TW201511774A - 放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物，包括：一生物結合物(bioconjugate)以及一放射性核種，其中該生物結合物包含：一係對細胞膜表面受體具親和力並選自於由：胜肽及蛋白所組成之群之生物分子以及一金屬奈米粒子。本發明亦提供一種評估熱輔助腫瘤治療之方法及套組，係利用上述之醫藥組合物，評估其於腫瘤積聚之時間，建立進行射頻或雷射誘發熱輔助腫瘤治療之最佳策略。

Description

放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物及其用途
本發明係關於一種放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物及其用途。更具體地說，係指一種包含一生物分子(如胜肽及蛋白等)與奈米金屬粒子之生物結合物的醫藥組合物，以及將該醫藥組合物用於評估熱輔助腫瘤治療之用途。
癌症是國人十大死因之首，傳統治療常利用手術切除腫瘤，並合併放射線治療及化學治療。近年來在癌症治療藥物開發中，為降低正常組織毒性，能精準地將藥物遞送於治療區域，減少藥物投遞次數與藥量，並提高腫瘤組織毒殺效果之標靶治療(targeted therapy)藥物正蓬勃發展，其中生物醫材的開發，特別是奈米粒子(nanoparticle)作為藥物載體(drug carrier)，利用增強滲透與停留效應(enhanced permeation and retention effect，簡稱EPR效應)之被動型標靶特性(passive targeting)，可使藥物特異性積聚於目標腫瘤中；此外於藥物載體表面修飾具專一性之配位體(ligand)如抗體(antibody)、胜肽(peptide)或表皮生長因子(epidermal growth factor)等，於具有較高表現量之受體(receptor)或抗原之病灶，亦可利用主動型標靶(active targeting)增加藥物積聚於目標腫瘤。
許多惡性腫瘤皆有表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，簡稱EGFR)過度表現的現象，且惡性腫瘤之EGFR表現量與腫瘤侵犯性及治療抗藥性息息相關，此類癌症藉由激活表皮生長因子受體途徑，促進腫瘤細胞增生、血管形成、轉移且降低細胞凋亡，因此當前研究已將EGFR視為重要的抗癌藥物標靶。
另一方面，Cetuximab(Erbitux®,C225)為一人類和老鼠重組的嵌合單株IgG蛋白，具EGFR高親合力，為針對EGFR高表現腫瘤之治療藥物，藉由與EGF或其他ligand競爭與EGFR結合，阻止受體的磷酸化與活化EGF受體相關酵素而抑制其下游訊號傳遞，包含細胞增生、血管新生、轉移及細胞凋亡；臨床前試驗顯示cetuximab無論單獨或合併傳統化療藥物，在抑制腫瘤生長皆有顯著性的療效，於2004年經美國食品藥物管理局認可，與irinotecan合併使用於治療EGFR表現之轉移性直腸癌病患。
再者，奈米粒子等大分子載體，包含有機奈米粒子如微脂體(liposome)、微胞(micelle)及樹枝狀高分子(dendrimer)；無機奈米粒子如量子點(quantum dot)、氧化鐵奈米粒子(iron oxide nanoparticle)及奈米金粒子(gold nanoparticle，簡稱AuNPs)等，因腫瘤血管內皮組織間隙較大(可達數百奈米)，足夠容許奈米粒子通過，於腫瘤處滲出而積聚在腫瘤，且腫瘤的淋巴系統發展不完全，藥物無法經由淋巴系統回到循環系統而較長期停留於腫瘤，此效應即前述的EPR效應。EPR效應可視為一種被動式標靶作用，使藉奈米粒子攜載之藥物達到較為理想之藥物動力學分佈；另一方面此類大分子載體無法穿透健康的血管上皮組織，因此以奈米載體攜帶的化療藥物在正常組織的積聚量甚低。奈米藥物已被廣泛應 用於癌症的診斷及治療。
在無機奈米粒子中，以奈米金粒子為例，由於其有明顯的表面電漿共振吸收峰(localized surface plasma resonance)，具生物可容性，透過硫基或胺基的鍵結可以在表面修飾胜肽及蛋白等各式特異性配位體，且奈米金粒子屬惰性金屬，生物毒性極低，故目前已被廣泛應用做為腫瘤熱治療之媒介。然而一般的奈米金粒子只具有被動性標靶作用，主動性標靶奈米金粒子是近年研究的趨勢與重點。
綜上可知，迄今尚未有能兼具有效核醫造影診斷或放射核種治療功能，並能有效評估治療效果的具主動標靶能力之醫藥組合物出現。
鑑於上述先前技術的不足，本發明之一目的為提供一種放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物，包含：一生物結合物(bioconjugate)，其係包含：一生物分子與一金屬奈米粒子，其中該生物分子係對細胞膜表面受體具親和力並選自於由：胜肽及蛋白所組成之群，其中該生物分子為蛋白時，係進一步與一嵌合劑結合，該嵌合劑係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-Tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'''-Tetraacetic acid,DOTA)；以及一放射性核種，係選自由：銦、碘、鎦、錸、鎵、釔、鎝所組成之群。
於一實施樣態中，蛋白可為一單株抗體，例如，於部分實施樣態中，單株抗體可為一嵌合單株IgG抗體，但不僅限於此。又 於一具體實施樣態中，嵌合單株IgG抗體可為C225。於另一實施樣態中，蛋白可對表皮生長因子受體(epidermal growth factor,EGFR)具親和力。
於一實施樣態中，該胜肽可對胃泌素胜肽受體(gastrin releasing peptide receptor,GRPR)具親和力。胃泌素受體過度表現的地方，包括攝護腺癌、乳癌及非小細胞肺癌等。於一具體實施樣態中，該胜肽可為蛙皮素(Bombesin，BBN)胜肽，但不僅限於此。
於一實施樣態中該胜肽可進一步與一嵌合劑結合，該嵌合劑係二乙三胺五乙酸(DTPA)。
於一實施樣態中，上述與蛋白或胜肽結合之嵌合劑亦可視情況而為其他不同的嵌合劑，如：乙二胺四乙酸(EDTA)、硝基三乙酸(NTA)、N,N-雙(2-硫氫乙基)-N,N-二乙基乙烯二胺(N,N-bis(2-mercaptoethyl)-N,N-diethyl ethylene diamine,BMEDA)、去鐵胺(deferoxamine)及得措森(dexrozpxane)及其衍生物等，但不僅限於此。
於一實施樣態中，金屬奈米粒子可為一惰性金屬奈米粒子，包括但不限於：Au、Pt、Ir、Pd、Os、Ag、Fe等粒子。於一具體實施樣態中，金屬奈米粒子可係為Au。
於一實施樣態中，如蛋白可進一步經表面修飾而具有一乙醯硫基乙酸酯(acetylthioacetate,ATA)基團。
於一實施樣態中，金屬奈米粒子可進一步經表面修飾而具有一硫醇基團。
於一實施樣態中，該胜肽可進一步與一硫辛酸衍生物結合。 例如，於一具體實施樣態中，該硫辛酸衍生物可為馬來醯亞胺基-硫辛醯胺(Maleimido-Lipoamide)，但不僅限於此。
於一實施樣態中，該放射性核種可視情況為其他可與該生物結合物結合的任何放射性同位素。
本發明之另一目的為提供一種評估熱輔助腫瘤治療之方法，包括：a.施予一如上述之主動標靶性醫藥組合物至患有一腫瘤之一受試對象；b.利用單光子電腦斷層(SPECT/CT)影像及生物分布測定該醫藥組合物於該受試對象體內之生物分布數據與藥物動力學數據；c.依據該生物分布數據與藥物動力學數據，評估該醫藥組合物於該腫瘤之最大積聚時間，並據此決定進行熱輔助腫瘤治療時點。
本發明之又一目的為提供一種評估熱輔助腫瘤治療之套組，包括：前述之放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物；以及一操作指南，該操作指南係包含下列步驟：a.施予前述之醫藥組合物至患有一腫瘤之一受試對象；b.利用單光子電腦斷層(SPECT/CT)影像及生物分布測定該醫藥組合物於該受試對象體內之生物分布數據與藥物動力學數據；c.依據該生物分布數據與藥物動力學數據，評估該醫藥組合物於該腫瘤之最大積聚時間，並據此決定進行熱輔助腫瘤治療時間點。
於一實施樣態中，該腫瘤係源於一人類癌症細胞。於一具體實施樣態中，人類癌症細胞可為，例如：A549肺癌細胞株、PC-3攝護腺癌細胞株或MB231乳癌細胞株，但不僅限於此。
第一圖係顯示C225-AuNPs之製備流程圖。
第二圖係顯示DOTA-C225-AuNPs之製備流程圖。
第三圖係顯示裸奈米金(bare AuNPs)及生物結合物(C225-AuNPs及DOTA-C225-AuNPs)之吸收光譜。
第四A圖係顯示於不同時間量測111In-DOTA-C225-AuNPs在PBS(4℃)和在胎牛血清(37℃)中的放射化學穩定度。
第四B圖係顯示111In-DOTA-C225-AuNPs於A549之細胞攝取隨時間之變化。
第五圖係顯示荷A549腫瘤小鼠注射123I-C225-AuNPs、123I-C225、111In-DOTA-C225-AuNPs及111In-DOTA-C225後2及4小時之SPECT/CT影像及其腫瘤-肌肉活性比值，圖中L代表肝臟；T代表腫瘤；U代表膀胱。每個時間點之影像上層為冠狀面(coronal view)下層為軸狀面(transaxial view)。
第六圖係顯示生物結合物BBN-PEG-DTPA-AuNP(下稱BPDA)之合成示意圖。
第七圖係顯示硫辛酸的NMR測試結果。
第八圖係顯示馬來醯亞胺基-硫辛醯胺(化合物3)的NMR測試結果。
第九圖係顯示馬來醯亞胺基-硫辛醯胺-DTPA-CBBN(化合物4)之LTQ-MS測試結果。
第十A圖係顯示前驅物PEG-NH2之MALDI-TOF測試結果。
第十B圖係顯示PEG-硫辛醯胺(化合物5)之MALDI-TOF測試結果。
第十一圖係顯示以動態光散射儀測定BPDA之粒徑實驗結果。
第十二圖係顯示以動態光散射儀測定BPDA之表面電位實驗結果。
第十三圖係顯示111In-BPDA之放射化學合成結果，其中(A)In-111同位素位於前端。(B)111In-BPDA位於原點。
第十四圖係顯示將純化前及純化後的111In-BPDA，加入胎牛血清(FBS)或PBS內的混合液之藥物穩定度結果。
第十五圖係顯示將111In-BPDA加入PC-3及MB231細胞0.5、1、2、4及24小時後之細胞攝取結果，計算得24小時兩種細胞之C/M比。(n=3)。
第十六圖係顯示荷PC-3腫瘤小鼠於注射111In-BPDA後1、4、24及48小時之SPECT/CT冠狀面影像及T/M比之結果；圖中箭頭指出腫瘤的位置。(n=3)
接著，本發明之實施例依下列例子詳細描述，但不限於此。本發明之上述及其他目的、特徵及優點將因以下敘述及後附圖式而變得更加清楚。
一、放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物111In-DOTA-C225-AuNPs的製備與測試例
(一)製備例一：生物結合物之製備
1. C225-ATA之合成
請參見第一圖的製備流程圖，取4 mg之嵌合單株IgG抗體C255(0.027 μmol,2 mg/mL)加入N-琥珀醯亞胺-S-硫乙酸乙醯酯(N-succinimidyl S-acetylthioacetate,SATA,0.125 mg,0.54 μmol)於室溫下反應1 h，待反應結束以凝膠過濾法(Sephadex G50 gel filtration column)純化，以PBS作為沖提相，每毫升收集一管，而得C225-ATA，以紫外光/可見光光譜儀(UV/VIS Spectrophotometer)測定含C225抗體之管數。以蛋白質定量套組(Bio-Rad Protein Assay)進行C225抗體(C225-SH)與C225-ATA濃度之定量。
2.DOTA-C225-ATA之合成
請參見第二圖的製備流程圖，取1 mg之C255(6.58 nmol)加入異硫氰化苄基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-benzyl isothiocyanate-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid,p-SCN-Bz-DOTA,91.8 μg,131.6 nmol)於室溫下反應1 h，待反應結束以凝膠過濾法(Sephadex G50 gel filtration column)純化，以PBS作為沖提相，每毫升收集一管，以紫外光/可見光光譜儀(UV/VIS Spectrophotometer)測定含C225抗體之管數。以蛋白質定量套組(Bio-Rad Protein Assay)進行C225抗體(C225-SH)與C225-ATA濃度之定量。
3.生物結合物C225-AuNPs及DOTA-C225-AuNPs之製備
請分別參見第一圖及第二圖，取C225-ATA或DOTA-C225-ATA(0.5 mL,640 μg/mL)加入羥胺(hydroxylamine,0.5 mL,50 mM)於室溫下反應2 h，將-SH裸露後以凝膠過濾法(Sephadex G50 gel filtration column)純化，於奈米金(AuNPs,3×1011 particles/mL) 溶液中加入C225-SH或DOTA-C225-SH，反應液蛋白質濃度為50 μg/mL，於室溫下反應1 h，加入聚乙二醇-SH(polyethylene glycol-SH,PEG-SH,0.2mg/mL)後再反應1 h，使奈米金的表面完全被覆蓋。
C225-AuNPs或DOTA-C225-AuNPs以離心(3,500 rpm,10 min×3)方式純化。
4.生物結合物C225-AuNPs及DOTA-C225-AuNPs之吸收光譜
生物結合物C225-AuNPs及DOTA-C225-AuNPs特性之鑑定，即吸收光譜之結果，如第三圖所示，生物結合物C225-AuNPs及DOTA-C225-AuNPs相較於裸的奈米金顆粒(bare AuNPs)其最大吸收波長(λmax)由519 nm位移至534 nm及530.5 nm。
(二)製備例二：C225及其生物結合物之放射性同位素標誌及純化
1.碘-123標誌
取10 μg之C225(2 mg/mL)或C225-AuNPs，加入乙酸銨緩衝水溶液(0.5 M,pH 5.10)及所需放射活性之碘-123(Na123I)溶液至總體積為100 μL，分別以Iodogen(50 μg)於室溫(25℃)進行碘化反應，反應時間終了(5分鐘)以10 μL Na2S2O3水溶液(2 M)終止反應，並進行放射薄層分析：固定相為RP-18F254S，移動相為甲醇/緩衝水溶液=1/1(v/v)，將上述碘-123標記混合液加入300 μL PBS後載入Microcon YM-30薄膜過濾套組，以高速離心機(11,000 rpm)於4℃下離心25分鐘(25 min×2)，時間終了，將過濾膜反置，高速離心10分鐘後即可得最終產物123I-C225；123I-C225-AuNPs標誌混合液則以高速離心機(3,500 rpm)於4℃ 下離心10分鐘後即可得最終產物123I-C225-AuNPs。
2.銦-111標誌
取10 μg之DOTA-C225(2 mg/mL)或DOTA-C225-AuNPs，依序加入HEPES buffer水溶液(0.5 M,pH 6.0)及所需放射活性之銦-111(111InCl3)溶液使總體積為100 μL，於37℃進行反應，待反應時間終了(30分鐘)進行放射薄層分析：固定相為ITLC/SG，移動相為檸檬酸緩衝液(citrate buffer,0.5 M,pH 6.0)溶液。將111In-DOTA-C225標誌混合液加入300 μL PBS後載入Microcon YM-30薄膜過濾套組，以高速離心機(11,000 rpm)於4℃下離心25分鐘(25 min×2)，時間終了，將過濾膜反置，高速離心10分鐘後即可得最終產物111In-DOTA-C225；111In-DOTA-C225-AuNPs標誌混合液則以高速離心機(3,500 rpm)於4℃下離心10分鐘後即可得最終產物111In-DOTA-C225-AuNPs。
3.放射性同位素標誌及純化結果
C225之放射性碘-123同位素標誌之分析結果顯示，碘-123對C225之標記效率約85%，將反應混合液載入Microcon YM-30薄膜離心過濾匣，以離心過濾除去未反應的碘-123離子，得到純化之123I-C225產物。放射薄層分析結果顯示純化後產物放射化學純度>98%，放射化學產率>70%。
放射性銦-111同位素標誌DOTA-C225結果與碘-123相似，經純化後產物111In-DOTA-C225放射化學純度>98%，放射化學產率>70%。
生物結合物(C225-AuNPs及DOTA-C225-AuNPs)之放射性碘-123及銦-111同位素標誌，分析結果顯示其標誌效率約分別為50% 及55%，經由離心純化產物放射化學純度皆可高於95%。
(三)測試例一：活體外(in vitro)實驗
1.細胞培養
所有細胞培養皆於無菌層流操作臺中處理。肺癌細胞株A549(human lung carcinoma)，以含10%胎牛血清(FBS)之Ham's F12K medium培養於37℃、5% CO2之恆溫培養箱。
2.細胞攝取實驗
將2×105之A549腫瘤細胞種於6-well培養盤，待細胞約佔培養盤60-70%滿後即可進行細胞實驗。於實驗前將培養盤置於37℃水浴槽至平衡，取出並加入濃度約1 μCi/mL之111In-DOTA-C225-AuNPs，均勻混和後將培養盤中原有培養液置換為含放射性示蹤劑之培養液，置於37℃恆溫細胞培養箱內1、2、4及16h後，於各時間點將培養盤(n=5)取出，移除細胞培養液，以4℃之PBS溶液將細胞清洗乾淨後，利用胰蛋白酶將細胞自培養盤取下，以γ-counter測量細胞放射活性。
3.試驗結果
請參見第四圖，第四圖A顯示於不同時間量測111In-DOTA-C225-AuNPs在PBS(4℃)和胎牛血清(37℃)中的放射化學穩定度。第四圖B顯示111In-DOTA-C225-AuNPs於A549之細胞攝取隨時間之變化。試驗結果顯示111In-DOTA-C225-AuNPs在PBS(4℃)中有很好的穩定度，24小時後放射化學純度仍>95%；111In-DOTA-C225-AuNPs在血清(fetal bovine serum)中穩定度尚佳，24小時後放射化學純度仍>80%(第四圖A)。EGFR高表現之A549肺癌細胞對111In-DOTA-C225-AuNPs的攝取隨時間而增 加，於4h達最高133.9±5.7%AD/106 cell(第四圖B)。
(四)測試例二：活體(in vivo)實驗
1.腫瘤誘發
首先將實驗所需器械、腫瘤細胞(A549 adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells)及麻醉動物之麻醉劑藥準備完全，並確實做到器械消毒。裸鼠麻醉後，將腫瘤細胞懸浮液用針筒抽好進行皮下注射，經過適當時間即可誘發腫瘤生成。
2.單光子電腦斷層造影(SPECT/CT)
將荷腫瘤小鼠麻醉後，分別經尾靜脈注射11.1 MBq(300 μCi in 100 μL)之111In-DOTA-C225-AuNPs、111In-DOTA-C225、123I-C225-AuNPs或123I-C225，於注射後2及4小時利用高解析度的單光子電腦斷層造影(SPECT/CT)進行實驗動物全身性的放射藥物分佈掃瞄。
3.單光子電腦斷層造影(SPECT/CT)試驗結果
請參見第五圖，係將111In-DOTA-C225-AuNPs及123I-C225-AuNPs(~300 μCi)分別經由尾靜脈注射於皮下荷A549腫瘤之Balb/c裸鼠體內，於注射後2及4小時進行SPECT/CT造影之試驗結果。影像可觀察到小鼠的A549腫瘤有明顯放射活性積聚，且有高的腫瘤-肌肉活性比值(tumor-to-muscle ratio,T/M，請參見下表1)，注射4小時後T/M分別達5.8及6.7。由於奈米粒子(nanoparticle)會經由網狀內皮系統(例如肝臟及脾臟)吞噬再經循環系統清除，因此小鼠腹腔有明顯放射活性積聚；此外影像中也觀察到膀胱部位有大量放射活性積聚。相較於與生物結合物(C225-AuNPs及DOTA-C225-AuNPs)，未結合奈米金粒子之 放射性標誌C225，無論是123I-C225或111In-DOTA-C225，於注射後2及4小時腫瘤積聚之放射活性皆甚低，T/M僅約為1。造影結果顯示放射性標誌結合C225之奈米金粒子於活體內會快速被EGFR過量表現之腫瘤攝取，且於體內經由富含網狀內皮系統器官代謝，最終由泌尿系統排出體外。
4.生物分佈(biodistribution)及藥物動力學實驗
於荷A549腫瘤之小鼠(20隻)進行生物分布實驗，任意分為5組，每組4隻。每隻小鼠分別經尾靜脈注射3.7 MBq(100 μCi in 100 μL)之111In-DOTA-C225-AuNPs，於注射後0.5、1、2、4及24小時各犠牲一組老鼠，迅速摘取器官樣本，包括血液、肺臟、心臟、肝臟、小腸、大腸、腎臟、脾臟、膀胱、尿液、肌肉等器官及腫瘤。稱重後利用γ-counter計測其放射活性，再轉換成%ID/g(% injection dose per gram of organ)，分析各個時間點時放射性藥物於各器官之分布。其中血液獲得之不同時間點與藥物濃度分布曲線，可經由藥物動力學分析軟體WinNonlin分析，推算出藥物在血液中之半衰期。
4.生物分佈(biodistribution)實驗結果
於皮下荷A549肺癌腫瘤小鼠經尾靜脈注射碘-131標誌生物 結合物(131I-C225-AuNPs)，於注射後0.5、1、2、4及24小時進行生物分布實驗，結果如表2所示。注射後30分鐘血液中之放射活性為3.76±0.98，之後隨時間緩慢降低，顯示碘-131標誌生物結合物，在注射後短時間(30分鐘內)即被體內富含網狀內皮系統器官(肝臟、脾臟及骨髓等)大量攝取並代謝，且有相當程度的脫碘，造成胃部有明顯放射活性積聚，游離碘-131離子並快速排入尿液中，與SPECT/CT觀察結果一致。
5.藥物動力學實驗結果
131I-C225-AuNPs之體內半衰期經WinNonlin 6.3(Pharsight®)計算(採用non-compartment model)可得藥物動力學參數AUC(area under curve，時間與藥物濃度曲線下之面積)、T1/2(血液中的生理半衰期)和Cl(clearance rate，血液對藥物的清除率)等如表3。本案之生物結合物當C225結合於奈米金粒子後，其生理半衰期由79-129h大幅下降至5h；Roa等人報導，注射結合6-fluoro-6-deoxy-D-glucose(6-FDG)之奈米金粒子(粒徑約20 nm)於荷腫瘤小鼠，5分鐘後血液中濃度僅有0.59%ID/g，遠較直接注射6-FDG者為低(注射後30分鐘血液中濃度仍有1.11%ID/g)，顯示奈米金粒子為主要調控藥物動力學之因素。
由本案所提供的上述製備例證實成功製備含抗體與金屬奈米粒子之生物結合物，並進一步製得放射性碘-123及銦-111標誌並經純化的具主動標靶能力之醫藥組合物。由測試例利用SPECT/CT影像及生物分布測定前述醫藥組合物在荷腫瘤動物體內的分布與藥物動力學，評估其於結合放射性同位素之後，在腫瘤的最大積聚時間。基於測試例之結果，可得施予前述醫藥組合物後4小時 為進行射頻(radiofrequency)、紅外線(Infrared)、磁加熱(Magnetic heating)或雷射(laser)等其他誘發熱輔助腫瘤治療之最佳時間。
二、放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物111In-BBN-PEG-DTPA-AuNP(以下簡稱111In-BPDA)的製備與測試例
(一)製備例一：生物結合物BBN-PEG-DTPA-AuNP(下簡稱BPDA)之製備
1.化合物1：CBBN之合成
請參考第六圖所示，係生物結合物BBN-PEG-DTPA-AuNP(下稱BPDA)之合成示意圖。
本合成利用胜肽合成儀Liberty 1(CEM,Liberty 1,USA)的微波合成儀自動化合成所需序列，配置胺基酸0.2 M溶液於DMF中，配置縮合試劑HBTU與HOBt(0.5 M,DMF)以及催化劑DIEA(2M,NMP)於反應瓶中，另配置20%呱啶(piperidine)用於去除胺基保護團，由Liberty 1自動進樣系統完成試劑注射與反應，反應為9小時即完成合成，首先步驟一先以呱啶去除胺基的保護基(Fmoc)，然後步驟二再以HBTU與HOBt進行縮合(condensation)，反覆此兩步驟，結束後用甲醇清洗樹脂，將樹脂以TFA/酚/TES/水/EDT(82.5：5：5：5：2.5)溶液進行水解，攪拌約三個小時，以乙醚做沉澱析出，再利用乙醚清洗兩次，離心後減壓抽乾可得白色固體產物，此白色固體產物仍有不純物，再用流動注入分析收集系統MPLC(Teledyne Isco,Combiflash Rf,USA)分離(MeOH/DDH2O：1/10-4/1)最後將純化液減壓濃縮後，加水凍乾，可得白色固體產物，產率約為60%。此次合成序列為CQWAVGHLM。C46H70N14O10S2[M+H]+之MS(ESI)計算值為：1043.27，測試值為：1045.39。
2.化合物2：DTPA-CBBN之合成
首先取化合物1(70 mg,0.067 mmol)，置於圓底燒瓶中，加入磷酸緩衝液(pH 8)0.5毫升，待CBBN溶解後，加入DTPA二酐(239.6 mg,0.67 mmol)，觀測反應過程中CBBN分子量的變化，以質譜儀(LTQ-MS，Thermo,LTQ-XL Orbitrap,USA)觀測CBBN分子量消失即完成反應，接著加入1 M HCl使產物溶解，因產物在鹼性下反應而析出，隨後以MPLC分離產物，收集液減壓濃縮後凍乾，得白色固體狀的化合物2為28.5毫克，產率為30%。C60H91N17O19S2[M+H]+之MS(ESI)計算值為：1418.61，測試值為：1420.67。
3.化合物3：馬來醯亞胺基-硫辛醯胺(Maleimido-Lipoamide)之合成
由於DTPA-CBBN反應完後，(2-胺基乙基)-馬來醯亞胺((2-Aminoethyl)-maleimide)再與硫辛酸(Lipoic acid)反應的過程中會導致產率下降以及副產物無法分離的情況，因此本實施例先合成馬來醯亞胺基-硫辛醯胺。取(2-胺基乙基)-馬來醯亞胺(0.3g,1.1 mmol)與硫辛酸(0.2 g,0.9 mmol)溶解於3 mL DMF中，加入HOBt(0.17 g,1.1 mmol)、HBTU(0.4 g,1.0 mmol)和DIEA(0.2mg,1.5 mmol)於反應瓶中，反應8小時，以LTQ-MS觀測反應進行，反應結束後，加入五倍體積的水，並用5 mL DCM萃取兩次，收集有機層，隨後有機層再以0.5N HCl 20 mL萃洗兩次，取有機層，最後以飽和NaCl 10 mL溶液萃洗一次，有機層加入無水硫酸鎂後減壓抽乾，得淡黃色固體產物3有191.3毫克，產率為60%。
最後的產物結果亦利用NMR驗證，結果如第七圖以及第八圖 所示，其中第七圖為硫辛酸的NMR測試結果，第八圖係為化合物3的NMR測試結果。其中：C13H18N2O3S2[M+H]+之MS(ESI)計算值為：314.42，測試值為：361.0[M+2Na]2+。
NMR測試結果為：1H(CDCl3,300 MHz)δ=1.447(m,3H),1.631(m,3H),1.92(m,1H),2.12(dd,2H),2.45(m,1H),3.13(m,2H),3.46(q,2H),3.56(m,1H),3.69(t,2H),6.73(s,2H)。
4. 化合物4：馬來醯亞胺基-硫辛醯胺-DTPA-CBBN(Maleimido-Lipoamide)之合成
取DTPA-CBBN(10 mg,0.014 mmol)與馬來醯亞胺基-硫辛醯胺(2.7mg,0.016 mmol)於1 ml磷酸緩衝液(pH 7.0)下反應8小時，反應以LTQ-MS觀測DTPA-CBBN訊號是否消失來判斷反應終點，反應結束後直接以MPLC分離，將收集液減壓抽乾隨後凍乾，即得淡黃色固體化合物4，得1.7 mg，產率為14%。C73H109N19O22S4[M+H]+之MS(ESI)計算值為：1747.06，測試值為：1749.75。該化合物之LTQ-MS之結果如第九圖所示。可看到化合物質量峰值[M+H]+及[M+2H]2+之結果。
5.化合物5：PEG-硫辛醯胺(PEG-Lipoamide)之合成
取PEG-NH2(50 mg,0.02 mmol)與硫辛酸(4.12 mg,0.02 mmol)溶解於3 ml DMF中，取HOBt(4.6 mg,0.03 mmol)、HBTU(11.4 mg,0.03 mmol)和DIEA(7.7 mg,0.06 mmol)加入反應瓶中，攪拌至隔夜，加入10 mL乙醚使產物析出，離心後用乙醚清洗產物2次，再次離心收集沉澱物，以MPLC分離產物，將收集液減壓濃縮後凍乾，可得淡黃色化合物5，有90毫克，產率為60%。MALDI-TOF m/z(SA)[M+H]+：測得化合物5分子量約2412.791。
如第十圖之MALDI-TOF測試結果所示，與前驅物PEG-NH2分子量(2225.590)相減之結果2412.791-2225.590=187.201，與硫辛酸分子量(206.33)相當符合。
6.生物結合物：BBN-PEG-DTPA-AuNP(下簡稱BPDA)合成
將化合物4之馬來醯亞胺基-硫辛醯胺-DTPA-CBBN(0.2 mg,11 nmol)及化合物5之PEG-硫辛醯胺(0.2 mg,83 nmol)，加入AuNP(體積為1 mL)的溶液中，反應重量比為1：10，反應用的eppendorf試管用parafilm封口膜封好在室溫下避光、持續攪動反應2小時。反應完後，利用離心方式來純化。
將eppendorf試管離心(12,000 rpm)，離心完後將上清液吸出，再加入700 μL水，重複此步驟共3次，主要分離未吸附到奈米金上的化合物4之馬來醯亞胺基-硫辛醯胺-DTPA-CBBN及化合物5之PEG-硫辛醯胺。最後將產物BPDA避光保存於4℃冰箱中，並利用動態光散射儀測定粒徑並測量表面電位(zeta potential)。
(二)BPDA之測試例：以動態光散射儀進行測定BPDA之特性
1.粒徑
動態光散射儀(Dynamic Light Scattering,DLS，Nano-ZS,Malvern instrument,United Kingdom)的原理是利用使用單一波長的雷射光照射在分散在液相中的懸浮粒子表面，量測在幾個反射角的反射光強度，或者固定在某一個角度量測反射光強度的衰變情形，再配合理論分析模式由溶液的吸光係數以及表面材質之折射率，便可以得到粒子的平均大小及分布。將含待測物BPDA及奈米金粒子AuNP之水溶液樣品，分別配製成1 mL的水溶液裝在比 色管內，利用動態光散射儀的Nano-zetasizer之功能，量測粒子的水合直徑，以探討奈米粒子之穩定性。如第十一圖所示，本次測量待測物BPDA及奈米金粒子AuNP之結果分別為29.58 nm及17.54 nm，可以看到BPDA經修飾後具有較大的粒徑。
2.表面電位
表面電位(zeta potential)在膠體化學中，是指膠體粒子上累積的離子所引發的靜電壓；膠體粒子由雙層電子構成，包含固定層和擴散層。一個粒子可以藉由亨利公式(Henry's function)導出電泳的移動率，進而求出其表面電位的值。表面電位的測試需要以水溶液的形式量測，離子性之水溶液會影響磁性奈米粒子在水溶液中真實的表面帶電性，其粒子濃度須要大於或等於1 mg/mL才可以量測準確。
因此測定表面電價時，先將BPDA溶入去離子水中，取1 mL的奈米粒子1 mg/mL溶液置入含有電極板之測量槽內，以固定電壓計算出電泳之移動率，藉此得到表面電位(單位為mV)。如第十二圖所示，經測定BPDA之結果為-36.2±9.75 mV。
(三)製備例二：111In-BPDA之合成
參考先前技術(Hao-Wen Kao Y-YL et al.,Evaluation of EGFR-targeted radioimmuno-gold-nanoparticles as a theranostic agent in a tumor animal model.Bioorganic & medicinal chemistry letters 2013,23：3180-3185.)所揭示之方法，取1.6 μg之BPDA(10 μg/25 μL)，依序加入HEPES buffer水溶液(0.5 M,pH 6.0)及所需放射活性之銦-111(111InCl3)溶液使總體積為100 μL，於60℃進行反應，待反應時間終了(30分鐘)進行放射薄層分析，其 固定相使用ITLC/SG，移動相為檸檬酸緩衝液(citrate buffer,0.5 M,pH 6.0溶液；展開後並吹乾，利用Radio-TLC reader觀察放射化學純度(R.C.P.)結果，如第十三圖所示，可看到In-111同位素的Rf在0.9-1.0處，111In-BPDA的Rf則在0.0-0.1處。
將111In-DTPA-PEG-BBN-AuNPs(111In-BPDA)標誌混合液加入1mL水後全部吸取並加入eppendorf離心管中，以高速離心機(3,500 rpm)於25℃下離心(10分鐘)，取出上清液，再加入500 μL後離心，此步驟重複2次。上清液內測試後發現有較少活性，而經離心下來的最終產物111In-BPDA，其R.C.P.經測試大於90%，可用來進行體外及體內實驗。
(四)111In-BPDA之測試例一：於血清FBS與PBS之藥物穩定度
1.實驗步驟
準備4個eppendorf管，每管內各存有450 μL之胎牛血清(FBS)或磷酸緩衝液PBS)。於各管加入50 μL的111In-BPDA溶液(分別為純化前及純化後各2管)，活性約370 kBq(10 μCi)，混合均勻後移入37℃恆溫水浴槽培養0.5、1、2、4、17、24、42及67小時後，將eppendorf管內的藥物與FBS或PBS混合均勻後，取少許液體，使用放射薄層分析系統(固定相：iTLC SG，展開相：檸檬酸緩衝液，0.5 M,pH 6.0)來測定藥物的R.C.P.，並重複測定三次。
實驗結果：由於文獻(Senior J DC, Fisher D, Tilcock C, Gregoriadis G.: Influence of surface hydrophilicity of liposomes on their interaction with plasma protein and clearance from the circulation: studies with poly(ethylene glycol)-coated vesicles. Biochim Biophys Acta 1991, 11:77-82.)指出，因血清內含有各種蛋白質如溶小體(lysosome)或調理素(opsonin)等，皆會使藥物分解，穩定的藥物結構將可以在生物體內循環更久的時間。因此，本測試例將純化前及純化後的111In-BPDA，加入胎牛血清(FBS)或PBS內的混合液，其藥物穩定度結果如第十四圖所示，經混合均勻後測得的放射化學純度皆有逐漸下降的趨勢。在6小時後，PBS反應瓶內，不管是純化及純化後之111In-BPDA，其結果皆相當差，這可能是由於BPDA與鹽類反應作用，導致穩定度下降、藥物聚集的結果。
然而在FBS組並無此等現象。在FBS反應瓶內，可看到純化後的111In-BPDA在67小時候具有相當好的放射化學純度(約80.98%)。由於FBS與PBS相比，較接近藥物注射至動物體內之環境，此結果揭示了放射標靶奈米金粒子111In-BPDA，在動物體67小時內應有良好的穩定度。
(五)111In-BPDA之測試例二：體外實驗(in vitro test)
1.細胞培養
所有細胞培養皆於無菌層流操作台中處理。人類攝護腺癌細胞株PC-3(human prostate cancer)，以含10%胎牛血清(FBS)及1% PS之RPMI 1640培養基培養於37℃、充有5% CO2之恆溫培養箱。人類乳癌細胞株MB231(human breast cancer)，則以10% FBS及1% PS之DMEM培養基培養。
2.細胞攝取實驗
於實驗前先將PC-3及MB231細胞放大，並將兩種細胞分別 種入不同的96孔盤，每次實驗時，同一種細胞之孔盤則分成放射線藥物攝取組(用來觀察藥物的攝取)及MTT組(進行MTT測試(作法參考文獻：Wan F, You J, Sun Y, Zhang XG, Cui FD, Du YZ, Yuan H, Hu FQ: Studies on PEG-modified SLNs loading vinorelbine bitartrate (I): preparation and evaluation in vitro. Int J Pharm 2008, 359:104-110，以評估細胞之數量)。在進行MTT測試前，將事先調配的10倍MTT溶液(50 mg/mL溶於三次水)以free medium稀釋成1倍MTT溶液來使用。實驗進行方式如下：
(1)每一個孔種入2×104個PC-3或MB231細胞，培養24小時後，先移出培養基，再加入不同的藥物觀察積聚情形。每個孔加入相同濃度之111In-BPDA(0.1 μCi/200 μL free medium)，在37℃培養0.5,1,2,4及24小時(兩種細胞，每種藥物，每個時間，至少三種重複)。
(2)於實驗時間點，將放射線藥物攝取組各個well中的細胞培養液吸出，並以200 μL PBS(pH~7.3)輕輕清洗細胞，重複共三次。將吸出之液體放入計數管中，並使用gamma計數儀測量活性。
(3)放射線藥物攝取組接著於各個孔加入50 μL胰蛋白酶，經過3小時再將細胞液吸出，並以200 μL PBS清洗細胞，重複三次，並將吸出之液體放入計數管中，使用gamma計數儀測量活性。此處細胞之活度將正常化(normalize)至1×107個細胞的攝取活度，與培養基之活度相除，可算出細胞-培養基活性比(C/M ratio)。
(4)MTT組於培養結束之後，將各個孔中的細胞培養液吸出，並以200 μL PBS輕輕清洗細胞三次。接著加入事先稀釋完畢之100 μL之1倍MTT溶液(濃度為5 mg/mL)進行MTT測試；培養3 小時後，將MTT溶液從孔移出，接著加入200 μL DMSO將沈澱呈紫黑色之MTT formazan溶解，多次搖晃待完全溶解。最後將96孔盤放入ELISA reader測量吸光值(OD值)(讀取波長設為570nm)，並換算為各細胞之數量(由對應各細胞數具有OD值之標準曲線求得，標準曲線實驗事先進行)。
實驗結果：將111In-BPDA加入細胞經0.5、1、2、4及24小時後，可得到各個時間點細胞-培養基活性比(C/M比)之結果，如第十五圖所示，24小時內可看到PC-3及MB231細胞對111In-BPDA攝取逐漸上升的情形，在24小時有最高的攝取；PC-3及MB231於24小時之C/M比分別為6.09±0.58及5.26±0.73。
透過細胞攝取實驗之結果，可預測111In-BPDA注射至荷PC-3腫瘤之裸小鼠之後，於腫瘤內的積聚自1小時之後會逐漸上升，於24小時後可達到最高，並可能會停留在腫瘤內一段時間。
(六)111In-BPDA之測試例三：體內實驗(in vivo test)
1.腫瘤誘發
首先將實驗所需器械、PC-3腫瘤細胞(濃度為2×106個溶於100 μL PBS)懸浮液及麻醉動物之麻醉藥劑準備完全，並確實做到器械消毒。待裸小鼠麻醉昏迷後，將腫瘤細胞懸浮液用針筒抽好進行皮下注射，經過一段時間(約2週後)即可誘發腫瘤生成適當大小(100 mm3)，可進行動物實驗。
2.荷腫瘤小鼠生物分布實驗
使用荷PC-3腫瘤之小鼠(共6隻)進行生物分布實驗，並選擇4及24小時作為實驗時間點；任意將小鼠分為2組，每組3隻。每隻小鼠分別經尾靜脈注射1.11 MBq(30 μCi in 100 μL)之 111In-BPDA，於注射後4及24小時各犠牲一組老鼠，迅速摘取器官樣本，包括血液、肺臟、心臟、肝臟、小腸、大腸、腎臟、脾臟、膀胱、尿液、肌肉等器官及腫瘤，並分別秤取器官之重量。最後利用gamma計數儀計測各器官放射活性，並將活度與重量相除之後，正常化得到各器官之%ID/g(% injection dose per gram of organ)。將腫瘤及肌肉之%ID/g相除之後，可計算出腫瘤-肌肉活度比(T/M比)。
實驗結果：透過靜脈注射111In-BPDA於荷PC-3腫瘤小鼠4及24小時後，各犠牲一組老鼠進行生物分佈實驗，並計算各器官之%ID/g及標準差，結果如表3。4小時血液、肝臟、脾臟、膀胱及尿液等器官具有較高活度之積聚；推測是由於奈米粒子會經由網狀內皮系統(如肝臟及脾臟)吞噬再經循環系統清除，因此有明顯放射活性積聚。24小時之後可看到血液、尿液內的活度下降，然而肝臟和脾臟仍持續高積聚表現。在腦、肌肉及睪丸中可看到各時間點相當低的積聚表現，而PC-3腫瘤內的%ID/g±SD則從4小時至24小時逐漸上升至1.18±0.66。我們將腫瘤及肌肉的活性相除後，可得到4及24小時的腫瘤-肌肉活度比(T/M比)分別為3.88±2.01及8.00±2.99，顯示放射性標靶金奈米粒子111In-BPDA於腫瘤內有高的積聚表現，尤以24小時之結果較顯著。
3.荷腫瘤小鼠單光子閃爍造影/電腦斷層造影實驗
將荷PC-3腫瘤小鼠麻醉後，分別經尾靜脈注射11.1 MBq(300 μCi in 100 μL)之111In-BPDA，選擇1、4、24及48小時，利用高解析度的小動物單光子閃爍造影/電腦斷層造影(SPECT/CT)進行荷PC-3腫瘤小鼠之全身性放射藥物分佈掃瞄(每組設定為3隻)，觀察藥物於腫瘤的最大積聚時間及停留表現。將CT及SPECT影像重組並融合(fusion)之後，再利用Pmod軟體圈選ROI，可 得到腫瘤-肌肉活度比(T/M比)。
實驗結果：將荷PC-3腫瘤小鼠麻醉後，分別經尾靜脈注射11.1 MBq(300 μCi in 100 μL)之111In-BPDA，於注射後1、4、24及48小時利用高解析度的小動物單光子閃爍造影/電腦斷層造影(SPECT/CT)進行實驗動物全身性的放射藥物分佈掃瞄之結果，如第十六圖所示。
由圖中最左邊小鼠的照片，SPECT/CT影像則為每個時間點之冠狀切面(coronal view)之影像，其中以綠色箭頭則指出腫瘤的位置。影像上看到較主要的積聚器官為肝臟等，腫瘤的積聚不明顯。然而利用Pmod軟體圈選ROI後，可得到腫瘤-肌肉活度比(T/M比)，其結果顯示：1小時至48小時有逐漸上升的情形，其中4及24小時的T/M比為4.88±0.85及3.93±2.66，48小時後腫瘤內的積聚達到最高5.53±3.67。此結果與生物分布實驗的結果相當符合，顯示放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物111In-BPDA會於24小時內會積聚於腫瘤，並在48小時內持續累積於腫瘤當中，顯示其良好標靶特性。
所屬領域之技術人員當可了解，在不違背本發明精神下，依據本案實施態樣所能進行的各種變化。因此，顯見所列之實施態樣並非用以限制本發明，而是企圖在所附申請專利範圍的定義下，涵蓋於本發明的精神與範疇中所做的修改。

Claims (20)

  1. 一種放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物，包含：一生物結合物(bioconjugate)，其係包含一生物分子與一金屬奈米粒子，其中該生物分子係對細胞膜表面受體具親和力並選自於由：胜肽及蛋白所組成之群，其中該生物分子為蛋白時，係進一步與一嵌合劑結合，該嵌合劑係1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(1,4,7,10-Tetraazacyclotetradecane-N,N',N",N'''-Tetraacetic acid,DOTA)；以及一放射性核種，係選自由：銦、碘、鎦、錸、鎵、釔、鎝所組成之群。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該蛋白係對表皮生長因子受體(epidermal growth factor,EGFR)具親和力。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該蛋白係為一單株抗體。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之醫藥組合物，其中該單株抗體係為一嵌合單株IgG抗體。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之醫藥組合物，其中該嵌合單株IgG抗體係為C225。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該胜肽係對胃泌素胜肽受體(gastrin releasing peptide receptor,GRPR)具親和力。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該胜肽係為蛙皮素(Bombesin，BBN)胜肽。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該胜肽係進一 步與一嵌合劑結合，該嵌合劑係二乙三胺五乙酸(DTPA)。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該金屬奈米粒子係為一惰性金屬奈米粒子。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該金屬奈米粒子係為Au。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該抗體係進一步經表面修飾而具有一硫乙酸乙醯酯(acetylthioacetate,ATA)鍵結基團。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該金屬奈米粒子係進一步經表面修飾而具有一硫醇基團。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之醫藥組合物，其中該胜肽係進一步與一硫辛酸衍生物結合。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之醫藥組合物，其中該硫辛酸衍生物係馬來醯亞胺基-硫辛醯胺(Maleimido-Lipoamide)。
  15. 一種評估熱輔助腫瘤治療之方法，包括：a.施予一如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之醫藥組合物至患有一腫瘤之一受試對象；b.利用單光子電腦斷層(SPECT/CT)影像及生物分布測定該醫藥組合物於該受試對象體內之生物分布數據與藥物動力學數據；c.依據該生物分布數據與藥物動力學數據，評估該醫藥組合物於該腫瘤之最大積聚時間，並據此決定進行熱輔助腫瘤治療時間點。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該腫瘤係源於一人類 癌症細胞。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之方法，其中該人類癌症細胞係為A549肺癌細胞株、PC-3攝護腺癌細胞株或MB231乳癌細胞株。
  18. 一種評估熱輔助腫瘤治療之套組，包括：如申請專利範圍第1項至第14項所述之放射性標誌之主動標靶性醫藥組合物；以及一操作指南，該操作指南係包含下列步驟：a.施予該如申請專利範圍第1項至第14項中任一項所述之醫藥組合物至患有一腫瘤之一受試對象；b.利用單光子電腦斷層(SPECT/CT)影像及生物分布測定該醫藥組合物於該受試對象體內之生物分布數據與藥物動力學數據；c.依據該生物分布數據與藥物動力學數據，評估該醫藥組合物於該腫瘤之最大積聚時間，並據此決定進行熱輔助腫瘤治療時點。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之套組，其中該腫瘤係源於一人類癌症細胞。
  20. 如申請專利範圍第18項所述之套組，其中該人類癌症細胞係為A549肺癌細胞株、PC-3攝護腺癌細胞株或MB231乳癌細胞株。
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