggregated albumin, MAA)에 생체조직 염색용 색소, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합이 결합된 복합체를 포함하는 암 병변 표지용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 조성물에 의해 표지되는 암은 상기 MAA가 침투되어 고정될 수 있는 조직을 내포하는 암이라면 특별히 제한되지 않지만, 조직 내에 상기 MAA가 침투되어 고정될 수 있는 고형암임이 바람직하고, 그 예로는 전립선암, 유방암, 자궁암, 피부암, 자궁경부암, 폐암, 뇌종양, 위장관 종양, 간암, 연조직육종, 림프종 등이 될 수 있다.
본 명세서에서 "대응집알부민(macroaggregated albumin, MAA)"이란, 사람의 혈청알부민을 가열하여 응고시켜서 제조된 직경 10 내지 50 μm의 단백질성 입자를 의미하는데, 직경이 10 nm 미만인 인혈청 알부민과 비교하여 그 구조 및 물리적 특성이 상이하다. 상기 MAA는 정맥주사할 경우 약 8 μm의 폐모세관에 체류하여 미소색전(微小塞栓)을 일으킬 수 있는 특성을 나타내므로, 상기 특성을 이용하여, 방사성 동위원소로 표지된 MAA는 폐신티그램(폐색전, 폐혈전, 고안병, 폐렴, 폐암 등의 폐혈류 이상이나 우·좌 샨트나 폐정맥압항진의 진단)이나 정맥스캔(그 부위에서 중추의 정맥혈진단)이나 정맥스캔(파자병등 말초동맥 혈류이상의 진단) 등에 사용되어 왔다. 본 발명의 MAA는 암 병변조직에 주입하여, 암 병변조직에 표지물질을 결합시키기 위한 매개체로 사용된다. 본 발명의 MAA는 재조합 HSA를 이용하여 합성할 수 있고, 자기유래가 아닌 HSA를 이용하여 합성할 수도 있다. 또한, 상업적으로 이용가능한 것을 구입하여 사용할 수도 있다. 본 발명의 MAA는 암 병변조직에 주입하여, 암 병변조직에 표지물질을 결합시키기 위한 매개체로 사용되는데, 상기 매개체는 표지물질을 흡착시켜서 상기 표지물질이 암 병변조직으로 확산되는 것을 방지하는 역할을 수행한다.
본 명세서에서 "생체조직 염색용 색소"란, 생체조직에 결합하여 결합된 위치를 표지함으로써, 표지된 위치를 육안으로 또는 검출용 도구를 사용하여 확인할 수 있게 하는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 생체조직 염색용 색소는 암 조직에 결합되어 암 발생부위를 표지하는 용도로 사용될 수 있는 표지물질이 될 수 있는데, 바람직하게는 육안으로 확인가능한 색소, 결합부위에서 형광을 발생시켜서 형광 카메라 등의 장비를 사용하여 검출할 수 있는 형광색소 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 "육안으로 확인가능한 색소"란, 생제조직에 결합한 표지물질이 가시광선 영역의 색을 나타내어 표지된 부위를 육안으로 확인할 수 있도록 하는 색소의 일종을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 육안으로 확인가능한 색소는 암이 발생된 부위에 주사하여 외과 수술적인 방법으로 암을 제거할 경우, 절제할 암병변을 명확히 확인할 수 있도록 하여, 암수술의 성공률을 향상시키는 역할을 수행할 수 있다. 상기 육안으로 확인가능한 표지물질은 바람직하게는 중성적, 나일청, 비스마르크브라운, 리튬카민, 트리판블루, 야누스그린, 메틸 바이올렛, 오-라민, 마라가이트 그린, 사프라닌, 에오신, 콩고레드, 에리스로신, 니그로신, 알시안블루 헤마톡실린, 아닐린블루, 라이트그린 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 암병변 조직을 확인할 수 있게 하는 목적을 달성할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 "형광색소"란, 일정 파장의 빛을 흡수하여 여기상태를 형성한 후, 빛의 침투거리가 최대가 되고, 수분에 의한 오류신호를 최소화 할 수 있는 형광을 발생하는 유기화합물을 의미하는데, 바람직하게는 700nm 내지 3000nm, 바람직하게는 750nm 내지 900nm의 근적외선 파장의 형광을 발생하는 유기화합물인 근적외선 형광색소가 될 수 있다. 상기 근적외선 형광색소로부터 발생하는 근적외선 파장의 형광은 형광 카메라, 형광 센싱 프로브(PCT/KR2011/009271) 등의 장비를 이용하여 사진형태로 촬영하거나 실시간 모니터링할 수 있다. 본 발명의 근적외선 파장의 형광은 생체내에서의 흡수가 다른 파장대에 비해 상대적으로 적어 비교적 생체내의 깊은 부위에서 발생하는 근적외선도 생체외부에서 검출이 가능하다. 본 발명의 목적상 상기 근적외선 영역 형광색소는 암이 발생된 부위에 주사하여 외과 수술적인 방법으로 암을 제거할 경우, 절개하기 전에 암의 병변부위를 정확하게 확인할 수 있도록 하여, 암 수술의 성공율을 향상시키는 역할을 수행할 수 있다. 특히, 상기 육안으로 확인가능한 색소와는 달리, 절개하여 직접적인 병변을 확인하기 전에 체외에서도 병변의 위치를 검출할 수 있으므로, 신속하고 정확한 암수술의 수행을 도모할 수 있게 한다. 상기 근적외선 형광색소로는 바람직하게는 인도시아닌그린 등을 사용할 수 있으며, 인체에 사용가능한 근적외선 형광색소인 한, 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.
상기 근적외선 형광색소가 MAA에 결합된 복합체는 종양에 축적되는 것으로 알려진 다른 물질에 근적외선 형광색소가 결합된 복합체에 비하여 검출되는 형광신호의 안정성 및 정확성이 우수하다는 장점을 나타내므로, 미세병변을 발견할 수 있는 비율이 높고, 병변 절제 정확도를 향상시킬 수 있다.
본 명세서에서 "인도시아닌그린(indocyanine green, ICG)"이란, 생물학 또는 의학분야에서 널리 사용되는 근적외선 영역의 형광 영상용 염료를 의미하는데, 인체에 주입된 후 한 시간 정도 지나면 분해되어 없어지거나 대소변으로 배출되는 특성이 있어 인체에 사용 가능한 형광염료로 임상적 적용에 유리하다. 실제로, 인도시아닌그린을 이용하여 인체에 적용한 사례는 여러 논문에 보고된 바 있고, 일례로 유방암환자 18명에서 안전하게 임상적으로 사용하였음이 보고되었다(T. Kitai, et al., Breast Cancer, 12:211-215, 2005). 아울러, 상기 근적외선 형광색소를 흡착결합시키는 것은, 본 발명의 MAA에 근적외선 형광색소를 혼합시키는 단계를 통하여 달성할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, MAA에 ICG가 결합된 복합체(ICG-MAA)의 제조시 높은 수준의 근적외선 형광신호를 나타내는 복합체를 제조하기에 적합한 혼합비율은 0.23mg/㎖의 MAA에 대하여는 3.9μM의 ICG, 2.3mg/㎖의 MAA에 대하여는 6.5μM의 ICG 및 11.5mg/㎖의 MAA에 대하여는 6.5μM의 ICG 임을 확인하였고(표 1 및 도 4), 생체 내에 주입하는 경우에는 생체 내에서의 확산 등으로 농도가 변화하므로 주사시점에 정확한 농도를 정할 수 없으나 실험적으로 10배 농도인 65μM에서 가장 형광이 높은 값을 나타냄을 확인하였다. 또한, 이처럼 제작된 복합체가 in vitro 및 in vivo 조건에서 안정성을 나타내는 지를 확인한 결과, in vitro 및 in vivo 조건에서 모두 상대적으로 높은 수준의 근적외선 형광신호의 세기와 안정성을 나타냄을 알 수 있었다(도 5 및 도 6).
본 명세서에서 "방사성 동위원소"란, 원자번호는 같지만 원자량이 상이하고 방사능을 발산할 수 있는 원소를 의미하는데, 감마선이나 다른 아원자 입자를 방출하여 방사성 감쇠를 하는 특성을 이용하여 일반적으로 질병을 진단하는데 중요한 표지자로 사용되기도 한다. 본 발명의 목적상 상기 방사성 동위원소는 근적외선 형광색소에서 발생되는 형광이 검출되지 않은 정도의 심부조직에 암이 발생된 부위에 주사하여 외과 수술적인 방법으로 암을 제거할 경우, 절개하기 전에 암의 병변부위를 정확하게 확인할 수 있도록 하여, 암 수술의 성공률을 향상시키는 역할을 수행할 수 있다. 상기 방사성 동위원소는 암의 병변에 결합할 수 있는 MAA에 표지할 수 있는 특성을 나타내는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 H-3, C-14, P-32, S-35, Cl-36, Cr-51, Co-57, Co-58, Cu-64, Fe-59, Y-90, I-124, I-125, Re-186, I-131, Tc-99m, Mo-99, P-32, CR-51, Ca-45, Ca-68 등이 될 수 있고, 보다 바람직하게는 의학적으로 사용되는 I-124, I-125, I-131, Cu-64, Tc-99m, Mo-99, CR-51, Ca-45, Ca-68 등이 될 수 있으며, 가장 바람직하게는 Tc-99m을 사용할 수 있다. 이때, 암은 특별히 이에 제한되지 않으나 외과적인 절제술로서 제거할 수 있는 특성을 나타내는 것이라면 특별히 이에 제한되지 않으나 전립선암, 유방암, 자궁암, 피부암, 자궁경부암, 폐암, 뇌종양, 위장관 종양, 간암, 연조직육종, 림프종 등 대부분의 고형암이 될 수 있다.
본 명세서에서 "Tc-99m"란, 테크네튬(technetium, Tc)의 방사성 동위원소로서, 6시간의 짧은 반감기를 가지고, 감마선을 발생시켜 영상용으로 사용되며, 피폭량이 매우 적고, 조직투과도가 우수하며, 일부 색소에서 나타나는 알레르기 반응도 일어나지 않기 때문에, 의학연구에 널리 사용된다.
본 발명의 일실시예에 의하면, MAA에 방사선 동위원소인 [Tc-99m]TcO4 -를 반응시킬 경우, 99%이상의 수율로 방사성 동위원소가 MAA에 결합된 복합체를 제작할 수 있고, 이들 복합체를 생체내에 주입하면 20시간이 경과한 후에도 주입된 위치를 확인할 수 있으며(도 3), 상기 MAA에 방사성 동위원소인 [Tc-99m]TcO4 -와 근적외선 형광색소인 ICG를 순차적으로 반응시키면 방사성 동위원소와 근적외선 형광색소가 결합된 복합체([Tc-99m]Tc-ICG-MAA)를 제작할 수 있고(도 10), 상기 제작된 복합체는 생체내에 주입하고 20시간이 경과한 후에도 주입된 위치를 확인할 수 있다(도 11).
한편, 본 발명의 생체조직 염색용 색소가 대응집알부민에 결합된 복합체의 생체내 표지자로서의 활용성을 극대화하기 위하여, 피브린을 사용하여 복합체의 물성을 강화시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 복합체는 생체내의 병변부위에 주입되어 병변을 표시함으로써 수술시에 병변부위를 명확히 인식할 수 있게 하는 역할을 수행하는데, 이같은 복합체가 상술한 표지자로서의 목적을 원활하게 수행하기 위하여는 주입된 병변부위에서 확산을 최대한 방지하여야 한다. 이러한 목적을 달성하기 위한 하나의 수단으로서 피브린을 사용할 수 있다(도 1). 도 1은 MAA 및 ICG를 포함하는 복합체에 피브린을 부가할 경우, 상기 부가된 피브린에 의하여 복합체의 생체내 조직 잔류성이 향상됨을 나타내는 개략도이다. 도 1에서 보듯이, 상기 피브린은 생체내에 주입된 복합체를 서로 연결시키는 역할을 수행하여, 생체에 주입된 복합체가 확산되는 것을 최대한 방지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 복합체는 피브린을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 제작한 MAA에 ICG가 결합된 복합체(ICG-MAA)에 트롬빈 및 아프로티닌(aprotinin)를 포함하는 혼합물 1과 피브리노겐 및 CaCl2를 포함하는 혼합물 2를 혼합하고 반응시켜서, 혈액응고섬유소(fibrin)가 결합된 ICG-MAA-fibrin 복합체를 제작하였으며, 이처럼 제작된 ICG-MAA-fibrin 복합체가 in vitro 및 in vivo 조건에서 안정성을 나타내는 지를 확인한 결과, in vitro 및 in vivo 조건에서 모두 상대적으로 높은 수준의 근적외선 형광신호의 세기와 안정성을 나타냄을 알 수 있었고(도 5 및 도 6), in vitro 및 in vivo 조건에서 MAA에 ICG가 결합된 복합체(ICG-MAA) 보다는 ICG-MAA-fibrin 복합체가 시간의 경과에 따른 확산정도가 낮은 수준을 나타내어, 암 병변 표지자로서 유리한 특성을 나타냄을 확인하였다(도 7, 도 8 및 도 9).
또한, 상술한 바와 같이, 상기 복합체가 생체 내에서 확산되는 것을 방지하기 위한 목적을 달성하기 위한 다른 수단으로서 젤라틴 스폰지를 사용할 수 있다. 즉, 생체 적합성이 우수하면서도 상온에서 용이하게 겔을 형성할 수 있는 젤라틴을 이용하면 상기 복합체가 응집된 형태로 젤라틴의 내부에 포집된 구조체를 형성할 수 있는데, 상기 형성된 구조체를 생체에 주입하면, 젤라틴에 의하여 주입된 부위에서 상기 복합체의 확산을 최대한 억제할 수 있다. 그러나, 상기 젤라틴은 생체내의 환경에서는 쉽게 용해되어 상기 구조체가 붕괴될 수 있다는 단점이 있으므로, 이러한 단점을 해결하기 위하여 젤라틴 대신에 젤라틴 스폰지를 사용하여 상기 단점을 극복할 수 있다.
젤라틴 스폰지는 젤라틴 용액을 고온에서 가열하여, 젤라틴에 존재하는 라이신의 측쇄사슬 아민기와, 글루타메이트 또는 아스파테이트의 측쇄사슬 카복실기 사이에 이소펩티드 결합이 생성된 형태의 구조물이다. 상기 젤라틴 스폰지는 젤라틴과 동일한 생체 적합성을 나타내면서도 물에 대한 용해도가 상대적으로 낮아 생체내에서 쉽게 용해되지 않는 특성을 나타내므로, 상기 젤라틴 스폰지를 이용하여 본 발명의 복합체가 응집된 형태로 포집된 구조체를 형성하고, 상기 구조체를 생체에 주입하면, 생체내에서 젤라틴 스폰지가 용해되지 않아, 주입된 구조체가 붕괴되지 않으므로, 주입된 부위에서 상기 복합체의 확산을 보다 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 젤라틴 용액을 160℃에서 3시간 동안 가열하여 교차구조를 포함하는 젤라틴 스폰지를 제조하고, 젤라틴과 젤라틴 스폰지를 각각 증류수에 침지하고 24시간 동안 방치한 결과, 젤라틴은 증류수에 완전히 용해된 반면, 젤라틴 스폰지는 물에 용해되지 않아 높은 안정성을 나타냄을 확인하였다(도 12).
상술한 젤라틴 스폰지를 사용할 경우, 근적외선 형광색소와 방사성 동위원소를 동시에 포함하도록 구성될 수 있다. 즉, 젤라틴 스폰지내에, MAA에 근적외선 형광색소인 ICG가 결합된 형태의 복합체(ICG-MAA) 또는 MAA에 방사성 동위원소인 [Tc-99m]Tc와 근적외선 형광색소인 ICG가 결합된 형태의 복합체([Tc-99m]Tc-ICGMAA)를 포함하도록 구조체를 제작할 수도 있다. 또한, 상기 젤라틴 스폰지내에 MAA에 근적외선 형광색소인 ICG가 결합된 형태의 복합체(ICG-MAA)와 방사성 동위원소를 각각 개별적으로 포함하도록 구조체를 제작할 수도 있는데, 이처럼 복합체와 방사성 동위원소를 개별적으로 포함할 경우에는, 방사성 동위원소를 상기 젤라틴 스폰지내에서 보다 효과적으로 고정화시키기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다. 상기 고정화 수단으로는 방사성 동위원소가 결합된 금박코일을 사용할 수 있으나, 방사성 동위원소를 고정화시키는 목적을 달성할 수 있는 한, 상기 고정화 수단은 특별히 이에 제한되지 않는다(도 2). 도 2는 MAA 및 ICG를 포함하는 복합체에 방사성 동위원소가 결합된 금박코일과 젤라틴을 부가하여 제작된 고체형 표지자의 구조 및 주입방법을 나타내는 개략도이다. 도 2에서 보듯이, 방사성 동위원소가 결합되지 않은 복합체(ICG-MAA)를 사용하다가 필요한 경우에는 방사성 동위원소를 추가하는 방식으로 표지자를 제작할 수 있으므로, 상기 젤라틴 스폰지를 사용하면 상기 MAA 기반 표지자의 활용성을 확장시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 방사성동위원소가 결합된 금박코일, ICG, MAA 및 젤라틴 스폰지를 포함하는 고체형 표지자를 제작하고, in vitro 및 in vivo 조건에서 ICG와 젤라틴 스폰지만을 포함하는 대조군의 고체형 표지자와 안정성을 비교한 결과, in vitro 조건에서 8 및 24시간이 경과된 후에 대조군의 고체형 표지자에서는 ICG가 확산되어 증류수 자체에서 근적외선 형광신호가 검출되는 반면, 본 발명의 고체형 표지자에서는 ICG의 확산율이 상대적으로 낮은 수준임을 확인하였고(도 13), in vivo 조건에서 3주가 경과한 뒤에 대조군의 고체형 표지자에서는 더 이상 근적외선 형광신호가 검출되지 않은 반면, 본 발명의 고체형 표지자에서는 근적외선 형광신호가 여전히 검출됨을 확인하였다(도 14).
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 (a) 상기 암 병변 표지용 조성물을 개체에서 발생된 암의 병변에 투여하는 단계; 및, (b) 상기 개체로부터 색깔, 근적외선 형광, 방사선 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 신호가 발생되는 위치를 확인하는 단계를 포함하는, 암 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "개체"란, 암이 발병하여 병변을 나타낼 수 있고, 본 발명의 암 병변 표지용 복합체 또는 조성물이 투여될 수 있는 살아있는 유기체를 의미한다.
본 발명에서 제공하는 암 병변 표지용 조성물을 생체 내의 암 병변조직에 투여할 경우, 투여된 암 병변에 결합되어 병변의 위치를 색깔, 근적외선 형광, 방사능 또는 이들의 조합을 통하여 표지할 수 있고, 상기 표지를 검출함으로써 암 병변의 위치, 크기 등을 수술중에 실시간으로 검출할 수 있으므로, 외과적인 암 병변의 제거시 정확성을 향상시킬 수 있고, 정상조직의 과다한 손실을 방지할 수 있다.
아울러, 본 발명의 조성물에 포함된 복합체는 다른 물질에 생체조직 염색용 색소를 결합시킨 복합체에 비하여, 생체내의 암 병변에서 장기간 동안 잔류할 수 있으므로, 암 병변의 외과적인 절제시 뿐만 아니라, 외과적인 시술에 의한 암 병변 절제의 정확도를 용이하게 확인할 수 있다. 예를 들어, 초음파 등을 통하여 수술전 미세병변의 위치를 확인한 후, 본 발명의 복합체를 병변부위에 주입하고, 수 시간 후 수술중에도 안정하고 정확하게 병변부위를 확인할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 병변 표지용 키트 및 상기 조성물에 포함된 대응집알부민에 생체조직 염색용 색소가 결합된 복합체를 제공한다. 상기 키트 또는 복합체는 암 제거 수술 중에 실시간으로 암 병변조직의 크기 및 위치를 확인하는데 사용될 수 있다.
도 1은 MAA 및 ICG를 포함하는 복합체에 피브린을 부가할 경우, 상기 부가된 피브린에 의하여 복합체의 생체내 조직 잔류성이 향상됨을 나타내는 개략도이다.
도 2는 MAA 및 ICG를 포함하는 복합체에 방사성동위원소가 결합된 금박코일과 젤라틴을 부가하여 제작된 고체형 표지자의 구조 및 주입방법을 나타내는 개략도이다.
도 3은 [Tc-99m]Tc-MAA가 주사된 누드 마우스에서 시간의 경과에 따른 [Tc-99m]Tc-MAA의 변화여부를 나타내는 감마영상 사진이다.
도 4는 ICG와 MAA의 농도변화에 따른 ICG-MAA 복합체의 근적외선형광 신호세기 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5는 in vitro 조건에서 ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-fibrin 및 ICG-glycol chitosan 복합체의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 누드 마우스에 주사된 ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-fibrin 및 ICGglycol chitosan 복합체의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기의 변화를 나타내는 사진이다.
도 7은 ICG-MAA-fibrin 복합체 또는 ICG-MAA 복합체가 주입된 닭가슴살 또는 돼지삼겹살에서 관찰되는 각 복합체의 형태를 나타내는 사진이다.
도 8은 근육조직에 주입된 ICG-MAA-fibrin 복합체와 ICG-MAA 복합체의 시간의 경과에 따른 확산수준을 나타내는 형광사진이다.
도 9는 누드 마우스에 주입된 ICG-MAA-fibrin 복합체와 ICG-MAA 복합체의 시간의 경과에 따른 확산수준을 나타내는 형광사진이다.
도 10은 MAA에 Tc-99m가 결합된 복합체의 표지율을 나타내는 그래프이다.
도 11은 각각의 암 병변 표지자인 [Tc-99m]Tc-ICG-MAA와 [Tc-99m]Tc-ICG-HSA가 투여된 마우스에서 시간의 경과에 따른 각 표지자의 형광신호 변화를 나타내는 사진이다.
도 12는 시간의 경과에 따른 젤라틴과 젤라틴 스폰지의 용해수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 13은 방사성동위원소가 결합된 금박코일, ICG, MAA 및 젤라틴 스폰지를 포함하는 고체형 표지자와 대조군인 ICG-Spongostan의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 변화를 나타내는 사진이다.
도 14는 누드 마우스에 주입된 고체형 표지자, ICG-Spongostan 및 ICG-젤라틴의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기를 나타내는 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 대응집알부민(macroaggregated albumin, MAA)의 제작
0.1 M 아세테이트 완충액(pH 5.4)에 희석된 2% 인혈청알부민 10㎖을 염화주석 50㎎과 혼합하고 10분간 실온에서 강하게 교반한 다음, 70℃에서 20분간 추가로 교반하여 반응시켰다. 상기 반응이 종료된 후, 반응물을 냉각시키고, 20% 인혈청알부민 0.35㎖을 추가한 다음 다시 10분간 교반하였다. 상기 반응물을 MAA기준 2㎎씩 유리 바이알에 분주하고 동결건조 하여, 티올 MAA를 제작하였다.
실시예 2: 방사선 동위원소가 결합된 MAA 복합체 및 그의 유용성 확인
상기 실시예 1에서 제작된 티올 MAA에 방사선 동위원소인 [Tc-99m]TcO4 -(10mCi/㎖)를 2㎖ 가하고, 10분 동안 실온에서 반응시켜서, 방사선 동위원소가 결합된 MAA 복합체([Tc-99m]Tc-MAA)를 제작하였다. 상기 방사선 동위원소가 MAA에 정상적으로 결합되었는지를 확인하기 위하여, 상기 복합체를 ITLC(Instant thin layer chromatography)에 적용하고, 아세톤을 용매로 사용하여 전개한 결과, 99% 이상의 티올 MAA가 방사선 동위원소와 결합하여 복합체를 형성함을 확인하였다.
한편, 상기 제작된 복합체가 생체 내 표지자로서 사용될 수 있는지를 확인하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다: 상기 제작된 [Tc-99m]Tc-MAA 1 mCi/50㎕를 누드 마우스의 왼쪽 엉덩이에 주사하고, 주사한 직후(0 h) 및 20시간이 경과한 시점(20 h)에서 animal SPECT 장비(NanoSPECT, Bioscan)를 이용하여 누드 마우스의 감마영상을 촬영하였다(도 3). 도 3은 [Tc-99m]Tc-MAA가 주사된 누드 마우스에서 시간의 경과에 따른 [Tc-99m]Tc-MAA의 변화여부를 나타내는 감마영상 사진이다. 도 3에서 보듯이, 주사한 직후(0 h) 및 20시간이 경과한 후에도(20 h) [Tc-99m]Tc-MAA는 계속적으로 주사된 병변에 지속적으로 잔류함을 확인하였다.
실시예 3: 인도시아닌그린(ICG)이 결합된 MAA 기반 표지자의 제조 및 이의 유용성 확인
근적외선 형광신호를 발생시킬 수 있는 인도시아닌그린(ICG)이 MAA와 결합된 복합체는 생체 내에서 안정적으로 작용하는 표지자로서 사용될 수 있을 것으로 예상되었으므로, 상기 복합체를 제작하고 이의 생체 내 표지자로서의 유용성을 확인하였다.
실시예 3-1: ICG와 MAA의 혼합비율 결정
근적외선 형광을 나타내는 MAA 기반 표지자를 제조하기 위하여, 상기 제작된 MAA에 근적외선 형광을 나타내는 인도시아닌그린(ICG)이 결합된 복합체(ICG-MAA)를 제작하였다.
이때, 가장 강한 근적외선 형광을 나타낼 수 있는 ICG와 MAA의 혼합비를 결정하기 위하여, 1.3 내지 1032μM의 ICG와 0 내지 11.5mg/㎖의 MAA를 다양한 비율로 반응시켜서 각각의 ICG-MAA 복합체를 제작하고, 상기 제작된 각 ICG-MAA 복합체에서 나타나는 근적외선 형광의 신호세기를 측정하였다(표 1 및 도 4). 도 4는 ICG와 MAA의 농도변화에 따른 ICG-MAA 복합체의 근적외선 형광 신호세기 변화를 나타내는 그래프이다.
표 1 ICG와 MAA의 농도변화에 따른 ICG-MAA 복합체의 근적외선 형광 신호세기
ICG(μM) MAA(mg/㎖)
0 0.23 2.3 11.5
1.3 18 42 238 530
3.9 120 52 424 931
6.5 212 38 456 979
9.0 289 32 444 942
12.9 363 27 342 915
25.8 466 12 255 563
38.7 425 8 162 366
51.6 399 7 101 280
64.5 374 13 75 244
77.4 332 16 55 182
103 289 23 39 94
258 139 30 16 60
516 71 13 2 20
774 39 6 2 9
1032 30 6 1 4
상기 표 1 및 도 4에서 보듯이, MAA를 처리하지 않은 경우에는 25.8μM의 ICG가 가장 높은 값의 근적외선형광 신호세기를 나타내었고, 0.23mg/㎖의 MAA를 처리한 경우에는 3.9μM의 ICG가 가장 높은 값의 근적외선형광 신호세기를 나타내었으며, 2.3mg/㎖의 MAA를 처리한 경우에는 6.5μM의 ICG가 가장 높은 값의 근적외선형광 신호세기를 나타내었고, 11.5mg/㎖의 MAA를 처리한 경우에도 6.5μM의 ICG가 가장 높은 값의 근적외선형광 신호세기를 나타내었다.
한편, 생체에 주사하는 경우는 생체 내에서의 확산 등으로 농도가 변화하므로 주사시점에 정확한 농도를 정할 수 없으나 실험적으로 10배 농도인 65μM에서 가장 형광이 높은 값을 나타냄을 확인하였다.
실시예 3-2: ICG가 결합된 복합체의 제작
상기 실시예로부터 얻어진 결과를 이용하여 ICG가 결합된 다양한 복합체를 제작하였다.
우선, 65μM ICG를 인혈청 알부민(HSA), 글리콜키토산(glycol chitosan) 또는 MAA에 가하여 반응시킴으로써, 각각의 복합체(ICG-HSA, ICG-MAA 및 ICG-glycol chitosan)를 제작하였다.
또한, 상기 제작한 ICG-MAA과 트롬빈 및 아프로티닌(aprotinin)를 포함하는 혼합물 1과 피브리노겐 및 CaCl2를 포함하는 혼합물 2를 혼합하고 반응시켜서, 혈액응고섬유소(fibrin)가 결합된 ICG-MAA-fibrin 복합체를 제작하였다. 이때, 피브리노겐, 아프로티닌, 트롬빈 및 CaCl2의 혼합비는 각각 25mg/㎖, 500 KIU/㎖, 250 IU/㎖ 및 4㎎/㎖로 하였다.
실시예 3-3: ICG가 결합된 복합체의 근적외선 형광능 안정성 확인
조직 표지용 조성물은 그 사용특성상 생체조직에 주사되어 주사부위가 표지되었을 때, 형광을 방출하는 기간이 길수록 수술장에서의 사용이 유리하므로, 상기 제작된 4종의 복합체의 근적외선 형광능 안정성을 in vitro 또는 in vivo에서 확인하였다.
실시예 3-3-1: in vitro 안정성 확인
상기 실시예 3-2에서 제작한 4종의 복합체를 in vitro 조건에서 800시간동안 방출하는 근적외선 형광신호의 세기를 측정하였다(도 5). 도 5는 in vitro 조건에서 ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-fibrin 및 ICG-glycol chitosan 복합체의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기의 변화를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, ICG-MAA가 포함된 복합체들이 상대적으로 높은 수준의 근적외선 형광신호의 세기와 안정성을 나타냄을 확인하였고, ICG-MAA 보다는 ICG-MAA-fibrin이 상대적으로 높은 수준의 근적외선 형광신호의 세기와 안정성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 3-3-2: in vivo 안정성 확인
상기 실시예 3-2에서 제작한 4종의 복합체를 누드 마우스의 각 허벅지에 50 ㎕씩 주사하고, 3주동안 각 누드 마우스에서 발생하는 근적외선 형광신호의 변화를 Xenogen Lumina 장비를 이용하여 측정하였다(도 6). 도 6은 누드 마우스에 주사된 ICG-HSA, ICG-MAA, ICG-MAA-fibrin 및 ICG-glycol chitosan 복합체의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기의 변화를 나타내는 사진이다. 도 6에서 보듯이, 주사 직후에는 4종의 복합체에서 모두 높은 수준의 근적외선 형광신호가 나타났으나, 1주가 경과된 시점부터 ICG-HSA 및 ICG-glycol chitosan 복합체에서 나타나는 근적외선 형광신호가 급격히 감소하였으며, 3주가 경과된 시점에서는 ICG-HSA 및 ICG-glycol chitosan 복합체에서 나타나는 근적외선 형광신호는 거의 검출되지 않았다. 이에 반하여, ICG-MAA 및 ICG-MAA-fibrin 복합체에서 나타나는 근적외선 형광신호는 3주가 경과된 시점에서도 일정 수준으로 나타남을 확인하였다.
상기 실시예의 결과로부터, ICG-MAA가 포함된 복합체들은 in vitro 및 in vivo에서 상대적으로 높은 수준의 근적외선 형광신호의 세기와 안정성을 나타냄을 알 수 있었다. 또한, 동일한 근적외선 형광색소를 사용하였으나 이렇게 상이한 결과가 도출된 이유는, ICG-MAA를 포함하지 않은 복합체들은 상대적으로 짧은 시간내에 체내로 분해 및 흡수되었기 때문일 것으로 예상되었다. 특히, ICG-MAA-fibrin의 경우, 대응집알부민에 혈액응고섬유까지 더해져서 높은 형태유지 안정성을 나타내어, 암 병변 표지자로서 매우 유리한 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 3-4: ICG-MAA-fibrin 복합체와 ICG-MAA 복합체의 유용성 비교
상기 실시예 3-3의 결과로부터 ICG-MAA를 포함하는 ICG-MAA-fibrin 복합체와 ICG-MAA 복합체가 암 병변 표지자로서 매우 유리한 특성을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 각 복합체의 암병변 표지자로서의 효과를 비교하였다.
실시예 3-4-1: 조직 내에서 주입된 형태 비교
상기 각 복합체를 근육조직의 일종인 닭가슴살 또는 지방조직의 일종인 돼지삼겹살에 각각 주입하고, 상기 주입된 각 조직을 1-2 mm 두께로 절단한 다음, 절단된 각 조직에서 관찰되는 각 복합체의 형태를 비교하였다(도 7). 도 7은 ICG-MAAfibrin 복합체 또는 ICG-MAA 복합체가 주입된 닭가슴살 또는 돼지삼겹살에서 관찰되는 각 복합체의 형태를 나타내는 사진이다. 도 7에서 보듯이, ICG-MAA-fibrin 복합체를 주입하면, 조직내에서 바로 응고되어 타원체 모양을 유지하는 반면, ICGMAA 복합체를 주입하면, 근육조직에서 근섬유 결을 따라 확산되고, 지방조직에서는 주사바늘 자국을 따라서 확산되는 현상이 발생함을 확인하였다.
따라서, 혈액응고섬유소로 응고시키는 ICG-MAA-fibrin을 생체조직내로 주입하였을 때 ICG-MAA에 비하여 조밀한 결합조직까지도 덜 확산됨으로써, 더욱 섬세하게 병변을 표시할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3-4-2: 조직 내에서 시간 경과에 따른 확산 수준 비교
생체조직에 주입된 각 복합체가 조직내에서 확산되면, 근적외선 형광신호를 나타내는 부위가 증가하게 되어 섬세한 병변 부위 표지 역할을 제한할 수 있을 것으로 예상되었다.
이를 확인하기 위하여, ICG-MAA-fibrin 복합체와 ICG-MAA 복합체를 닭가슴살에 주입하고 주입당시 및 주입후 2일이 경과한 시점에서 각 복합체로부터 나타나는 근적외선 형광신호의 확산 수준을 비교하였다(도 8). 도 8은 근육조직에 주입된 ICG-MAA-fibrin 복합체와 ICG-MAA 복합체의 시간의 경과에 따른 확산수준을 나타내는 형광사진이다. 도 8에서 보듯이, ICG-MAA-fibrin 복합체는 주입 후 응집이 일어나 ICG-MAA가 fibrin에 갇히게 되어 시간이 경과한 후에도 확산으로 인한 근적외선 형광신호를 나타내는 부위의 크기가 증가하지 않은 반면 ICG-MAA 복합체는 시간이 경과함에 따라 근적외선 형광신호를 나타내는 부위의 크기가 증가함을 알 수 있었다.
실시예 3-4-3: 마우스에서 시간 경과에 따른 확산 수준 비교
상기 실시예의 결과가 생체내에서도 적용될 수 있는지를 확인하기 위하여, 누드 마우스의 피하에 ICG-MAA-fibrin 복합체 또는 ICG-MAA 복합체를 주입하고, 주입당시 및 주입후 2일이 경과한 시점에서 각 복합체로부터 나타나는 근적외선 형광신호의 확산 수준을 Xenogen Lumina장비를 이용하여 측정하였다(도 9). 도 9는 누드 마우스에 주입된 ICG-MAA-fibrin 복합체와 ICG-MAA 복합체의 시간의 경과에 따른 확산수준을 나타내는 형광사진이다. 도 9에서 보듯이, 도 8의 결과와 유사하게, ICG-MAA-fibrin 복합체는 주입 후 응집이 일어나 ICG-MAA가 fibrin에 갇히게 되어 시간이 경과한 후에도 확산으로 인한 근적외선 형광신호를 나타내는 부위의 크기가 증가하지 않은 반면, ICG-MAA 복합체는 시간이 경과함에 따라 근적외선 형광신호를 나타내는 부위의 크기가 증가함을 알 수 있었다.
따라서, ICG-MAA-fibrin 복합체가 가장 우수한 형광능 및 체내안정성을 나타낼 뿐만 아니라, 시간의 경과에 따른 확산정도가 낮은 수준을 나타내어, 암 병변 표지자로서 유리한 특성을 나타냄을 확인하였다.
실시예 4: [Tc-99m]Tc-ICG-MAA의 제조 및 효과확인
실시예 4-1: [Tc-99m]Tc-ICG-MAA의 제조
상기 실시예 1에서 제작된 MAA에 [Tc-99m]TcO4- 20 mCi/2㎖를 가하고, 10분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 종료된 후, 인도시아닌그린(ICG) 42㎍/㎕를 가하고, 10분동안 실온에서 추가로 반응시켜서, MAA에 근적외선 형광색소인 ICG와 방사성 동위원소인 Tc-99m이 표지된 복합체를 제조하였다.
상기 제조된 복합체에 Tc-99m이 정상적으로 표지되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 상기 복합체를 ITLC(Instant thin layer chromatography)에 적용하고, 아세톤을 용매로 사용하여 전개하였다(도 10). 도 10은 MAA에 Tc-99m가 결합된 복합체의 표지율을 나타내는 그래프이다. 도 10에서 보듯이, 표지율은 99%이상 임을 확인할 수 있었다. 아울러, ICG 근적외선 형광신호를 Safire II 형광장비를 이용하여 측정하였다(RFU 7,612).
따라서, MAA를 이용하여 [Tc-99m]Tc-ICG-MAA 복합체를 제조할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4-2: [Tc-99m]Tc-ICG-MAA의 효과 확인
생체내 조직에서 시간의 경과에 따른 희석수준의 측면에서, 본 발명의 복합체를 종래의 암 병변 표지자와 비교하여, 본 발명의 복합체가 암 병변 표지자로서 활용될 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.
구체적으로, 종래의 암 병변 표지자로서 인혈청 알부민에 근적외선 형광색소인 ICG와 방사성 동위원소인 Tc-99m이 표지된 복합체([Tc-99m]Tc-ICG-HSA)를 제조하였다.
누드마우스의 오른쪽 엉덩이에 상기 제조된 복합체([Tc-99m]Tc-ICG-HSA)를 1mCi/50㎕로 주사하고, 상기 누드마우스의 왼쪽 엉덩이에 상기 실시예 4-1에서 제조된 복합체([Tc-99m]Tc-ICG-MAA)를 1 mCi/50㎕로 주사한 다음, 주사한 직후(0h) 및 20시간이 경과한 시점(20h)에서 누드마우스의 감마영상을 animal SPECT 장비(NanoSPECT, Bioscan)를 이용하여 촬영하였다(도 11). 도 11은 각각의 암 병변 표지자인 [Tc-99m]Tc-ICG-MAA와 [Tc-99m]Tc-ICG-HSA가 투여된 마우스에서 시간의 경과에 따른 각 표지자의 형광신호 변화를 나타내는 사진이다. 도 11에서 보듯이, 주사한 직후(0h)에는 두 가지 복합체가 모두 주사된 병변에만 잔류하였으나, 20시간이 경과한 후에는(20h), [Tc-99m]Tc-ICG-HSA는 주변조직으로 분산되어 형광신호가 약화된 반면, [Tc-99m]Tc-ICG-MAA는 계속적으로 주사된 병변에서 지속적으로 잔류함을 확인하였다.
실시예 5: 젤라틴을 이용한 MAA 기반 표지자의 제조 및 이의 유용성 확인
근적외선 형광신호를 발생시킬 수 있는 인도시아닌그린(ICG)이 MAA와 결합된 복합체의 제조시 높은 생체내 적합성을 나타내면서도 동시에 생체내에서 쉽게 용해되지 않는 안정성을 나타내는 젤라틴 스폰지를 사용할 경우, 생체내에서 보다 안정적으로 작용하는 표지자를 제작할 수 있을 것으로 예상되었으므로, 상기 젤라틴 스폰지를 이용한 복합체를 제작하고 이의 생체내 표지자로서의 유용성을 확인하였다.
실시예 5-1: 방사성동위원소가 결합된 금박코일 제작
CT(X-ray) 영상에서도 잘 볼 수 있는 임상적용중인 금속재질 코일(예로서 UltraClip)에 0.44 M HAuCl4 1.8㎖, CTAB 3g, 부탄올 2.5g 및 옥탄 1.0g을 가하여 표면을 도금하여 금박코일을 수득하고, 상기 금박코일에 [I-125]NaI 100 uCi를 가한 다음, 실온에서 5분간 교반하며 반응시켜서, 방사성 동위원소가 결합된 금박코일을 제작하였다.
실시예 5-2: 젤라틴 스폰지(Gelatin sponge)의 제조
젤라틴 건조 플레이크 0.6g에 10㎖ 증류수를 가하고 60℃로 가열하면서 완전히 용해시켜 젤라틴 용액을 수득하였다. 상기 젤라틴 용액을 4℃에서 1시간 동안 방치하여 젤라틴을 제조하였다. 상기 제조된 젤라틴을 160℃에서 3시간 동안 가열하여 교차구조를 포함하는 젤라틴 스폰지를 제조하였다. 상기 교차구조는 젤라틴에 존재하는 라이신의 측쇄사슬 아민기와, 글루타메이트 또는 아스파테이트의 측쇄사슬 카복실기를 고온에서 반응시켜서 이소펩티드 결합을 생성함에 의해 형성되었다.
상기 제조된 젤라틴과 젤라틴 스폰지 중에서 어떤 물질이 체내에서 안정성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 상기 젤라틴과 젤라틴 스폰지를 증류수에 침지하고, 24시간 동안 방치하면서, 이들의 용해여부를 확인하였다(도 12). 도 12는 시간의 경과에 따른 젤라틴과 젤라틴 스폰지의 용해수준을 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 12에서 보듯이, 교차 결합이 형성되지 않은 젤라틴은 1일 이내에 물에 완전히 용해된 반면, 교차 결합이 형성된 젤라틴 스폰지는 1일이 경과한 후에도 물에 용해되지 않음을 확인하였다.
따라서, 젤라틴 보다는 젤라틴 스폰지가 체내에서 안정성을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 5-3: 젤라틴 스폰지를 이용한 MAA 기반 고체형 표지자의 제조 및 그의 유용성 검증
상기 실시예 1에서 제작된 MAA, 상기 실시예 5-1에서 제작된 방사성동위원소가 결합된 금박코일, 상기 실시예 5-2에서 제작된 젤라틴 스폰지 및 ICG를 이용하여 고체형 표지자를 제작하고, 그로부터 나타나는 근적외선 형광신호의 특성을 검증하였다.
실시예 5-3-1: 고체형 표지자의 제작
상기 실시예 1에서 제작한 MAA와 6.5, 65 또는 650μM의 ICG를 혼합하고, 상기 혼합물에 상기 실시예 5-1에서 제작된 방사성동위원소가 결합된 금박코일을 첨가하여 혼합물을 수득한 다음, 상기 혼합물에 젤라틴을 가하고 160℃에서 3시간 동안 가열하여 방사성동위원소가 결합된 금박코일, ICG, MAA 및 젤라틴 스폰지를 포함하는 고체형 표지자(Radiogoldcoil/EB-ICG-MAA-Gelatin sponge)를 각각 제작하였다.
상기 제작된 각각의 고체형 표지자를 증류수에 침지하고 1일동안 방치하면서 침지직후(0시간), 8시간이 경과한 시점 및 24시간이 경과한 시점에서 근적외선 형광 세기를 측정하고 대조군의 것과 비교하였다(도 13). 이때, 대조군으로는 상업적으로 입수할 수 있는 젤라틴 스폰지의 하나인 스판고스탄(Spongostan)을 6.5, 65 또는 650μM의 ICG 용액과 혼합하여 제조된 것(ICG-Spongostan)을 사용하였다. 도 13은 방사성동위원소가 결합된 금박코일, ICG, MAA 및 젤라틴 스폰지를 포함하는 고체형 표지자와 대조군인 ICG-Spongostan의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 변화를 나타내는 사진이다. 도 13에서 보듯이, 동일한 ICG 농도에서는 상기 고체형 표지자가 대조군에 비해 상대적으로 높은 수준의 근적외선 형광신호의 세기를 나타내었고, 8 및 24시간까지 경과된 시점에서는 대조군에서 ICG가 확산되어, 증류수 자체에서 근적외선 형광신호가 검출된 반면, 상기 고체형 표지자에서의 ICG 확산율은 낮은 수준을 나타내었다.
또한, 각기 상이한 ICG 농도를 포함하는 고체형 표지자에서는 650μM의 ICG를 포함하는 고체형 표지자가 가장 높은 수준의 근적외선 형광신호 세기를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 5-3-2: 마우스에서 시간 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기 및 ICG 확산수준 비교
서로 다른 농도(6.5, 65 또는 650μM)의 ICG를 이용하여, 상기 실시예의 방법으로 제작한 각각의 고체형 표지자, ICG-Spongostan 및 ICG-젤라틴을 누드 마우스의 피하에 주입하고 주입직후(0h), 1일이 경과한 시점(1day), 1주가 경과한 시점(1week) 또는 3주가 경과한 시점(3week)에서 각 누드 마우스를 Xenogen Lumina장비에 적용하여 각각의 주입위치에서 나타나는 근적외선 형광신호의 세기를 측정하였다(도 14). 도 14는 누드 마우스에 주입된 고체형 표지자, ICG-Spongostan 및 ICG-젤라틴의 시간의 경과에 따른 근적외선 형광신호의 세기를 나타내는 사진이다. 도 14에서 보듯이, 본 발명의 고체형 표지자는 3주가 경과한 시점에서도 근적외선 형광신호가 검출된 반면, ICG-Spongostan 및 ICG-젤라틴은 3주가 경과한 시점에서는 거의 근적외선 형광신호가 검출되지 않았다. 또한, 본 발명의 고체형 표지자를 주입한 경우, 상기 고체형 표지자의 제조시 사용된 ICG의 농도가 높은 수준인 경우에 검출된 근적외선 형광신호가 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.
상술한 바를 종합하면, 본 발명의 복합체는 주사된 병변에 장시간 동안 잔류하여 정확한 미세병변을 발견하는 비율이 높고, 신호강도가 강하여 병변 절제의 정확도가 우수한 표지자로서 유리한 특성을 가짐을 확인할 수 있었다.
본 발명의 암 병변 표지용 조성물은 암의 병변에 결합하여 암 병변의 위치, 크기 등을 수술중에 실시간으로 검출할 수 있어, 암 병변의 외과적 수술의 성공률을 향상시킬 뿐만 아니라, 정상조직의 과다한 손실을 방지할 수 있으므로, 효과적인 항암치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Claims (17)

  1. 대응집알부민(macroaggregated albumin, MAA)에 생체조직 염색용 색소, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합이 결합된 복합체를 포함하는 암 병변 표지용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 생체조직 염색용 색소는 육안으로 확인가능한 색소 또는 형광색소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 육안으로 확인가능한 색소는 중성적, 나일청, 비스마르크브라운, 리튬카민, 트리판블루, 야누스그린, 메틸 바이올렛, 오-라민, 마라가이트 그린, 사프라닌, 에오신, 콩고레드, 에리스로신, 니그로신, 알시안블루 헤마톡실린, 아닐린블루, 라이트그린 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 형광색소는 근적외선 형광색소인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 근적외선 형광색소는 인도시아닌그린(indocyanine green, ICG)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 방사선 동위원소는 H-3, C-14, P-32, S-35, Cl-36, Cr-51, Co-57, Co-58, Cu-64, Fe-59, Y-90, I-124, I-125, Re-186, I-131, Tc-99m, Mo-99, P-32, CR-51, Ca-45, Ca-68 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    대응집알부민에 피브린이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 복합체가 젤라틴 또는 젤라틴 스폰지의 내부에 포집된 형태로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 젤라틴 스폰지는 젤라틴에 존재하는 라이신의 측쇄사슬 아민기와, 글루타메이트 또는 아스파테이트의 측쇄사슬 카복실기 사이에 이소펩티드 결합이 생성된 형태의 구조물인 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 암은 고형암인 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 고형암은 전립선암, 유방암, 자궁암, 피부암, 자궁경부암, 폐암, 뇌종양, 위장관 종양, 간암, 연조직육종, 림프종 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 암 제거수술중에 실시간으로 암 병변조직의 크기 및 위치를 확인하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 대응집알부민에 (a) 생체조직 염색용 색소, 방사성 동위원소 또는 이들의 조합 및 (b) 피브린이 결합된 복합체를 포함하는 암 병변 표지용 조성물로서, 상기 복합체는 젤라틴 스폰지의 내부에 포집된 조성물.
  14. (a) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 개체에서 발생된 암의 병변에 투여하는 단계; 및,
    (b) 상기 개체로부터 색깔, 근적외선 형광, 방사선 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 신호를 확인하는 단계를 포함하는, 암 병변의 위치에 대한 정보를 제공하는 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 암 병변 표지용 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 키트는 암 제거수술 중에 실시간으로 암 병변조직의 크기 및 위치를 확인하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 키트.
  17. 대응집알부민에 생체조직 염색용 색소가 결합된 복합체.
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