CN112089852A - Cd38靶向的pet显像剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了CD38靶向的PET显像剂及其应用。本发明公开的CD38靶向的PET显像剂，为偶联有NOTA且标记有放射性核素的daratumumab的F(ab')2片段。本发明的CD38靶向的PET显像剂具有如下特点：(1)可有效的用于CD38表达阳性的肿瘤显像；(2)具有很好的在活体水平显示CD38表达的作用，具备很好的特异性和灵敏度；(3)在标记CD38时有理想和稳定的标记率、放化纯和比活度；(4)能够更早的达到肿瘤摄取的峰值，更适合潜在的临床显像转化应用。故，本发明的显像剂具有很好的应用前景。

Description

CD38靶向的PET显像剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域中，CD38靶向的PET显像剂及其应用。
背景技术
CD38是一种45kDa的II型跨膜糖蛋白，具有酶活性调节细胞内钙信号转导、调控受体介导的淋巴细胞粘附及信号转导功能。CD38在浆细胞表面高表达，特别是多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞中异常高表达，而在多数静止期自然杀伤细胞(NK细胞)、单核细胞和其它多种血液学细胞类型中相对低表达，提示CD38是适用于浆细胞相关性肿瘤的靶生物标志物。此外，CD38在急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)、慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocytic leukemia，CLL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)等疾病中也具有高表达特性。有研究显示CD38的表达水平与CLL的预后相关。综上，对肿瘤组织的CD38表达水平进行评估，尤其是CD38高表达的恶性肿瘤，能够为早期诊断、疗效监测和预后评估提供有效帮助。
达雷木单抗(daratumumab，商品名Darzalex，强生生物科技有限公司)是第一个美国FDA批准的用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤(MM)的抗CD38单克隆抗体，属于全人化免疫球蛋白G1-kappa(IgG1-κ)抗体。达雷木单抗能够在活体水平与CD38靶向结合，具有很高的亲和力和特异性。通过补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬、细胞凋亡和抑制CD38酶活性等多种细胞毒性作用机制诱导CD38高表达的细胞死亡。达雷木单抗的治疗效果与CD38在MM中的表达水平有关。研究显示，达雷木单抗治疗MM后，肿瘤的CD38表达水平明显减低，提示CD38表达能够用于反映治疗疗效。此外，达雷木单抗对CD38高表达的B细胞淋巴瘤亦显示出治疗效果，提示其在淋巴瘤中具有潜在应用前景。
随着对肿瘤生长、增殖、凋亡的分子机制研究的深入，伴随着分子生物学革命性的进展，肿瘤的诊断和治疗都已进入分子水平。CD38阳性肿瘤的分子靶向药物通过抑制CD38蛋白活性或阻断下游信号转导通路，达到抑制或杀死肿瘤细胞作用。此外，靶向治疗的必要前提是检测活检病灶的CD38表达水平使之能够获益于靶向治疗。目前国内外指南均强调只要能获取肿瘤组织，不仅对于原发灶进行病理检测，对复发灶或转移灶也应该进行靶向分子的检测。但是目前临床上常规采用的免疫组化或原位杂交法，虽然是检测靶向蛋白或基因的金标准，但是具有创伤性，需要活检取得离体组织，往往无法对所有可疑病灶均取得活检，并且受限于活检组织的大小，可能活检标本无法代表整个病灶的表达情况而出现假阴性。相比之下，分子影像具有无创性优势，而且可以显示病灶特定分子的表达水平。
核医学具有分子诊疗的先天优势。通过选择合适的肿瘤特异性的分子探针，并对其标记不同作用的放射性核素，即可建立特异性强、灵敏度高的活体无创性诊断和放射性杀伤的诊疗技术。放射性核素作为一类广泛应用于临床影像诊断的示踪手段，相比光学成像技术具有组织穿透性好、安全性高、可定量分析等优势，十分利于临床转化。近年迅速发展的正电子发射计算机断层显像(PET/CT)，在绝大多数恶性肿瘤的诊断、分期、疗效评估、预后判断上均广泛应用并得到认可，其特点是可以提供CT或MRI等检查无法给予的代谢及功能信息，具有更早期、更灵敏的优势。同时，采用治疗用的放射性核素发射α或β射线在病变组织产生一系列的电离辐射生物效应，通过辐射能的直接和间接作用使机体生物活性的大分子结构和性质遭受损害，导致肿瘤细胞生长能力丧失或死亡从而达到肿瘤治疗的目的。因此，对单克隆抗体、片段和多肽进行放射性核素标记后，用单光子计算机断层扫描(SPECT)或正电子发射计算机断层扫描(PET/CT)，能够用于临床前和临床实验中检测特定细胞表面受体的存在及其作用。
目前氟代脱氧葡萄糖(18F-FDG)PET/CT检查是评价肿瘤分期、疗效评估应用最广泛的显像方法，其优势在于能够一次显像，即可显示全身病变情况。在MM初诊患者中，其显像结果与无进展生存期有关，此外，还可预测疾病进展。虽然现在大多数研究使用18F-FDGPET/CT检查作为评估MM预后标准的重要性，但是18F-FDG显像剂作为糖代谢示踪剂，不具有肿瘤显像的特异性，其检测恶性肿瘤的能力取决于病灶葡萄糖代谢水平，无法精确区分肿瘤与炎症等高葡萄糖代谢的非肿瘤性病变。因此，代谢率低的病变可能无法检测到。MM细胞中己糖激酶-2的低表达亦导致了MM诊断的假阴性结果，特别是18F-FDG PET/CT在MM的诊断假阴性率高，一部分MM病例只能发现骨质破坏的征象，但是18F-FDG摄取却未能显示出异常增高，导致其诊断、分期及疗效评估的价值均不高。由于特定的细胞分子遗传学异常和临床特征将导致MM患者风险及治疗预后的不同分层，因此，需要一种能够显示MM相关生物标记的无创性显像方法。
相比之下，免疫PET显像(ImmunoPET)是一种将具有高度敏感性和高分辨率的PET/CT检查与特异性单克隆抗体相结合的显像方法，其能够非侵袭性的对靶向标志物的表达及体内生物分布进行成像评估。与18F-FDG和其他小分子PET示踪剂相比，抗体显像剂提供更好的特异性和鉴别能力。由于ImmunoPET显像结合抗体的高特异性和结合亲和力以及PET显像的高灵敏度和定量分析优势，在活体水平寻找并靶向肿瘤细胞特异性膜蛋白而受到广泛关注，其通过抗体与肿瘤抗原结合而不是依赖于恶性肿瘤的代谢状态，允许具有低代谢活性的MM肿瘤细胞成像，进而实现MM的准确评价。
ImmunoPET显像的先决条件是分子探针的构建和选择。单克隆抗体由于具有高度特异性、靶向性、结合性、灵敏度的优势，非常适合用于ImmunoPET显像。但是，不同分子量的抗体和抗体片段在体内分布的半衰期不同。完整抗体的分子量较大(约150kDa)，在体内的血循环半衰期长，肿瘤渗透慢，摄取峰值延迟，免疫原性高。基于完整抗体的成像/诊断试剂的一个主要限制是血循环半衰期过长。通常，完整抗体示踪剂注射后几天，肿瘤摄取才达到峰值。因此在PET显像的肿瘤与血液的靶/非靶比值不高，肿瘤摄取峰时常出现注药后3天以后，使之在临床的应用受到限制。IgG抗体由Fc和F(ab')2片段组成，后者含有抗原结合位点。单独的F(ab')2片段具备与完整IgG抗体相同的免疫结合活性。对于ImmunoPET应用，使用诸如Fab的小抗体片段，其与完整抗体相比表现出快速血液清除，Fab单片段、F(ab')2片段、亲合体、单结构域抗体等抗体片段在保持优异的抗原结合亲和力的前提下，可以显示出较好的药代动力学曲线和肿瘤靶本比。抗体片段PET成像能够提早肿瘤摄取峰时，缩短显像等待时间并能够多次/重复显像。但是小分子量的抗体片段往往肾脏摄取增高，导致肿瘤摄取减低，分子量越小，这方面缺点越明显。相比之下，F(ab')2片段的分子量适中(100kDa)，其肿瘤摄取程度与完整抗体相近，但肿瘤摄取峰值提早在注药后几小时内，非常适合临床转化。这推动了基于抗体片段的成像探针的开发，该探针显示出良好的靶向功效和快速血液清除，使注射单克隆抗体显像剂后同天显像成为可能。
免疫球蛋白G降解酶IdeS(immunoglubulin G-degrading enzyme ofStreptococcus pyogenes,IdeS)是由人类致病菌酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)产生并分泌至胞外的一种半胱氨酸水解酶。该蛋白酶具有极高的底物特异性，仅识别IgG，在抗体下铰链区的特定位点进行酶切，且切割位点专一性高，产物均一，酶切IgG后可以获得完整的F(ab’)2片段和Fc片段。其中，与抗原结合的F(ab’)2片段分子量大小约为10 0kDa，Fc片段的分子量大小为25kDa。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何活体标记表达CD38的细胞或组织。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了CD38靶向的F(ab')2显像剂，为偶联有NOTA且标记有放射性核素的daratumumab的F(ab')2片段。
所述显像剂可按照所述显像剂的制备方法制备，所述制备方法包括：
A1)将daratumumab的F(ab')2片段与NOTA进行偶联反应，得到偶联有NOTA的daratumumab的F(ab')2片段；
A2)将所述偶联有NOTA的daratumumab的F(ab')2片段标记所述放射性核素，得到所述显像剂。
所述daratumumab的F(ab')2片段可通过IdeS蛋白酶切去daratumumab的Fc段得到。
利用所述IdeS蛋白酶酶切所述daratumumab产生Fc段可在消化缓冲液中进行，所述消化缓冲液可由溶质和溶剂组成，溶剂为水，溶质及其浓度分别为50mM磷酸钠和150mMNaCl，PH6.6。
所述酶切反应可在37℃进行。所述酶切反应的时间可为30分钟。
所述显像剂的制备方法，还可包括在切去daratumumab的Fc段后对所得反应产物进行纯化获得所述daratumumab的F(ab')2片段。
所述偶联反应中，daratumumab的F(ab')2片段与NOTA的摩尔比可为1:10-1：20。
所述偶联反应可在18℃-35℃(如28℃-35℃)条件下孵育1-2小时或4°条件下孵育大于12小时完成。
所述偶联反应可在PBS中进行，所述PBS的pH可为8.5-9.0。
所述显像剂的制备方法，还可包括在daratumumab的F(ab')2片段与NOTA偶联反应后对所得反应产物进行纯化获得所述偶联有NOTA的daratumumab的F(ab')2片段。
所述放射性核素可为64Cu。
将所述偶联有NOTA的daratumumab的F(ab')2片段标记所述放射性核素可在0.1MNaOAc水溶液中进行，所述0.1M NaOAc水溶液的pH值为4.5-5.5。所述标记反应中，每毫居64Cu与所述偶联有NOTA的daratumumab的F(ab')2片段的配比可大于等于1mCi：25μg。
所述标记反应可在37℃下进行。所述标记反应的时间可为60min。
所述显像剂的制备方法，还可包括在将所述偶联有NOTA的daratumumab的F(ab')2片段标记所述放射性核素后对反应产物进行纯化获得所述显像剂。
所述daratumumab(达雷木单抗)可为强生生物科技有限公司产品。
所述IdeS蛋白酶可为Promega公司产品。
所述NOTA(1,4,7三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)可为美国Macrocyclics公司产品。
所述显像剂的制备方法，也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂包括NOTA、放射性核素和所述daratumumab的F(ab')2片段。
所述成套试剂可用于制备CD38靶向的F(ab')2显像剂，或制备检测或辅助检测CD38的产品。
本发明还提供了下述应用：所述显像剂在制备检测或辅助检测CD38产品中的应用；
或，所述显像剂在检测CD38中的应用；
或，所述显像剂在检测或辅助检测表达CD38细胞或组织中的应用；
或，所述显像剂在制备检测或辅助检测表达CD38细胞或组织产品中的应用；
或，所述显像剂在制备诊断或辅助诊断以CD38为标志物疾病产品中的应用；
或，所述显像剂在制备对以CD38为标志物疾病分期或辅助分期产品中的应用；
或，所述在制备监测或辅助监测以CD38为标志物疾病的治疗效果产品中的应用；
或，所述显像剂在制备以CD38为标志物疾病预后产品中的应用；
或，所述显像剂的制备方法在制备检测或辅助检测CD38产品中的应用；
或，所述显像剂的制备方法在检测或辅助检测表达CD38细胞或组织中的应用；
或，所述显像剂的制备方法在制备检测或辅助检测表达CD38细胞或组织产品中的应用；
或，所述显像剂的制备方法在制备诊断或辅助诊断以CD38为标志物疾病产品中的应用；
或，所述显像剂的制备方法在制备对以CD38为标志物疾病分期或辅助分期产品中的应用；
或，所述显像剂的制备方法在制备监测或辅助监测以CD38为标志物疾病的治疗效果产品中的应用；
或，所述显像剂的制备方法在制备以CD38为标志物疾病预后产品中的应用；
或，所述成套试剂在制备CD38靶向的F(ab')2显像剂中的应用；
或，所述成套试剂在制备检测或辅助检测CD38产品中的应用；
或，所述成套试剂在检测CD38中的应用；
或，所述成套试剂在检测或辅助检测表达CD38细胞或组织中的应用；
或，所述成套试剂在制备检测或辅助检测表达CD38细胞或组织产品中的应用；
或，所述成套试剂在制备诊断或辅助诊断以CD38为标志物疾病产品中的应用；
或，所述成套试剂在制备对以CD38为标志物疾病分期或辅助分期产品中的应用；
或，所述成套试剂在制备监测或辅助监测以CD38为标志物疾病的治疗效果产品中的应用；
或，所述成套试剂在制备以CD38为标志物疾病预后产品中的应用。
所述检测CD38可为非诊断目的的检测。所述检测表达CD38细胞或组织可为非诊断目的的检测。
所述诊断可为疾病早期诊断，也可为疾病其他时期的诊断。
上述应用中，CD38的检测可利用分子影像进行，具体可采用免疫PET显像(ImmunoPET)进行。
所述以CD38为标志物疾病可为浆细胞相关性肿瘤或白血病。
所述浆细胞相关性肿瘤可为淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)。所述淋巴瘤具体可为多发性骨髓瘤。在本发明的一个实施例中，所述淋巴瘤为Ramos细胞系导致的淋巴瘤。在本发明的另一个实施例中，所述淋巴瘤为CCL-155细胞系导致的淋巴瘤。在本发明的另一个实施例中，所述淋巴瘤为Daudi细胞系导致的淋巴瘤。
所述白血病可为急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)或慢性淋巴细胞白血病(chroniclymphocytic leukemia，CLL)。
本发明的显像剂具有如下特点：(1)可有效的用于CD38表达阳性的肿瘤显像。(2)具有很好的在活体水平显示CD38表达的作用，具备很好的特异性和灵敏度。(3)在标记CD38时有理想和稳定的标记率、放化纯和比活度。(4)能够更早的达到肿瘤摄取的峰值，更适合潜在的临床显像转化应用。故，本发明的显像剂具有很好的应用前景。
附图说明
图1为daratumumab F(ab')2片段的制备和纯化示意图。
图2为HPLC鉴定daratumumab及其F(ab’)2片段。图中daratumumab表示完整抗体，daratumumab-F(ab)2表示daratumumab的F(ab’)2片段。
图3为SDS-PAGE鉴定结果。图中daratumumab表示完整抗体，daratumumab-F(ab)2表示daratumumab的F(ab’)2片段。
图4为Western Blot检测多种淋巴瘤细胞系的CD38相对于β-微管蛋白的表达水平。左图中最左侧泳道为蛋白质分子量标准，从上至下依次为260，160，125,90,70,50,38，30,25,15,7kDa。HBL1表示HBL-1。
图5为daratumumab和NOTA偶联的daratumumab的流式细胞检测结果。Cell only表示不添加任何抗体，anti-human AF488表示仅添加山羊抗人AF488二抗。
图6为FITC-daratumumab-F(ab')2与Ramos细胞的流式细胞检测结果。Cells+FITC-F(ab′)2表示FITC-daratumumab-F(ab')2与Ramos细胞的结合结果，Cells+FITC表示NHS-FITC染料与Ramos细胞的结合结果，Cells表示Ramos细胞。
图7为三种探针在Ramos荷瘤模型的ImmunoPET显像结果。最上面一排图为注射64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2后的结果，中间一排图为注射64Cu-NOTA-IgG-F(ab')2后的结果，最下方一排图为注射64Cu-NOTA-daratumumab后的结果。
图8为基于ROI的三组探针在主要脏器的放射性摄取对比。
图9为肿瘤与非肿瘤(T/NT)的靶本比值。＊＊表示差异显著。
图10为三组探针在注射后48h的离体生物分布结果。
图11为免疫荧光测定Ramos肿瘤的CD38表达水平(标尺为50μm)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、CD38靶向的F(ab')2显像剂的制备
本发明通过酶切CD38靶向的商品化抗体daratumumab，得到其F(ab')2片段并将其作为研究对象，使其偶联双功能螯合剂NOTA，使之被放射性核素64Cu标记，即得到CD38靶向的F(ab')2显像剂64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2。
1、daratumumab F(ab')2片段制备
达雷木单抗(daratumumab)是CD38靶向的商品化单克隆抗体，为强生生物科技有限公司产品。daratumumab F(ab')2片段是通过将daratumumab与IdeS蛋白酶(Promega公司)在37℃条件下在消化缓冲液(50mM磷酸钠，150mM NaCl，PH6.6)中孵育30分钟进行酶切而获得，确保1UI单位(即1个酶活单位)的IdeS蛋白酶最多处理1μg daratumumab，孵育结束得到酶切产物。将所得酶切产物再用MagneTM蛋白A磁珠(Promega公司，Cat.#V4831)进行纯化：将酶切产物与MagneTM蛋白A磁珠混悬30-60分钟后，酶切下来的抗体Fc段及未被酶切的含有Fc段的完整抗体结合在磁珠上，离心收集上清液，该上清液即为含有纯化的daratumumab F(ab')2片段的溶液(图1)。
将daratumumab的完整抗体、daratumumab F(ab')2片段进行HPLC(PerkinElmer)方法和SDS-PAGE胶的分子量鉴定。HPLC方法使用赛默飞的SEC S2000 3u色谱柱(300×7.8mm)，流动相采用150mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)，流速1.0mL/min，检测波长UV@280nm。结果可见，分子量较大的完整抗体(约150kDa)峰时较分子量较小的F(ab')2片段提前了约1.5min，二者峰有明显差别(图2)，此结果提示经过酶切及纯化后得到的F(ab')2片段分子量小于完整抗体，且产物峰独立，说明产物纯度高。SDS-PAGE胶鉴定结果进一步显示，对照蛋白marker，daratumumab的分子量约150kDa，而其F(ab’)2片段的分子量约100kDa(图3)，结果与预期分子量相符，证实本研究的制备成功。
2、NOTA偶联反应
所用1,4,7三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)为美国Macrocyclics公司(型号B-605)产品，其分子量为559.9g/mol。
将4mg daratumumab F(ab')2片段加入到500μL PBS中，并用Na2CO3(0.1M)将pH调节至8.5-9.0，得到daratumumab F(ab')2溶液。从冰箱中取出NOTA后室温放置10min使其温度与室温相近时取部分NOTA粉末，防止其潮解，然后溶于10μl二甲基亚砜中。按照daratumumab F(ab')2片段：NOTA的摩尔比为1:10的比例取适量加入到daratumumab F(ab')2溶液中，并立即充分剧烈震荡，继而室温(28-35℃)条件下在混匀器器上孵育2小时，即得到偶联产物。使用PD-10柱(GE Healthcare，预装填料为Sephadex G-25)以PBS作为流动相纯化偶联产物，得到daratumumab F(ab')2片段与NOTA的偶联产物，记为NOTA-daratumumab-F(ab')2。PD-10柱的纯化步骤如下：
1)平衡：利用PBS平衡PD-10柱，每次加满PBS，共洗涤4次；
2)上样：在柱子平衡后，将偶联产物加至柱子中，待偶联产物全部进入柱子后，加入PBS调整上样总体积(偶联产物+PBS)为2.5mL；
3)洗脱：步骤2)中样品全部进入柱子内后，向柱子中加入PBS洗脱，收集脱盐蛋白峰下的流出液，即为NOTA-daratumumab-F(ab')2纯化产物；PBS加样500μl/次，共5管，测定每管产物浓度，选取浓度最高的一管4℃保存备用。
按照上述方法，将daratumumab F(ab')2片段替换为daratumumab，其他步骤均不变，得到NOTA偶联的daratumumab。
3、64Cu标记反应
使用PETrace回旋加速器(GE Healthcare)生产148MBq(4mCi)的64CuCl2，然后将其加入至300μL 0.1M NaOAc溶液中，pH值调整为4.5-5.5，得到混合液。向得到的混合液中加入步骤2得到的NOTA-daratumumab-F(ab')2，NOTA-daratumumab-F(ab')2的添加量为每毫居64Cu中至少25μg NOTA-daratumumab-F(ab')2。将反应物置于振荡器上，在37℃反应60min即得到标记产物。将标记产物进一步通过PD-10柱纯化鉴定，纯化步骤同步骤2，检测流出液的放射性和蛋白浓度，选取放射性、蛋白浓度同时最高的重合峰管作为纯化的标记产物，即为CD38靶向的F(ab')2显像剂64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2。
NOTA-daratumumab-F(ab')2的64Cu标记率在92％以上。经过PD-10柱纯化，放化纯大于98％，比活度可达41.4Gbq/μmol(80μCi/μg)。
按照步骤3的方法，将NOTA-daratumumab-F(ab')2替换为NOTA偶联的daratumumab，其他步骤均不变，得到daratumumab偶联NOTA且标记64Cu的产物，记为64Cu-NOTA-daratumumab。
按照步骤1-3的方法，将daratumumab替换为人非特异性血清IgG，其他步骤均不变，制备偶联NOTA且被放射性核素64Cu标记IgG F(ab')2片段，记为64Cu-NOTA-IgG-F(ab')2，用作阴性对照。
实施例2、64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2显像剂的效果验证
一、体外生物实验
1、细胞培养
选择8种人源性淋巴瘤细胞系CCL-155(骨髓瘤)、Ramos(Burkitt's淋巴瘤)、Daudi(Burkitt's淋巴瘤)、Raji(Burkitt淋巴瘤)、Rec-1(Mantle细胞淋巴瘤)、HBL-1(人弥漫性大B细胞淋巴瘤)、Ly10(人弥漫性大B细胞淋巴瘤)、Z138(Mantle细胞淋巴瘤)，均为美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)产品。将各细胞分别在含有10％胎牛血清(FBS，Invitrogen)和1％青霉素/链霉素(Hyclone)的RPMI 1640培养基中、于37℃、5％CO2的湿润培养箱中培养，达到细胞培养的目的。
2、Western Blot检测结果
将上述各系淋巴瘤细胞的培养液分别离心并收集进行Western Blot检测，使用Pierce Coomassie蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)测量每种细胞系的总蛋白质浓度。分别提取每种细胞系总蛋白质40μg与Chameleon Duo梯形蛋白标志物(LI-CORBiosciences，USA)一起加载到4-12％Bolt Bis-Tris Plus凝胶(ThermoFisherScientific)中，在110mV、4℃条件下进行电泳75分钟；然后使用iBlot 2(ThermoFisherScientific)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上(7分钟)。将硝酸纤维素膜用Odyssey封闭缓冲液(LI-COR，USA)在室温下封闭1小时，并进一步与作为一抗的小鼠抗人CD38抗体(抗体按照1：1000的体积比稀释)或兔抗人β-微管蛋白抗体(抗体按照1：2000的体积比稀释)在4℃条件下孵育过夜；所有一抗均为诺伟司生物制剂公司(Novus Biologicals，Littleton，CO，USA)产品。之后用PBS-T(向PBS中添加吐温20得到的液体，吐温20的添加量为0.05％(体积百分比含量))将膜洗涤三次，与作为二抗的驴抗小鼠IRDye 800CW或山羊抗兔IRDye 680RD(二抗均为LI-COR产品，USA)在室温下孵育1小时。洗涤后的硝酸纤维素膜用Odyssey红外成像系统(LI-COR，USA)扫描成像并定量分析。一抗为小鼠抗人CD38抗体时，所用二抗为驴抗小鼠IRDye 800CW；一抗为兔抗人β-微管蛋白抗体时，所用二抗为山羊抗兔IRDye 680RD。
本实验Western Blot检测结果显示在这8种淋巴瘤细胞系中，45kDa的绿色条带代表CD38，55kD的红色条带代表β-微管蛋白，相对于β-微管蛋白这一管家蛋白的表达，Ramos细胞系的CD38表达水平最高，CCL-155和Daudi次之，Ly10细胞系的表达最低(图4)。因此，采用Ramos细胞系作为研究对象进行体内外实验。
3、流式细胞检测
(1)对daratumumab和NOTA偶联的daratumumab的细胞结合力测定
根据Western Blot的检测结果，选择Ramos、Daudi、CCL-155、HBL-1、Ly10这5种细胞系用于进一步流式细胞鉴定。先用冷PBS缓冲液洗涤以上细胞，之后用流式细胞仪染色缓冲液(eBioscience，USA)以1×106个细胞/mL的浓度在室温下孵育1小时进行封闭和预处理。将不同浓度的完整抗体daratumumab和NOTA偶联的daratumumab分别与各种细胞在冰上孵育60分钟结合细胞，抗体与细胞结合时的抗体浓度均为5或25nM，反应结束后用冷PBS洗涤细胞3次，然后将细胞与山羊抗人AF488二抗(3μg/mL，ThermoFisher Scientific)在冰上孵育30分钟并再次洗涤3次。使用LSRFortessa细胞分析仪(BD Biosciences)进行流式细胞分析，结果采用FlowJo软件(Tree Star，USA)处理。利用不添加任何抗体以及仅添加山羊抗人AF488二抗作为对照。
结果(图5)显示，在Ramos、Daudi、CCL-155三种细胞系中，daratumumab完整抗体及NOTA偶联的daratumumab抗体(NOTA-daratumumab)均显示出很高的细胞结合力，而且二者的结合力无显著差异。相比之下，daratumumab和NOTA-daratumumab与HBL-1、Ly10这两种细胞系的结合力低。这一结果提示Ramos、Daudi、CCL-155细胞系可用于CD38阳性细胞系模型。
(2)对daratumumab F(ab')2片段与Ramos细胞系的结合力测定
将NHS-异硫氰基荧光素(NHS-Fluorescein(5/6-carboxyfluoresceinsuccinimidyl ester，FITC)，NHS-FITC，ThermoFisher Scientific)与制备好的daratumumab F(ab')2片段进行偶联结合，具体方法将实施例1步骤2中的NOTA替换为NHS-异硫氰基荧光素进行。
偶联后利用PD-10纯化后，得到纯化后的偶联产物FITC-daratumumab-F(ab')2；将纯化后的FITC-daratumumab-F(ab')2与Ramos细胞在冰上孵育60分钟，之后用冷PBS洗涤3次。利用单独细胞和仅加入NHS-FITC染料的细胞作为阴性对照。流式结果显示，FITC-daratumumab-F(ab')2在Ramos细胞中显示出高水平的结合亲和力(图6)，提示NOTA偶联不影响daratumumab的细胞靶向结合能力。
二、活体动物实验
1、动物模型的构建
所有动物实验均按照北京大学第一医院动物管理和使用委员会批准的方案进行。选择具有T细胞和B细胞双重缺陷的CB17-SCID免疫缺陷小鼠(4-6周龄，雄性)用于淋巴瘤皮下肿瘤模型的构建，将小鼠随机分为三组，即实验组和对照组1、对照组2，每组5只。CB17-SCID免疫缺陷小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司产品。于每只小鼠右下背部皮下注射含1×107个Ramos淋巴瘤细胞的200μL Matrigel混悬液(Invitrogen,USA)。隔天监测小鼠的健康状况和肿瘤体积。当肿瘤直径达1cm时，可用于活体显像和生物分布实验。
2、荷瘤小鼠模型的ImmunoPET显像
待荷瘤小鼠肿瘤直径长至约1cm时，分别尾静脉注射5-10MBq的64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2或64Cu-NOTA-IgG-F(ab')2或64Cu-NOTA-daratumumab探针，64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2注射至实验组小鼠尾静脉，64Cu-NOTA-IgG-F(ab')2注射至对照组1小鼠尾静脉，64Cu-NOTA-daratumumab注射至对照组2小鼠尾静脉。
注射后10min、2h、4h、12h、24h、48h使用Inveon micro-PET/CT扫描仪(Siemens，Germany)进行PET显像。通过使用Inveon软件绘制感兴趣区域(region of interest，ROI)并进行定量分析，获得活体中不同时间点肿瘤、心血池(血液)、肝脏、肾脏内的放射性浓聚情况。放射性探针的含量用每克组织的放射性计数占总注入的放射性计数的百分比(％ID/g)表示，代表放射性摄取量。
最大密度投影(maximum intensity projection，MIP)PET显像结果显示，在CD38表达阳性的Ramos肿瘤模型中，在64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2注射后2h，肿瘤即可见明显的放射性浓聚。随着显像时间延长，肿瘤放射性摄取进一步增高，并于12h至24h达到摄取高峰。作为非特异性对照探针，注射64Cu-NOTA-IgG-F(ab')2探针后各时间点，肿瘤均未见明显放射性浓聚。以上两组注射后4h其血放射性摄取明显减低，且双肾及膀胱由于药物通过尿液排泄导致其放射性摄取明显增高。相比之下，注射64Cu-NOTA-daratumumab后，虽然肿瘤的放射性摄取随显像时间延长持续增高，但在血液和富血供器官中均呈高摄取状态，小鼠全身的放射性本底持续较高，且肝脏的放射性摄取较高，肿瘤显示对比度欠佳(图7)。
通过在不同时间点对肿瘤、心脏、肝脏和肾脏的ROI分析获得定量数据(图8)。注射64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2后，Ramos肿瘤在所有显像时间点均明显高于64Cu-NOTA-IgG-F(ab')2组，两种探针在Ramos模型的肿瘤摄取10min时分别为2.8％±0.7％ID/g和1.1％±0.1％ID/g，注药后12h肿瘤摄取达峰值，两种探针的肿瘤摄取分别为9.5％±0.7％ID/g和2.0％±0.3％ID/g，至注射后48h显像结束，64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2的肿瘤摄取仍达7.3％±1.5％ID/g。除肿瘤外的其它脏器摄取64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2和64Cu-NOTA-IgG-F(ab')2的放射性分布随时间延长逐渐减低，且两种探针间无统计学差异。以上结果提示64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2在CD38阳性淋巴瘤模型中的结合和分布具有特异性。相比之下，64Cu-NOTA-daratumumab的肿瘤摄取从3.1％±1.7％ID/g升高至8.3％±1.3％ID/g，肿瘤摄取峰时位于注射后48h，在注射后4-12h，其肿瘤摄取约5％左右，低于64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2片段(图8)。因此，64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2显像的优势在于能够在注射后早期即达到肿瘤摄取峰值。此外，64Cu-NOTA-daratumumab注射后的血液、肌肉(股骨周围肌肉)、长骨的放射性摄取均高于F(ab')2探针，与其在血液中的长循环时间有关。
针对同样靶向CD38的两种探针64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2和64Cu-NOTA-daratumumab，通过ROI计算出的脏器的生物摄取值进而得到肿瘤与非肿瘤(T/NT)的靶本比(图9)。注射64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2 12h-48h，其肿瘤/血液的T/NT值(即肿瘤与血液的放射性摄取量比值)从4.8±1.3升至18.9±4.6，肿瘤/肌肉的T/NT值(即肿瘤与肌肉的放射性摄取量比值，肌肉为股骨周围骨骼肌)从19.1±2.4升至40.4±1.6；相比之下，64Cu-NOTA-daratumumab的肿瘤/血液的T/NT值最大仅为1.2±0.3，肿瘤/肌肉的T/NT值最大为13.1±6.0，两种探针之间存在显著性差异(P<0.01)。以上结果提示，64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2不但能够在注射后早期获得肿瘤摄取峰值，且其本地清除快，靶本比比值高，CD38阳性表达的肿瘤显像效果更好。
3、64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2探针在淋巴瘤小鼠模型的生物分布
在步骤2在显像终末时间点48h显像后，通过CO2对小鼠实施安乐死并解剖获取感兴趣的组织和器官，包括心脏、肝脏、脾、肺、肾、胃、肠、胰腺、尾巴、皮肤、肌肉、骨骼、脑、血液和肿瘤。对获取的所有感兴趣组织和器官进行称重，并使用自动γ计数器(PerkinElmer，USA)测量其放射性计数。放射性探针的摄取量利用每克组织的放射性计数占总注入的放射性计数的百分比(％ID/g)表示。
生物分布研究结果如图10所示。注射64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2后48h，Ramos肿瘤的生物分布为7.7±0.6％ID/g，显著高于64Cu-NOTA-IgG-F(ab')2(0.8±0.2％ID/g，P<0.01)；64Cu-NOTA-daratumumab则为8.4±2.3％ID/g。F(ab')2探针在肾脏的生物分布均较高(约25％左右)，而其他正常脏器的生物分布均小于5％，相比之下，64Cu-NOTA-daratumumab在脾脏、肝脏、肾脏的生物分布均较高，且在48h时，血液及富血供组织的生物分布均大于7％。以上结果与显像结果一致，证实了显像结果的可靠性。
4、肿瘤免疫荧光染色鉴定
安乐死小鼠后，取Ramos肿瘤进行离体的CD38蛋白表达测定。按照标准程序进行肿瘤组织的免疫荧光染色。首先对肿瘤切片，后用冷丙酮固定30分钟，之后在室温下用10％驴血清封闭60分钟，再将切片与原代小鼠抗人抗CD38抗体(1：400，Novus Biologicals)或大鼠抗小鼠抗CD31抗体(1：100，ThermoFisher Scientific)在4℃条件下孵育过夜。然后洗涤切片并用二代山羊抗小鼠AlexaFluor488或Cy3标记的驴抗大鼠抗体(ThermoFisherScientific)染色。最后用含DAPI的硬封闭剂(Vector Laboratories，USA)处理载玻片，用Nikon A1RS共聚焦显微镜成像。
肿瘤组织的免疫荧光染色结果证实了不同淋巴瘤模型CD38表达水平的差异(图11)。Ramos肿瘤组织的CD38蛋白呈高表达。抗小鼠CD31染色能够显示肿瘤组织中的血管表达。CD38荧光染色强度与PET成像分析中显示的64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2摄取密切相关，进一步证实了64Cu-NOTA-daratumumab-F(ab')2通过ImmunoPET显像无创性评估淋巴瘤CD38表达水平的能力，并有望用于CD38表达阳性的肿瘤显像。

Claims (10)

1.CD38靶向的F(ab')2显像剂，为偶联有NOTA且标记有放射性核素的daratumumab的F(ab')2片段。
2.根据权利要求1所述的显像剂，其特征在于：所述显像剂按照所述显像剂的制备方法制备，所述制备方法包括：
A1)将daratumumab的F(ab')2片段与NOTA进行偶联反应，得到偶联有NOTA的daratumumab的F(ab')2片段；
A2)将所述偶联有NOTA的daratumumab的F(ab')2片段标记所述放射性核素，得到所述显像剂。
3.根据权利要求2所述的显像剂，其特征在于：所述daratumumab的F(ab')2片段通过IdeS蛋白酶切去daratumumab的Fc段得到。
4.根据权利要求2或3所述的显像剂，其特征在于：所述偶联反应中，daratumumab的F(ab')2片段与NOTA的摩尔比为1:10-1:20。
5.根据权利要求2-4中任一所述的显像剂，其特征在于：所述偶联反应在室温18℃-35℃下孵育1-2小时或4°条件下孵育大于12小时完成。
6.根据权利要求1-5中任一所述的显像剂，其特征在于：所述放射性核素为64Cu。
7.权利要求2-6中任一所述显像剂的制备方法。
8.成套试剂，包括NOTA、放射性核素和daratumumab的F(ab')2片段。
9.权利要求1-6中任一所述的显像剂在制备检测或辅助检测CD38产品中的应用；
或，权利要求1-6中任一所述的显像剂在检测CD38中的应用；
或，权利要求1-6中任一所述的显像剂在检测或辅助检测表达CD38细胞或组织中的应用；
或，权利要求1-6中任一所述的显像剂在制备检测或辅助检测表达CD38细胞或组织产品中的应用；
或，权利要求1-6中任一所述的显像剂在制备诊断或辅助诊断以CD38为标志物疾病产品中的应用；
或，权利要求1-6中任一所述的显像剂在制备对以CD38为标志物疾病分期或辅助分期产品中的应用；
或，权利要求1-6中任一所述的显像剂在制备监测或辅助监测以CD38为标志物疾病的治疗效果产品中的应用；
或，权利要求1-6中任一所述的显像剂在制备以CD38为标志物疾病预后产品中的应用；
或，权利要求7所述方法在制备检测或辅助检测CD38产品中的应用；
或，权利要求7所述方法在检测或辅助检测表达CD38细胞或组织中的应用；
或，权利要求7所述方法在制备检测或辅助检测表达CD38细胞或组织产品中的应用；
或，权利要求7所述方法在制备诊断或辅助诊断以CD38为标志物疾病产品中的应用；
或，权利要求7所述方法在制备对以CD38为标志物疾病分期或辅助分期产品中的应用；
或，权利要求7所述方法在制备监测或辅助监测以CD38为标志物疾病的治疗效果产品中的应用；
或，权利要求7所述方法在制备以CD38为标志物疾病预后产品中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在制备CD38靶向的F(ab')2显像剂中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在制备检测或辅助检测CD38产品中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在检测CD38中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在检测或辅助检测表达CD38细胞或组织中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在制备检测或辅助检测表达CD38细胞或组织产品中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在制备诊断或辅助诊断以CD38为标志物疾病产品中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在制备对以CD38为标志物疾病分期或辅助分期产品中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在制备监测或辅助监测以CD38为标志物疾病的治疗效果产品中的应用；
或，权利要求8所述的成套试剂在制备以CD38为标志物疾病预后产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述以CD38为标志物疾病为浆细胞相关性肿瘤或白血病。
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