CN105126128A - 一种新型肿瘤vegfr-3分子显像剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂，含有结构式为68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的多肽，其中DOTA为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸，通过1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸的螯合作用与靶向VEGFR-3分子多肽连接，并标记有放射性核素示踪剂68Ga。本发明提供的一种新型的利用PET检查的分子诊断剂68Ga-DOTA-TMVP1′，填补了利用PET检查肿瘤新生淋巴管多肽显像剂的空白，对以后的临床VEGFR-3分子诊断及指导肿瘤患者个性化有巨大的帮助。
Description
技术领域
本发明涉及核医学显像技术领域，尤其涉及一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂及其应用。
背景技术
宫颈癌、卵巢癌和子宫内膜癌是妇科最常见的三大恶性肿瘤疾病。其中卵巢癌具有不能早期诊断、易复发和预后差等特点。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，随着宫颈癌早期筛查的普及，宫颈癌的预后明显改善，但仍存在着复发难治性病例。我国宫颈癌死亡率占总癌症死亡率的第四位，占女性癌的第二位。因此迫切需要研发新型肿瘤显像剂及新型有效靶向药物以达到早期诊断及个性化治疗的目的！
肿瘤的发生及发展具有肿瘤特有的生物学过程。其中肿瘤细胞表面会特异性的表达肿瘤标志受体蛋白，另外肿瘤细胞会募集间质细胞如血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞分别形成新生血管和新生淋巴管。科学家研究发现肿瘤细胞特异的表面分子标志物与肿瘤组织的间质细胞可以作为靶向分子诊断与治疗的靶点，如临床使用核素标记的奥曲肽对神经内分肿瘤表面标志物生长抑素受体显像、核素标记RGD多肽对整合素受体显像和贝伐单抗用于抑制肿瘤新生血管的形成等。
随着研究的进展，小分子多肽靶向诊断剂越来越受到大家的关注，越来越多的具有靶向性的小分子多肽正在被不断的开发出来，如RGD肽、APN肽、BBN肽、奥曲肽等等。这其中奥曲肽、RGD肽的研究最广泛，18F-Galacto-RGD正在对多形性脑胶质瘤病人进行三期临床试验。
淋巴管形成是肿瘤生长过程中的必然阶段，许多肿瘤主要通过淋巴管转移，如乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等等。随着近来研究的加深，发现了一些的淋巴管内皮细胞特异性表达的蛋白，如LYVE1、PROX1、VEGFR-3，这些表面蛋白不但可以作为区分淋巴管同其他血管的标志，还可以作为靶向位点。VEGFR-3作为血管内皮生长因子的受体，可以促进肿瘤的增殖、侵袭与转移。它主要表达于新生淋巴管内皮细胞表面，但在血管生成过程中的血管内皮细胞表面也有少量的表达。
PET检查(即正电子成像技术)是近年来兴起的最先进的诊断技术，它相对于传统的SPECT检查(中文名称为单光子发射计算机断层成像术)，具有高空间分辨率、高清晰、高灵敏等特点，可以反应细胞能量代谢情况或细胞分子表达情况，结合CT或MRI是迄今为止对肿瘤诊断敏感度最高的检查技术。目前临床上PET显像剂为18F-FDG，可反应全身葡萄糖代谢情况。因为肿瘤细胞高能量代谢状态，因此可以达到诊断肿瘤病灶的情况。但18F-FDG显像剂也有一定的局限性。首先，18F-FDG只能评价肿瘤大小与代谢的改变，不能看出肿瘤内部的血管、淋巴管改变情况，往往是要在治疗几个月后，肿瘤的形态发生了改变，才能评价治疗是否有效，因此不能及时的了解治疗的效果。其次，由于18F-FDG是利用葡萄糖代谢的原理来进行检查的，因此不适合高血糖病人的临床检查。另外同一种肿瘤的患者其肿瘤生物学特性亦不同，肿瘤患者的个性化治疗越来越重要，如何选择合适的病人来进行靶向治疗越来越受到人们的关注。因此迫切的需要开发新型靶向诊断剂应用于临床PET显像技术。
科学家对放射性核素68Ga开始关注并进行研究开始于1950年，其半衰期为68分钟。因为几种68Ge/68Ga发生器的发现，从1970年始68Ga的研究重新被关注，放射性核素68Ga重新引起研究者的兴趣，有以下几点原因：一是近年正电子成像技术(PET)得到极大的发展，PET已经从一个研究工具进入临床应用阶段；二是能够稳定产生68Ga并用合适的洗脱液洗脱的68Ge/68Ga发生器已经被开发，其用合适的洗脱液洗脱68Ga后能够直接用于标记小分子药物；三是DOTA连接的多肽能够直接标记68Ga；四是多种单功能和双功能螯合剂被开发，使生物分子稳定的标记68Ga；五是68Ge/68Ga发生器产生68Ga不像18F一样需要现场加速器，只需要合适的洗脱液从68Ge/68Ga发生器淋洗。
DOTA作为放射性核素68Ga的双功能螯合剂具有标记简单易行，体内外稳定性高等优点。因此现临床上使用的生长抑素受体显像剂如68Ga-DOTA-TOC和整合素受体显像剂68Ga-DOTA-RGD等大部分使用DOTA。但DOTA与放射性核素68Ga也存在着在血液中放射性活度高导致肿瘤与正常器官比值低等优点，肿瘤显像效果差。因此多肽利用DOTA标记放射性核素68Ga是否能够具有良好的显像效果是不可预知的。
公开号为CN103804470A的申请中，利用鞭毛肽噬菌体肽库筛选出了对VEGFR-3具有亲和性的含有五个氨基酸的肽段LARGR(命名为TMVP1)。通过前期的实验表明，这个五个氨基酸的肽段对淋巴管具有高亲和性，有作为分子靶向诊断剂的潜质，但是对于具体如何应用到肿瘤诊断中并未涉及，该五个氨基酸的肽段LARGR在PET显像中的应用的效果如何也是未知。
另外，如果直接以该五个氨基酸的肽段应用到显象技术中存在诸多问题，由于螯合剂和放射性核素影响核心序列的空间结构，导致其多肽LARGR活性功能的丧失；放射性药物在体内的代谢放射会影响其显像效果，如放射性药物在血液内与血清蛋白结合导致全身显像背景高然后靶器官显影不明显；在体内存在大量的蛋白酶及多肽酶，导致多肽在体内的稳定性受到影响。
因此我们根据靶向VEGFR-3的多肽LARGR设计一种分子显像剂，并体内体外验证其作为肿瘤VEGFR-3显像的有效性。多肽结构设计的原则为利用多功能螯合剂标记放射性核素68Ga；双功能螯合剂及放射性核素不能影响LARGR的生物活性；为了增加多肽的稳定性使多肽成环；改善多肽在体内的代谢途径，提高分子显像肿瘤与正常器官比值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是发明一种新型VEGFR-3分子显像剂，在原有的5个氨基酸肽段的基础上进行改进，获得了结构式为:68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的分子显像剂，利用该分子显像剂不仅可以与VEGFR-3蛋白分子特异性结合而且适于分子显象。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂，含有结构式为68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的多肽，其中DOTA为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸，通过1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸的螯合作用与靶向VEGFR-3分子多肽连接，并标记有放射性核素示踪剂68Ga。
该分子显像剂包括放射性核素示踪剂68Ga、双功能螯合剂DOTA、靶向VEGFR-3分子多肽；靶向VEGFR-3分子多肽的氨基酸序列为GGG-Cyclic(CGLARGRGC)，为了便于描述，本发明将其命名为TMVP1′,序列如SEQIDNO.1所示，该多肽成环方式为半胱氨酸二硫键成环。
TMVP1′作为新型的分子靶向多肽能够特异性的结合于肿瘤组织内的VEGFR-3蛋白，将TMVP1′标记放射性核素68Ga利用PET仪器可以实现肿瘤组织VEGFR-3显像，另外因为肿瘤组织内部大量新生淋巴管的形成，利用标记放射性核素的TMVP1′可以实现早期发现肿瘤原发灶及淋巴结转移灶。TMVP1′不仅可以用于靶向显像，同时连接治疗药物可以用于靶向治疗从而实现对肿瘤患者的个性化治疗。
本发明提供的一种新型的利用PET检查的分子诊断剂68Ga-DOTA-TMVP1′，填补了利用PET检查肿瘤新生淋巴管多肽显像剂的空白，对以后的临床分子VEGFR-3诊断有巨大的帮助。
本发明所述的TMVP1′中，氨基酸序列LARGR和放射性核素68Ga之间增加GGG，具有以下优点:GGG作为PKMLinker(代谢动力改变连接氨基酸)，增加了68Ga-DOTA-TMVP1′的亲水性，使该药物大部分通过泌尿系统代谢从而减少肝脏的摄取，最终使该显像剂具有良好的肿瘤显像对比度；另外，增加GGG可以增加序列LARGR与放射性核素68Ga之间的距离，并使放射性核素68Ga和DOTA保持合适的距离，避免放射性核素68Ga和DOTA对核心结构LARGR的空间结构的影响。
另外，在体内存在大量的蛋白酶及多肽酶，将多肽LARGR成环增加其在体内的稳定性，避免其在体内被蛋白酶及多肽酶降解。
68Ga-DOTA-TMVP1′是第一个利用PET/CT检测肿瘤内新生淋巴管的靶向VEGFR-3的放射性示踪剂，PET/CT检查融合了形态影像学检查与功能影像学检查，既能显示体内病灶，又能表明病灶内的代谢、增殖状态等等，相对于常规的影像学检查具有明显的优势。本发明提供的放射性示踪剂68Ga-DOTA-TMVP1′同时利用了分子显像和PET/CT的优势。既能对肿瘤病灶进行定位，又可以对肿瘤表达VEGFR-3情况进行判定。
稳定性好，体外实验证实68Ga-DOTA-TMVP1′在生理盐水、半胱氨酸和正常人(指非肿瘤患者)的血清中可以稳定存在3个半衰期之久。
肿瘤显像及体内分布显像显示，该显像剂能够特异性的靶向肿瘤组织，并且利用该诊断剂对宫颈癌细系进行PET显像，可以清晰看到皮下瘤，该诊断剂主要通过肾脏排泄，除肿瘤及泌尿系统以外的其他正常器官摄取很少。
通过对该药品进行安全性检测，包括异常毒性实验、内毒素检测、普通细菌检测显示，制备后的该药品不存在安全隐患。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，本发明所述68Ga-DOTA-TMVP1′具有式1所示的化学式：
式1
进一步，所述结构式为68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的多肽保存于生理盐水、半胱氨酸或血清中。
采取上述进一步方案的有益效果为：68Ga-DOTA-TMVP1′在生理盐水、半胱氨酸或正常人的血清中可以稳定存在3个半衰期之久。
本发明还提供一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂制备方法，包括以下步骤：
1)合成多肽DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)；
2)将装有浓盐酸的注射器接入68Ge/68Ga发生器淋洗入口，然后推注，收集淋洗液，并检测淋洗液中68Ga的放射性计量；
3)按照每含有10mci68Ga的淋洗液、加入93μL1.25MNaAc以及10μg步骤1)合成的多肽DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的比例制备混合液；并进行反应；
4)反应完毕后，得到标记产物68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)，检测放射性活度及放射性化学纯度。
采取上述技术方案的有益效果为：
利用上述的制备方法，将本发明所述的TMVP1′标记上放射性核素68Ga，制备一种全新的分子诊断剂68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)。
利用68Ga进行标记时，如果68Ga与DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)多肽的标记比例不合适容易出现放射性活度低或放射性化学纯度低等问题；本发明选择了各组分的最佳的比例，从而不仅保证了上述分子诊断试剂的成功制备，而且利用上述方法制备的分子诊断试剂具有放射性化学纯度高、放射性活度好、稳定保存等优点。
进一步，步骤1)中，利用多肽固相合成技术合成多肽DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)。
进一步，步骤2)中，所述注射器中的浓盐酸的浓度为0.1M，体积为5mL。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用5mL的0.1M的盐酸淋洗68Ge/68Ga胶体柱，这样68Ge/68Ga胶体柱淋洗的比较充分，得到的68Ga的比活度比较高。
进一步，步骤3)中，所述反应的温度为100℃，所述反应时间为15分钟。
采用上述进一步方案的有益效果是：采用的上述反应条件，可以使DOTA连接的多肽标记68Ga的比例最高，标记比例可以达到95％以上；如果温度过低、时间过短，导致DOTA连接的多肽标记68Ga的比例比较低；如果进一步延长加热时间，标记比例反而不会继续增长。
进一步，步骤4)检测放射性活度及放射性化学纯度后，对制备的新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂进行纯化，具体包括以下步骤：利用无水乙醇激活C18柱，之后利用生理盐水清洗该柱残余乙醇待用。取经滤过的步骤4)制备的标记产物通过激活的C18柱，利用的生理盐水清洗残夜；利用无水乙醇洗脱，收集洗脱液，即为纯化后的68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的多肽。
本发明还提供上述的新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂在肿瘤诊断中的应用。本发明所述的分子显像剂可以作为核医学科肿瘤分子显像剂而进行广泛应用。
尤其在正电子成像技术检测中，本发明所述的分子显像剂可以检测肿瘤VEGFR-3受体显像。
该显像剂可以实现利用PET对VEGFR-3高表达的肿瘤如宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌分子显像。它是一种全新的针对新生淋巴管显像的分子显像剂。
本发明还提供一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂的使用方法，包括以下步骤：将含有68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的针剂，注射待显像的肿瘤组织，利用正电子成像技术进行显像。
附图说明
图1为利用HPLC检测68Ga-DOTA-TMVP1′在生理盐水中的稳定性的实验结果。
图2为68Ga-DOTA-TMVP1′的体外稳定性的验证结果。
图3为尾静脉注射68Ga-DOTA-TMVP1′后不同时间点的C-33A肿瘤模型的microPET显像结果。
图4为C-33A荷瘤鼠的68Ga-DOTA-TMVP1′的竞争性结合显像结果。
图5为C-33A和HeLa荷瘤鼠的68Ga-DOTA-TMVP1′与18F-FDG显像对比结果。
图6为C-33A荷瘤鼠的68Ga-DOTA-TMVP1′体内分布的结果。
图7为注射68Ga-DOTA-TMVP1′实验前后小鼠的活动及试验后小鼠的肉眼观脏器变化的结果。
图8为注射68Ga-DOTA-TMVP1′试验后小鼠的显微镜下观脏器变化的结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1制备68Ga-DOTA-TMVP1′
1.合成多肽DOTA-TMVP1′
使用多肽固相合成技术合成多肽DOTA-TMVP1′，即结构式为DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的多肽，该合成过程由上海药明康德新药开发有限公司完成，合成的DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)多肽纯度为95％，通过RP-HPLC和MS技术检测，其分子量为1514.65，质量为10mg。
2.合成68Ga-DOTA-TMVP1′
(1)68Ga的淋洗
用塑料制品5mL注射器吸取5mL0.1M的浓盐酸(禁忌使用金属制品如铁针头接触浓盐酸，原因是金属制品与盐酸反应使溶液中含有金属离子，影响68Ga的标记)。
将装有5mL0.1M的浓盐酸的注射器接入68Ge/68Ga发生器(ITG，德国)淋洗入口，然后缓慢推注。用5个1.5mL的EP管收集淋洗液，用放射计量器分别检测每管的放射性计量，检测结果分别为0.6mCi、10Ci、4mCi、1.5mCi、0.6mCi。根据经验淋洗的68Ga90％存在第二第三管，尤其第二管占50％以上的淋洗68Ga。
(2)68Ga标记方法：
配制1.25M的醋酸钠：称取102.5g醋酸钠，加入双蒸水定容到1000mL。
取93μL1.25M的醋酸钠置于一个新的EP管(即Eppendorf离心管)中待用。
将含有10mci68Ga淋洗液的EP管与93μL1.25MNaAC(中文名称为醋酸钠)混合，然后加入10μgDOTA-TMVP1′，混合后100℃加热15min(如表1所示)。标记完成后自然冷却至室温，用毛细吸管点样至快速薄层色谱层析板上，用甲醇与乙酸铵体积比为1:1的混合溶液作为展开剂，展开完成后晾干放入r-counts(中文名称为薄层层析条带扫描仪，型号为AR-2000，产自Bioscan公司，美国)上检测Rf值为1.0，检测的放射性化学纯度为90％。然后用0.22μm的滤器滤除在淋洗68Ge/68Ga胶体柱时携带的放射性胶体。
表1标记反应体系
| 名称 | 用量 | 反应条件 |
| DOTA-TMVP1′ | 10μg | |
| 68Ga淋洗液 | 10mci | 100℃ 15分钟 |
| 1.25M醋酸钠 | 93μL |
3.纯化
用10mL无水乙醇激活Sep-pakC-18柱(美国waters公司，WAT054955)、激活后10mL生理盐水清洗该柱残余乙醇待用。取经滤过的上述标记产物68Ga-DOTA-TMVP1′缓慢通过激活的Sep-pakC-18柱，利用5mL的生理盐水清洗残液。用1mL无水乙醇洗脱68Ga-DOTA-TMVP1′，为了保证收集的产物浓度高将洗脱溶液每6滴分别收集于一个1.5mL的EP管中，检测每管中的放射性活度及放射性化学纯度分别为0.2mCi、1mCi、2.5mCi、1mCi、0.6mCi。根据经验及实验结果第三管占到总放射计量的50％以上。
4.68Ga-DOTA-TMVP1′的质量控制
HPLC和iTLC-SG(Bioscan公司，美国)分析68Ga-DOTA-TMVP1′的标记效率及放射性化学纯度，检测的标记效率为>99％，放射性化学纯度为95％。
HPLC的参数及条件如下表所示。iTLC-SG采用的展开体系按照甲醇：0.1M醋酸铵＝1:1(v/V)配制。
HPLC的参数见表2，RP-HPLC流动相的A液为乙腈，B液为磷酸盐平衡液。
表2HPLC的参数
| 流量 | ％A | ％B | 曲线 | |
| 1 | 5 | 95 | 6 | |
| 5 | 1 | 5 | 95 | 6 |
| 10 | 1 | 80 | 20 | 6 |
| 15 | 1 | 100 | 0 | 6 |
| 18 | 1 | 100 | 0 | 6 |
| 20 | 1 | 5 | 95 | 6 |
实施例2体外稳定性试验：
取37MBq实施例1制备的68Ga-DOTA-TMVP1′分别置于半胱氨酸、生理盐水和正常血清(指非肿瘤患者的血清)中，并分别在37℃孵育30分钟、1小时、2小时和3小时后，然后使用HPLC和iTLC-SG测定不同样品的不同孵育时间的放射性化学纯度(RCP)。
实验结果：图1为利用HPLC检测68Ga-DOTA-TMVP1′在生理盐水中的稳定性的实验结果，HPLC检测68Ga-DOTA-TMVP1′在生理盐水的残留时间为10.6min；图2为68Ga-DOTA-TMVP1′的体外稳定性的验证结果，经HPLC及iTLC-SG检测68Ga-DOTA-TMVP1′在生理盐水中、半胱氨酸和正常血清中稳定性较好，三个半衰期后分别仍达到92％。
实施例3肿瘤模型的建立和PET显像
1、建立宫颈癌皮下瘤模型：
(1)细胞培养
宫颈癌细胞系C-33A、HeLa和SiHa(购自美国ATCC细胞库)用含有体积分数10％的血清的DMEM培养基(Gibco，ThermoFish公司，美国)培养，(37℃，5％C02培养箱培养)，待细胞融合度达到80％时用胰酶溶液(含有质量分数为0.25％的胰酶和质量分数为0.1％的EDTA)消化，用DMEM培养基终止消化后，800rpm离心5分钟，去上清，用磷酸盐缓冲液PBS(pH为7.4)重悬，再次800rpm离心5分钟，用PBS(pH为7.4)重悬后，细胞计数，结果为1×107/mL。(因为PBS为本领域常规的磷酸盐缓冲液，所以配方并未详细列出。)
(2)皮下瘤模型
取3-4周的BALB/c-nude小鼠，BALB/c-nude小鼠均购自北京华阜康生物科技股份有限公司。选择15只小鼠，将这15只小鼠的每只小鼠的腋窝脂肪垫处分别接种5×106个C-33A细胞；另外选择5只小鼠，将这5只小鼠的每只小鼠的腋窝脂肪垫处分别接种3×106个HeLa细胞。21-28天后待皮下瘤长到1-1.5cm2时，得到荷瘤小鼠，用于下面步骤的PET显像。
2、PET显像
按照本发明实施例1制备方法合成纯化68Ga-DOTA-TMVP1′，将18.5MBq该药物68Ga-DOTA-TMVP1′通过尾静脉注射入荷瘤小鼠(n＝5)中，异氟烷气体持续麻醉后分别于30分钟、60分钟、90分钟和120分钟对荷瘤小鼠进行microPET显像(静态采集10分钟)。进行竞争性结合实验使，将300μg的DOTA-TMVP1′与放射性药物68Ga-DOTA-TMVP1′(18.5MBq)从尾静脉同时注射入一只小鼠(n＝3)体内，于1小时对小鼠进行microPET显像。
为确认荷瘤鼠的肿瘤生长状况，将37KBq的18F-FDG(北京协和医院核医学科制备,制备方法参照IrieTetc.al，1982，Radioisotopes，PMID:7071382)通过尾静脉注入已经注射了实施例1所述的方法合成的68Ga-DOTA-TMVP1′并进行microPET显像过后24h的瘤鼠体内，于60min进行microPET。
PET显像实验结果：
图3为尾静脉注射68Ga-DOTA-TMVP1′后不同时间点的C-33A肿瘤模型的microPET显像结果；图4为C-33A荷瘤鼠的68Ga-DOTA-TMVP1′的竞争性结合显像结果；图5为C-33A和HeLa荷瘤鼠的68Ga-DOTA-TMVP1′与18F-FDG显像对比结果。
1)30min即可出现肿瘤显像。但随着68Ga-DOTA-TMVP1′注射的时间延长，肿瘤部位的显像出现先高后低的变化，而肝脏、血液的摄取却持续性降低。
2)300μg的DOTA-TMVP1′与显像剂68Ga-DOTA-TMVP1′同时注射入C-33A荷瘤小鼠内后，竞争性结合组小鼠的肿瘤摄取明显较未同时注射组的小鼠的肿瘤摄取低。提示该显像剂能被肿瘤特异性摄取。3)经18F-FDG确认肿瘤的活性状态及68Ga-DOTA-TMVP1′对宫颈癌模型C-33A、Hela显像，可得到68Ga-DOTA-TMVP1′对肿瘤的显像是通过与受体的结合而非渗漏。
实施例4体内分布试验
(1)实施例1合成的68Ga-DOTA-TMVP1′用无菌生理盐水稀释成1850KBq(50μCi)/100μL。
(2)将15只C-33A荷瘤鼠随机分成5个实验组，每组3只；其中4组为实验组分别由尾静脉注射100μL步骤(1)稀释后的药品，另外一组作为竞争性结合实验组，在注射步骤(1)稀释的药品前10min由尾静脉注射300μg冷的TMVP1′。另取100μL稀释后的步骤(1)样品用100mL的水稀释，混匀后从中取1mL作为标准品。
(3)实验组注射68Ga-DOTA-TMVP1′后分别于10min，30min，60min和120min颈椎离断处死荷瘤小鼠，然后解剖取出心肝脾肺肾和肿瘤等组织；竞争性结合实验组于60min处死。
(4)称量各个组织的重量并检测放射性活度，计算各个组织的％ID/g，标准品校正因衰变导致的各组的差异。数据统计学使用GraphpadPrism5.0软件进行分析。
图6为C-33A荷瘤鼠的68Ga-DOTA-TMVP1′体内分布的结果。
体内分布试验结果：68Ga-DOTA-TMVP1′主要经过泌尿系统排泄，肾脏在2h后的百分剂量率为2.34％ID/g。T/B(肿瘤组织摄取药物的百分剂量率/非肿瘤组织摄取药物的百分剂量率)随着注射时间的延长，出现先高后低的特点，在1h时T/B的比率最大，为3.03。
实施例5异常毒性实验
(1)选取4周龄ICR小鼠(购自北京华阜康生物有限公司)8只,体重17-20克，随机取5只作为实验组，3只为空白对照组，试验前和试验的整个观察期均按正常饲养条件饲养，实验前称老鼠的体重。
(2)实验组每只小鼠由尾静脉注射实施例1制备的68Ga-DOTA-TMVP1′500μL(37MBq)，5秒内匀速注射完毕，空白对照不做处理。
(3)观察：2天内实验组和空白对照组小鼠无死亡。5天内实验组和空白对照组小鼠饮食、呼吸、活动、反射、排便、痛觉、皮肤均正常。
(4)5天后称每个小鼠的体重，处死、解剖小鼠，实验组小鼠各脏器颜色、形态与对照组无明显差异。
(5)取实验组与空白对照组的每只老鼠的心、肺、肝、肾做石蜡包埋后取一张切片做苏木精-伊红染色法(即HE染色)处理。实验组与空白对照组的HE染色无明显区别。
异常毒性实验结果：药物处理组小鼠在整个实验过程中，未出现死亡，未发现饮食、呼吸、活动、反射、排便、痛觉、皮肤异常。药物处理组小鼠同未处理组小鼠实验前后体重变化无明显差异(P>0.05)，器官未见明显病变(见图7和图8)。注射68Ga-DOTA-TMVP1′实验前后小鼠的体重变化的结果见表3。
表3注射68Ga-DOTA-TMVP1′实验前后小鼠的体重变化的结果
实施例6安全性检测
(1)pH值检测：取精密pH试纸检测样品的pH值，按照中国药典2010年版二部附录ⅥH规定，pH值应为3.0-5.0。
(2)细菌内毒素检测：取本品适量，以细菌内毒素检查用水稀释至少30倍后，依法检查(中国药典2010年版二部附录ⅪE)，本品每1mL含内毒素的量应小于15EU。
(3)无菌检测：取本品，依法检查(中国药典2010年版二部附录ⅪH)，应符合规定。
药品安全性检测实验结果：为了监控药品合成过程中的安全性，在不连续的3天按照实施例1所述的方法合成三批药品进行自检。1)三批药品的pH值均为4。2)三批药品的内毒素含量均小于15EU/mL。3)三批药品均未检测到细菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂，其特征在于，含有结构式为68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的多肽，其中DOTA为1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸，通过1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸的螯合作用与靶向VEGFR-3分子多肽连接，并标记有放射性核素示踪剂68Ga。
2.根据权利要求1所述一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂，其特征在于，所述结构式为68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的多肽具有式1所示的化学式：
3.一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)合成多肽DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)；
2)将装有浓盐酸的注射器接入68Ge/68Ga发生器淋洗入口，然后推注，收集淋洗液，并检测淋洗液中68Ga的放射性计量；
3)按照每含有10mci68Ga的淋洗液、加入93μL1.25MNaAC以及10μg步骤1)合成的多肽DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的比例制备混合液；并进行反应；
4)反应完毕后，得到标记产物68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)，检测放射性活度及放射性化学纯度。
4.根据权利要求3所述一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述注射器中的浓盐酸的浓度为0.1M，体积为5mL。
5.根据权利要求3所述一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述反应的温度为100℃，所述反应时间为15分钟。
6.根据权利要求3所述一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂制备方法，其特征在于，步骤4)检测放射性活度及放射性化学纯度后，对制备的新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂进行纯化，具体包括以下步骤：
利用无水乙醇激活C18柱，之后利用生理盐水清洗该柱残余乙醇待用。取经滤过的步骤4)制备的标记产物通过激活的C18柱，利用的生理盐水清洗残夜；利用无水乙醇洗脱，收集洗脱液，即为纯化后的68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的多肽。
7.根据权利要求3所述一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂制备方法，其特征在于，标记产物68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)保存于生理盐水、半胱氨酸或血清中。
8.如权利要求1或2所述的新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂在肿瘤诊断中的应用。
9.如权利要求1或2所述的新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂在利用正电子成像技术检测肿瘤VEGFR-3受体显像中的应用。
10.一种新型肿瘤VEGFR-3分子显像剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有68Ga-DOTA-GGG-Cyclic(CGLARGRGC)的针剂，注射待显像的肿瘤组织，利用正电子成像技术进行显像。
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