CN104208727B - 一种新型肿瘤显像剂(99m)TC‑HYNIC/EDDA‑TMTP1的制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于肿瘤靶向肽TMTP1与放射性核素(99m)TC的可靶向于高转移肿瘤原发灶及转移灶新型核医学肿瘤显像剂(99m)TC‑HYNIC/EDDA‑TMTP1，它有TMTP1、谷氨酸、双功能螯合剂HYNIC、(99m)TC及共配体EDDA组成。(99m)TC‑HYNIC/EDDA‑TMTP1标记方法为通过双功能螯合剂HYNIC连接多肽与放射性核素(99m)TC，使用C‑18反相柱纯化产物，纯化后多肽的标记效率达到99％以上。(99m)TC‑HYNIC/EDDA‑TMTP1能够对高转移肿瘤细胞高亲和，并能够被TMTP1竞争性阻断，而且其与细胞的亲和与浓度、时间相关。本发明显像剂在体内体外稳定性好。应用核医学SPECT其能够对小鼠皮下瘤模型及转移模型都能够显像。可作为高转移肿瘤原发灶及转移灶新型诊断剂。
Description
一、技术领域：
本发明涉及一种新型肿瘤显像剂(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1的制备与应用，其技术特征包括： (99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1的标记制备、产物纯化及质量控制，TMTP1能够靶向识别高转移肿瘤原发灶及转移灶，将其标记放射性核素(99m)TC后应用单光子发射计算机断层成像术(SPECT)仪器能够对高转移肿瘤原发灶及转移灶进行分子显像。而且(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1在体内能够很快的经过肾脏清除，安全性高。
二、背景技术：
恶性肿瘤已成为威胁人类健康的首要疾病，2000年我国居民每死亡5人中，即有1人死于癌症，预计到2020年每年将有2000万起新的癌症病例，而癌症患者死亡人数将突破1000万人。现在实体肿瘤患者治疗方式仍以手术切除为主，辅以化疗、放疗和分子靶向治疗。而癌症患者的治疗关键是早发现、早干预。影像学检查CT/MR/PET/B超和实验室检查已经成为临床医生诊断早期肿瘤的依据，但是现有的诊断方法特异度及敏感度仍有不足之处，寻找一种特异的诊断方法依然是每一位科研工作者不懈追求的方向。
TMTP1是利用细菌鞭毛肽库展示技术高转移前列腺癌细胞系PC-3M-1E8和不转移前列腺癌细胞系PC-3M-2B4进行四轮正负筛选，免疫荧光法体外验证特异地与PC-3M-1E8细胞亲和的细菌克隆获得重复性序列(NVVRQ)，我们对多肽序列进行改造增加其在体内的稳定性TMTP1G(CGNVVRQGC)二硫键成环。体内实验验证TMTP1对高转移肿瘤细胞有高亲和性而对低转移肿瘤细胞低亲和性。体内实验验证TMTP1能够靶向于高转移肿瘤的原发灶及微转移灶。我们实验室利用TMTP1的肿瘤的靶向性将其连接白喉毒素(DT390-triTMTP1)及NBD(TMTP1-TAT-NBD)发现其能够携带DT390及NBT靶向地到达肿瘤部位，抑制肿瘤的生长及转移。
分子诊断已成为许多恶性肿瘤靶向治疗及预后判断的主要指标，如乳腺癌HER2，ER和PgR2阳性的病人可以选择赫塞丁Trastuzumab及雌激素受体拮抗剂等。肿瘤血管VEGFreceptor如果表达阳性，可以选择贝伐单抗抑制血管生成。奥曲肽和RGD多肽是目前临床应用最经典的分子诊断及治疗的多肽。 (99m)Tc-EDDA/HYNIC-TOC那能够很好的诊断神经分泌型肿瘤如胰腺癌、脑胶质瘤等，[18F]Galacto-RGD 能够对新生血管能力强的肿瘤进行诊断。
(99m)TC是核医学应用最广泛的放射性核素，达到80％，而且半衰期只有6小时，射程短安全性高。所以我们选择将TMTP1标记放射性核素(99m)TC，期望寻找一种对高转移肿瘤原发灶及转移灶诊断的分子显像剂。
三、发明内容：
基于以上高转移肿瘤原发灶及转移灶的诊断需求及技术背景，本发明将公开一种基于TMTP1标记放射性核素的化学结构式、标记方法和纯化方案，其发明名称为一种新型肿瘤显像剂(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1的制备与应用。通过该标记方法及方案能够获得一种新型的核医学肿瘤靶向分子诊断显像剂
(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1，利用此显像剂可以对高转移肿瘤原发灶及转移灶进行显像诊断。并可以指导临床应用TMTP1衍生的分子靶向治疗药物。
本发明的技术方案是：核医学肿瘤靶向显像剂(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1.该化合物有高转移肿瘤靶向肽TMTP1(GCGNVVRQGC)，双功能螯合剂HYNIC(6-肼基烟酸)和共配体EDDA(乙二胺-N，N′-二乙酸)组成。所述
(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1标记方法为：混合溶液10ug HYNIC-TMTP1、10mgEDDA、20mgtricine[三(羟甲基)甲基甘氨酸]1ml0.2M PBS(PH＝7.0)、5.5mci Na99mTcO4在1ml生理盐水中、20ul0.1N sncl2在反应条件95℃中反应15min，自然冷却至室温。
反相C-18柱子常规脱盐纯化：5ml无水乙醇激活C-18柱子，5ml生理盐水，5ml空气依次匀速过柱子，反应混合液以2秒一滴的速度过柱子，5ml生理盐水，200ul70％乙醇洗脱产物。
其标记效率达99％。
本发明达到以下效果：
1、将99mTc通过双功能螯合剂HYNIC稳定的标记TMTP1，(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1标记效率达99％。
2、在TMTP1N端连接谷氨酸增加其肿瘤显像的肿瘤与背景的比值，使显像更清晰。
3、选择EDDA作为共配体，使(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1经过肾脏代谢，安全性高。
4、体内实验验证其能够对高转移肿瘤原发灶及转移灶能够清晰的显像。
四附图说明
图1、(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1的结构式
图2、放射性化学纯度ITLC-SG检测
图3、细胞亲和试验及竞争性结合试验
图4、细胞亲和性时间曲线
图5、皮下瘤SPECT显像及竞争性显像
图6、卵巢癌肺转移模型SPECT显像及小动物活体实验
图7、肿瘤模型体内分布试验
五、具体实施方案：
1、(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1的制备
HYINC-E-G(CGNVVRQGC)二硫键成环有公司常规合成。合成纯度98％
自然冷却到室温
脱盐纯化方案：纯化柱子反相C-18柱，为了检验此纯化方案的可行性，设置对照组(标记混合液中不加HYNIC-TMTP1)
依次过柱溶液5ml无水乙醇、5ml生理盐水、5ml空气、反应混合液、5ml生理盐水。200ul70％无水乙醇洗脱产物，洗脱溶液每一滴分别放于1.5ml的EP管，检测每一滴的放射性活度及放射性化学纯度。
实验结果：反应混合液实验组和对照组按照上述纯化方案纯化，实验组放射性活性检测84％在70％乙醇洗脱液中第一滴放射性活性低约占5.3％，74.28％在第二滴第三滴，20％在剩余的洗脱液中。对照组的放射性活性90％以上在反应缓冲液及生理盐水滤液中，很少量的在70％无水乙醇洗脱产物。此结果说明此纯化方案效果理想。
2、放射性化学纯度检测：iTLC-SG应用三种展开剂检测合成产物的放射性化学纯度
①，丙酮决定没有结合多肽游离(99m)TC的量(Rf＝1.0)
②，0.1M柠檬酸(PH＝5.0)决定(99m)TC-Coligand和游离(99m)TC的量(Rf＝1.0)
③，甲醇∶乙酸铵＝1∶1(v/V)决定(99m)TC-colloid(Rf＝0)
(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1在三种展开剂中的迁移率分别是0.0，0.0，0.7-1.0，
实验结果：HYNIC-TMTP1标记效率99％以上((99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1)，游离(99m)TC、(99m)TC-coligand、 (99m)TC-colloid几乎为零。
3、体外体内稳定性试验：
①PBS合成产物1mci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1在1ml0.2M PBS(PH＝7.4)中放置6h，12h后检测其放射性化学纯度未见其放射性化学纯度改变。
②半胱氨酸1mc i(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1加入1ml0.2M半胱氨酸(PH＝7.4)37℃孵育12h后放射性化学纯度检测
③血清将1mci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1加入1ml小鼠血清中，37℃中孵育30min、60min、120min、240min 后，取200ul加入3kd的柱子中12000rpm离心30min，将离心下来的液体进行放射性化学纯度分析，利用三种展开剂决定其在血清中的稳定性。
④体内稳定性试验给每只昆明白鼠注射1mci的(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1后分别在1h、2h、4h的尿液，加入3kd滤膜过滤柱12000rpm离心30min后检测其放射性化学纯度。
实验结果：(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1在0.2M PBS(PH＝7.4)中放置6h，12h后仍然稳定。
(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1在极性极大的半胱氨酸溶液中依然稳定
(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1
4、LogP值
取2ml25mM PBS(PH＝7.4)和2ml正辛醇室温100rpm震荡过夜，第二天停止震荡PBS和辛醇会分为上下层，取上层500ul和下层500ul混合后加入1.5uci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1，设置两个副孔，剧烈震荡30min后，去上层100ul，下层100ul，用r-counts检测上层和下层的r计数。
实验结果：上层即辛醇层分别为686、640、750，下层即25mM PBS(PH＝7.4)层分别为290528、279392、356978.LogP＝Log上层/下层，LogP＝-2.648±0.026此结果说明理论上(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1主要经过肾脏代谢。
5、细胞实验
①亲和实验：细胞系选择宫颈癌细胞系C33A、卵巢癌细胞系L102、胃癌细胞系MNK-45sci等，分别用DMEM/1640培养基加10％胎牛血清培养，待其状态良好时胰酶消化后用细胞计数板计数，将其传代至24孔板中，每空接种3×105细胞，贴壁培养过夜。第二天将按上述标记纯化方法的1uci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1混合150ul无血清培养基加入每孔中，设置两个副孔，37℃，5％CO2孵育4h。
孵育4h后取每孔上清至巴氏管中，并用冰冷的细胞用PBS洗两遍。然后加入500ul0.1M NaOH 将细胞消化下来转移至一新巴氏管，用r-counts计数。
②竞争性结合试验：C33A细胞系接种于24孔板中(3×105/孔)，贴壁培养过夜，第二天每孔加入luci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1混合150ul无血清培养基，每孔加入竞争性结合多肽GC-10(TMTP1)，浓度设置如下，100ug、50ug、25ug、12.5ug、6.25ug、3.125ug/孔，设置三个副孔。
③亲和时间曲线：1uci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1加入MNK-45sci细胞，分别于30min、1h、2h、3h、4h、5h、6h终止结合。检测每个时间点的亲和百分比。
④亲和浓度依赖试验：C33A细胞接种于24孔板中(3×105/孔)，第二天每孔分别加入0.5uci、1uci、2uci、4uci、8uci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1，检测其亲和百分比。
实验结果：(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1能够特异的结合高转移肿瘤细胞系，并能被GC-11竞争性结合。其与细胞的亲和性随着时间的增加而增加(4h时达到最高亲和性)。也于所加的(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1浓度有关系，浓度越大，特异进入细胞的(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1越多(＜5uci/孔)
6、SPECT显像
皮下瘤肿瘤模型的建立：C33A、L102细胞用DMEM培养基加10％FBS培养，MNK-45sci培养于1640培养基加10％FBS中，胰酶消化约1min，10％FBS培养基终止消化，吸管吹打下来将其转移至15mlEP管中，800rpm 离心，弃上清，细胞用PBS洗一遍细胞沉淀，细胞计数板计数。BALB/C-nude小鼠饲养于SPF动物房中，小鼠周龄约4周时右腋窝皮下接种1×107/只C33A细胞、1×106/只MNK-45sci细胞、5×106/只L102细胞。约三周左右BALB/C-nude小鼠右腋下长出约0.8cm的肿瘤。
卵巢癌肺转移模型建立：BALB/C-scid全免疫缺陷小鼠约4周左右，尾静脉注射5×105/只L102(慢病毒转染Luciferase报告基因)细胞，三周后腹腔注射50ul荧光素(luciferin)加50ul3％戊巴比妥于BALB/C-scid 小鼠中，20分钟后放入小动物活体成像仪中，生物素发光模式成像。确定有肺转移后转移模型建立成功。皮下瘤显像：按照上述标记方法及纯化方法，将1mci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1溶于200ul生理盐水中，通 过尾静脉注射入BALB/C-nude肿瘤模型。3％戊巴比妥50ul腹腔麻醉，分别于30min、60min、120min、180min、240min及300minSPECT显像.
竞争性结合实验200ug GC-11混合1mci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1溶于200ul生理盐水中，spect显像如上所述。
卵巢癌肺转移显像：将卵巢癌肺转移模型每只尾静脉注射0.5mci(99m)TC-HYNiC/EDDA-TMTP1，腹腔注射50ul 荧光素和50ul3％戊巴比妥，20min后小动物活体成像，4h后SPECT显像。
实验结果显示：(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1能够特异的在动物模型的皮下瘤及转移灶显像，肾脏显影较明显，说明其经过肾脏代谢，肝脏显影不明显说明其经过肝脏代谢较少。
7、体内分布实验
宫颈癌皮下瘤动物模型建立如上，待其肿瘤生长至约0.8cm时，进行体内分布实验。每只老鼠尾静脉注射20uci(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1，分别于30min、1h、2h、4h眼球取血，然后颈椎离断处死小鼠，解剖老鼠将其心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠、肌肉和肿瘤取出，称量其重量，然后r计数仪测量其r-counts。并计算各个组织％ID/g
实验结果：2h时(99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1肿瘤的摄取％ID/g值较其它组织摄取高。 (99m)TC-HYNIC/EDDA-TMTP1氨基酸序列及结构说明： (99m)TC-HYNIC/EDDA-E-G(CGNVVRQGC)二硫键成环。
Claims (1)
1.(99m)TC-HYNIC／EDDA-TMTP1在制备用于高转移宫颈癌原发灶及转移灶SPECT显像剂中的应用，(99m)TC-HYNIC／EDDA-TMTP1由TMTP1-环肽、增加水溶性的谷氨酸Glu、双功能螯合剂HYNIC及共配体EDDA组成，其中TMTP1环肽由序列为GCGNVVRQGC的多肽通过二硫键成环形成，TMTP1的N端连接谷氨酸的C端，谷氨酸的N端连接双功能螯合剂HYNIC苯环上的羧基，HYNIC的肼基螯合(99m)TC，EDDA作为共配体螯合(99m)TC；10μgHYNIC-TMTP1、20mg三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、10mg乙二胺二乙酸(EDDA)溶解在1ml0.2M PBS、5.5mci Na(99m)TcO4溶解在1ml生理盐水中，20μl氯化亚锡混匀后在95℃加热反应15分钟，自然冷却后用C-18反相柱纯化得到该显像剂。
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