CN110357945B - 一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒/腺病毒的模拟肽及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒/腺病毒的模拟肽及其应用，所述多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1‑SEQID NO.7之一所示的氨基酸序列。本发明的模拟肽，能高度模拟柯萨奇病毒/腺病毒的肿瘤靶向，这些多肽能高效结合CAR，从而靶向高表达该受体的肿瘤细胞，最终达到示踪肿瘤细胞的效果。

Description

一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒/腺病毒的模拟肽及其应用
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒/腺病毒的模拟肽及其应用。
背景技术
肿瘤己经成为威胁人类健康和生命的重大疾病之一，有效地治疗肿瘤是当前医学研宄的迫切任务。基因治疗在肿瘤治疗中的应用正在快速发展。肿瘤基因治疗常用的病毒载体有腺病毒载体、逆转录病毒载体及腺病毒相关病毒载体。腺病毒在体内能有效地感染肿瘤细胞，己经在肿瘤的基因治疗研究与实践中显示出了较好的应用前景。
腺病毒是一种的线型双链DNA无膜病毒，蛋白质外壳是直径约90 nm的正十二面体，由240个六邻体及12个位于正十二面体顶部的五邻体状壳粒组成。腺病毒壳体含有三种主要的蛋白：六邻体，五邻体基底和纤维蛋白。腺病毒感染细胞首先需要其外壳上的纤维蛋白与细胞表面的受体结合，然后腺病毒的五邻体蛋白亚基中的RGD(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸）基序或LDV(亮氨酸-天门冬氨酸-血管紧张肽）基序分别与细胞的整合蛋白结合，诱导腺病毒的内化过程。在血清学上，目前己经鉴定的人血清型有51种目前用于肿瘤基因治疗的主要是由II型和V型来源的E1区缺失的增殖缺陷型腺病毒。
纤维蛋白结合的细胞表面受体，即柯萨奇病毒-腺病毒受体（Coxsackie andadenovirus receptor，CAR）是一种跨膜受体，在调控相邻上皮细胞间的黏附中起着关键作用。许多研究表明，CAR可以影响肿瘤细胞的生长，粘附能力和细胞骨架，在肿瘤的转移和侵袭中具有复杂的功能。研究报道发现，与健康人组织相比，多种肿瘤组织，如肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、膀胱癌中的CAR受体表达水平显著提高。相反，腮腺多形性腺瘤、结肠癌、前列腺癌、恶性脑胶质瘤以及肾细胞癌亚型患者中发现CAR的表达量减少，肿瘤组织中CAR受体的表达具有差异性。
CAR受体在肿瘤腺病毒载体基因治疗过程中起着关键性的作用。小分子肽类用于靶向肿瘤组织的研究也较为广泛，多肽通常是非免疫原性的，且在体内表现出良好的肿瘤穿透性。只是目前针对CAR受体的相关靶向研究并不多，仍然需要人们进行更深入的探索。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术的不足，提供了一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒/腺病毒的模拟肽，这些多肽能高效结合CAR，从而靶向高表达该受体的肿瘤细胞，最终达到示踪肿瘤细胞的效果，上述多肽或其衍生的产品可以用于制备抗癌药物或显像制剂。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒/腺病毒的模拟肽，所述肽的氨基酸序列选自SEQ IDNO.1-SEQID NO.14 之一所示的氨基酸序列。
一种DNA片段，所述DNA片段包含编码上述模拟肽的核苷酸序列。
一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的上述DNA 片段。
一种宿主细胞，所诉宿主细胞含有上述表达载体。
一种二价体或多价体，由上述模拟肽组装而成，所述二价体或多价体具有靶向柯萨奇病毒/腺病毒受体的特性。
一种药物组合物，包括上述模拟肽和能杀伤肿瘤细胞的制剂。
进一步地，所述药物组合物包括上述二价体或多价体和能杀死肿瘤细胞的制剂。
一种药物组合物，包括上述模拟肽和显像制剂。
进一步地，所述药物组合物包括上述二价体或多价体和显像制剂。
上述模拟肽、二价体或多价体在制备用于治疗、预防或诊断肿瘤的药物或显像制剂中的用途。
本发明的多肽，能高度模拟柯萨奇病毒/腺病毒的肿瘤靶向，这些多肽能高效结合CAR，从而靶向高表达该受体的肿瘤细胞，最终达到示踪肿瘤细胞的效果。
基于癌症细胞内CAR受体和整合素受体的表达水平增高，可以利用重组腺病毒载体应用于肿瘤的基因治疗。针对CAR受体也可以将上述多肽用于靶向CAR受体高度表达的肿瘤，将能够靶向CAR受体的多肽序列与治疗肿瘤的药物相偶联，还可以将药物靶向递送到肿瘤部位，实现靶向性治疗。另外将可靶向CAR受体的多肽进行荧光标记或者放射性核素的标记后，进行体内的成像，还可以用于体内肿瘤的早期诊断和治疗后的效果评估。
有益效果：
1、本发明公开了一系列新的模拟柯萨奇病毒/腺病毒侵染细胞的高亲和力的多肽，可用于柯萨奇病毒腺病毒高转染效率的肿瘤早期诊断。
2、本发明的多肽均为低分子量多肽，合成成本低廉。
3、本发明的多肽均为首次报道，获取渠道方便。
4、本发明的多肽用ICG-Der-02花菁类近红外荧光染料，其侧链上有一个羧基官能团，适用作生物荧光标记。通过EDC/NHS催化体系可以有效地将将其活化，与多肽分子链末端的氨基共价偶联形成酰胺键，构建ICG-Der-02 –peptide分子探针，从而可使多肽带有明显的近红外荧光特性。
5、本发明的多肽肽对特异肿瘤细胞的结合性质将有可能实现特定恶性肿瘤的核医学诊断，从而达到实时无损在位监测早期恶性肿瘤的目的。柯萨奇病毒腺病毒转染在肝癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等多种实体肿瘤细胞具有高亲和效率，实施例中选用了HepG2肝癌细胞与多肽连接有较好的靶向，给药后肿瘤部位即有明显的荧光和放射性信号。
附图说明
图1 为实施例1中流式细胞仪检测细胞亲和力实验观察罗丹明B标记的多肽对HepG2肿瘤细胞的亲和力。
图2 为实施例2中小动物活体成像实验观察ICG-Der-02标记的多肽在HepG2荷瘤鼠体内的肿瘤诊断效能。
图3 为实施例3中YQC-5肽标准品的HPLC液相紫外色谱图。
图4为实施例3中YQC-5肽与Na127I反应液的HPLC液相紫外色谱图。
图5为实施例3中YQC-5肽与Na127I反应液的UPLC液相紫外色谱图。
图6为实施例3中YQC-5肽（RT=1.083）的质谱。
图7为实施例3中127I-YQC-5肽（RT=1.143）的质谱图。
图8为实施例3中放射性125I -YQC-5肽的放射性液相色谱图。
图9 为实施例3中125I-YQC-5肽在荷瘤小鼠体内的SPECT-CT成像。
图10为实施例3中125I-YQC-5肽在人肝癌HepG2荷瘤鼠体内的生物分布。
图11为实施例3中125I-YQC-5肽在人肝癌MHCC97-H荷瘤裸鼠体内的生物分布。
图12为实施例3中125I-YQC-5肽在人肝癌Bel-7404荷瘤裸鼠体内的生物分布。
图13为实施例3中125I-YQC-5肽在人宫颈癌Hela荷瘤裸鼠体内的生物分布。
图14为实施例3中125I-YQC-5在人结肠癌SW480荷瘤裸鼠体内的生物分布。
图15为实施例3中125I-YQC-5肽在人胰腺癌CFPAC-1荷瘤裸鼠体内的生物分布。
图16为实施例3中125I-YQC-5肽在人肺癌A549荷瘤裸鼠体内的生物分布。
图17为实施例3中125I-YQC-5肽在人恶性脑胶质瘤U87荷瘤裸鼠体内的生物分布。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
本发明的多肽序列具体如下：
YQC-3 Pro-Asp-Pro-Ser-Pro-Asn-Cys-Arg-Ile-His-Gln-Glu-Leu-Asp-Cys-Lys
YQC-4 Pro-Asp-Pro-Ser-Pro-Asn-Cys-Arg-Ile-His-Gln-Glu-Leu-Asp-Cys-Lys7-15二硫键
YQC-5 Pro-Ala-Pro-Ser-Pro-Asn-Cys-Arg-Leu-Asn-Ala-Tyr-Lys-Asp-Ala-Lys
YQC-6 Pro-Asp-Pro-Ser-Pro-Asn-Cys-Arg-Ile-His-Ser-Asp-Asn-Asp-Cys-Lys7-15二硫键
YQC-7 Asp-Pro-Ser-Pro-Asn-Cys-Ser-Leu-Ile-Gln-Glu-Leu-Asp-Ala-Lys-Arg
YQC-8 Gln-Ala-Tyr-Trp-Gly-Tyr-Arg-Gln-Gly-Gln-Ser-Val
YQC-9 Tyr-Ile-Asn-Ser-Ser-Gly-Ser-Thr-Asp-Ser-Asn-Pro-Ser-Leu-Lys
本发明的多肽均采用固相合成方法制得。YQC-3、YQC-4、YQC-5、YQC-6、YQC-7、YQC-8、YQC-9使用固相合成仪，按如下基本步骤进行合成，其中固定在树脂上的起始氨基酸为羧基端氨基酸，分别为赖氨酸、赖氨酸、赖氨酸、赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、赖氨酸。其中YQC-4与YQC-6的7位与15位半胱氨酸的巯基采用ACM保护，固相链接完成后进行脱保护后进行碘氧化形成二硫键。
具体如下：
先将Fmoc-Lys-Rink amide MBHA resin（芴甲氧羰酰基-赖氨酸-rink氨基树脂）0.33/2 mmol 6.06g溶胀于二甲基甲酰胺中，10mL/g树脂，接着用20% 六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc保护基（以下称之为脱帽），用二甲基甲酰胺洗涤脱帽子后的树脂，加入原料Fmoc-Asp（Boc）-OH 2.3g，缩合剂用HBTU 1.44g，反应时间30分钟，kaiser法检测，如检测结果为阴性，说明偶联反应完成，则接下去进行脱帽，时间30分钟，如检测结果仍为阳性，则说明偶联反应未完成或反应不完全，需要延长偶联时间或重新投料偶联，直至偶联反应完成。重复上述操作，依次偶联其他氨基酸，完成所有直链肽合成后，用甲醇洗涤所得到的peptidyl resin，真空干燥箱里充分干燥。
将120mL裂解液（10mL/g peptidyl resin）加入树脂中，25℃条件下，磁力搅拌2.5h后用砂芯漏斗将裂解液与树脂分离，弃去树脂，保留滤液。将滤液缓慢滴加到10eq体积的冰无水乙醚中，滴加完毕后，自然沉降30min。然后用高速离心机离心10min（4000rpm），弃去上清液，保留沉淀，将所得沉淀在干燥箱中干燥8-10h，得到干粉粗品。
取上述干粉粗品1g，用0.1% 三氟乙酸/水溶解。经过滤后，上样到C18制备柱，用高效液相进行梯度洗脱，收集目标肽的洗脱液体，检测液体纯度。把合格的样品混合后旋蒸，最后用冻干机冻干，得到多肽分子，纯度大于98%。
为了检测本发明多肽的药理活性，体外实验通过荧光染料罗丹明B对多肽进行标记，体内实验通过近红外染料ICG-Der-02对多肽进行标记，以检测其对肿瘤的体内外靶向性。在体外细胞亲和力实验和摄取实验中，本发明的YQC-3、YQC-4、YQC-5、YQC-6、YQC-7、YQC-8、YQC-9肽展现出了其良好的对肿瘤细胞柯萨奇病毒腺病毒受体的靶向能力。在体外细胞毒性实验中，本发明的YQC-3、YQC-4、YQC-5、YQC-6、YQC-7、YQC-8、YQC-9肽未表现出对细胞的毒性。
本发明靶向肿瘤的腺病毒模拟肽YQC-X（X=3-9），通过放射性核素125I标记后评估其作为靶向肿瘤分子探针的潜力。先后对YQC-X肽进行碘-127的冷标记和碘-125的放射性核素标记，确证125I-YQC-X肽的成功制备且结构正确。后面针对YQC-X（X=3-9）分别进行放射性标记，以125I-YQC-5肽为例，其放射性化学纯度可达98%，可以用于后续的体内生物分布实验，其在正辛醇-水中的分配系数（log P）为-0.54±0.03，表明其具有很好的亲水性，容易在体内进行代谢。接着体外考察了125I-YQC-5在血浆中的稳定性，将125I-YQC-5经尾静脉注射进入荷瘤鼠体内后于不同时间点利用SPECT-CT对其进行成像，在荷瘤鼠体H22内的显像结果显示， 125I-YQC-5可以有效的靶向至的CAR受体高表达的肿瘤，1-4 h内成像效果较好，其在肿瘤部位的摄取量可达6.78±0.83％ID/g。最后，又考察了125I-YQC-5在柯萨奇腺病毒高转染效率的HepG2、A549、CFPAC、Hela、7404、SW480、MHCC97-H和低转染效率的U87荷裸鼠体内的代谢分布，SPECT-CT显像结果显示125I-YQC-X对HepG2肿瘤有很好的靶向性，在注射2h后肿瘤部位放射信号就可达最强，对应的放射性摄取值可达7.03％ID/g，而对U87肿瘤不具有靶向性，结果表明125I-YQC-5肽柯萨奇腺病毒高转染效率肿瘤具有很好的靶向性和特异性。
125I-YQC-X（X=3-9）肽有潜力作为一种新的肿瘤显像试剂用于特异性地模拟腺病毒靶向高转染效率的肿瘤，进行CAR受体肿瘤的体内显像，实现早期肿瘤的诊断。
实施例1
1、标记体外实验荧光染料
本发明应用于体外细胞实验的荧光染料为罗丹明B（Rhodamine B），简称RhB，分别与本发明YQC-X(X=3-9)肽通过酰胺键连接，简称分别为YQC-X-RhB，连接方法具体为取 1mg罗丹明B（详见参考文献： Cao, J., et al., Fast clearing RGD-based near- infrared fluorescent probes for in vivo tumor diagnosis. Contrast Media MolImaging, 2012. 7(4): p. 390-402）溶于 1 ml PBS（pH为7.4）中，加入 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）（摩尔比 Rhodamine B:EDC:NHS = 1:1.5:1.5），避光反应 4h，活化。分别称取 1mmol YQC-X肽溶入含有荧光染料罗丹明 B的 1ml PBS缓冲液（pH7.4）中，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚糖凝胶 G-25 柱，PBS缓冲液（pH7.4）作洗脱液，得到纯化的YQC-X-RhB，-20℃储存备用。
2、体外细胞亲和力实验
将培养好的人肝癌HepG2细胞从12孔板上洗脱后重悬于PBS溶液，分别与罗丹明B标记的YQC-X（X=1-9）肽(10 umol/L)共孵育2小时，并通过流式细胞术检测其平均荧光强度,荧光强度越强证明对细胞的亲和力越强。当探针与细胞上的受体亲和力强时，流式细胞仪检测出的细胞平均荧光强度值高，如图1。体外亲和力实验结果显示浓度相同的标记了RhB的YQC-X（X=3-9）肽的探针分别与柯萨奇腺病毒高转染效率的HepG2细胞孵育后，在HepG2细胞中YQC-7、YQC-6、YQC-8、YQC-9肽探针平均荧光强度大于100，YQC-3、YQC-4、YQC-5肽探针平均荧光强度大于300，空白染料平均荧光强度为10，结果表明这些探针在与HepG2细胞亲和力强弱对比中，本发明YQC-3、YQC-4、YQC-5的强度最大。而对柯萨奇腺病毒低转染效率的U87细胞，YQC-X(X=3-9)多肽探针平均荧光强度都很低。说明其模拟腺病毒的特异性很强。
实施例2
1、标记体外实验荧光染料
本发明应用于体内动物实验的荧光染料为近红外有机染料ICG-Der-02，分别与YQC-X(X=3-9)通过酰胺键连接，简称ICG-Der-02-C1，ICG-Der-02-C2，连接具体方法为取2mg ICG-Der-02（详见参考文献）溶于1ml PBS（pH为7.4）中，加入1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）（摩尔比ICG-Der-02：EDC:NHS=1:1.5:1.5），避光反应4h，活化。称取1mmol YQC-X（X=1-9）肽溶于含有荧光染料ICG-Der-02的1mlPBS缓冲液（pH=7.4），室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚糖凝胶G-25柱，PBS缓冲液（pH=7.4）作洗脱液，得到纯化的ICG-Der-02-C1，ICG-Der-02-C2，-20℃储存备用。
2、荷瘤鼠肿瘤靶向光学示踪
在注射后0-24小时，通过近红外成像系统在不同的时间点分别对裸鼠进行成像并且对比不同探针之间的不同。对肿瘤部位荧光信号强度的目标特定区域（ROI）分析，进行如下计算：肿瘤/正常组织比值=[肿瘤信号强度-背景信号强度]/[正常组织（肌肉）信号强度-背景信号强度]，来定量不同探针在不同肿瘤中的靶向，该值越大说明其靶向性越强。
HepG2荷瘤裸鼠均被尾静脉注射ICG-Der-02标记的YQC-X（X=3-9）。在注射后0-24h，通过近红外成像系统在不同时间点分别对裸鼠进行成像检测。
HepG2肝癌细胞是柯萨奇腺病毒高转染效率的细胞，如果一定的时间内探针在裸鼠体内肿瘤部位聚集且能持续一定的时间就说明这种探针能靶向到肿瘤细胞上。如图2所示，分别注射相同量的ICG-Der-02及ICG-Der-02标记的几种探针到HepG2荷瘤裸鼠后，ICG-Der-02及ICG-Der-02-YQC-X（X=3-9）注射2h后荧光分布全身，然后逐渐转移到肾-膀胱代谢，肿瘤部位无明显荧光信号，探针ICG-Der-02-YQC-X（X=3-9）注射4h后肿瘤部位荧光信号逐渐增强，随着探针在体内的代谢，探针在肿瘤部位聚集越来越多，其荧光强度在注射6h达到峰值，肿瘤边缘轮廓较清晰，24h后肿瘤部分荧光信号基本消失。用ROI值进一步定量分析探针在肿瘤部位聚集的荧光强度，注射ICG-Der-02-YQC-X（X=3-9）探针6h后肿瘤荧光强度与正常组织比值分别为15.23±0.53，8.41±0.24。T/N值越大靶向性越强，这一结果说明探针ICG-Der-02-YQC-X（X=3-9）都有较好的靶向性，且可以快速靶向到肿瘤部位，这一结果从动物水平上说明本发明的病毒模拟肽能够模拟柯萨奇腺病毒靶向肿瘤，进行早期诊断。
实施例3
本发明所发现的YQC-X（X=3-9）多肽是经过计算机模拟设计开发出，合成并纯化，利用高效液相色谱检测此多肽的纯度达98%。Iodogen氧化法对可对含有酪氨酸、组氨酸、色氨酸残基的多肽进行碘标记，YQC-X（X=3-9）肽的序列中因存在组氨酸残基，故可采用此方法进行碘标记。后面以YQC-5为例进行应用描述。
1、多肽固相合成
A：偶联
先将Fmoc-Lys-Rink amide MBHA resin(芴甲氧羰酰基-赖氨酸-rink氨基树脂)0.33/2 mmol 6.06g溶胀于二甲基甲酰胺中，10mL/g树脂，接着用20% 六氢吡啶/二甲基甲酰胺溶液脱去Fmoc保护基（以下称之为脱帽），用二甲基甲酰胺洗涤脱帽子后的树脂，加入原料Fmoc-Ala（Boc）-OH 2.3g,缩合剂用HBTU 1.44g，反应时间30分钟，kaiser法检测，如检测结果为阴性，说明偶联反应完成，则接下去进行脱帽，时间30分钟，如检测结果仍为阳性，则说明偶联反应未完成或反应不完全，需要延长偶联时间或重新投料偶联，直至偶联反应完成。重复上述操作，依次偶联其他氨基酸，完成所有直链肽合成后，用甲醇洗涤所得到的peptidyl resin，真空干燥箱里充分干燥。
B：树脂与肽的分离裂解
将120mL裂解液（10mL/g peptidyl resin）加入树脂中，25℃条件下，磁力搅拌2.5h后用砂芯漏斗将裂解液与树脂分离，弃去树脂，保留滤液。将滤液缓慢滴加到10eq体积的冰无水乙醚中，滴加完毕后，自然沉降30min。然后用高速离心机离心10min（4000rpm），弃去上清液，保留沉淀，将所得沉淀在干燥箱中干燥8-10h，得到干粉粗品。
C：纯化
取上述干粉粗品1g，用0.1% 三氟乙酸/水溶解。经过滤后，上样到C18制备柱，用高效液相进行梯度洗脱，收集目标肽的洗脱液体，检测液体纯度。把合格的样品混合后旋蒸，最后用冻干机冻干，得到Pro-Ala-Pro-Ser-Pro-Asn-Cys-Arg-Leu-Asn-Ala-Tyr-Lys-Asp-Ala-Lys ，纯度大于98%。
序列为：Pro-Ala-Pro-Ser-Pro-Asn-Cys-Arg-Leu-Asn-Ala-Tyr-Lys-Asp-Ala-Lys。
质谱图中可以看出Pro-Ala-Pro-Ser-Pro-Asn-Cys-Arg-Leu-Asn-Ala-Tyr-Lys-Asp-Ala-Lys 分子量是584.99*3-3=1751.98。
紫外光谱图中254nm处有肽的吸收峰。
2、放射性核素标记病毒模拟肽
放射性碘标记采用Iodogen法对YQC-5肽进行碘标记，首先利用Na127I，在氧化剂的存在下对YQC-5肽进行冷标记，标记结果通过液相和质谱数据验证。再利用放射性的Na125I，对YQC-5肽进行放射性碘标记，利用液相分析及验证了125I-YQC-5肽的成功制备。
A： 127I-YQC-5肽的制备和质量鉴定
在利用放射性碘-125对肽进行标记前，首先使用非放射性的碘-127，同样地采用Iodogen氧化法对YQC-5肽进行标记，以研究是否可将碘元素成功标记在YQC-5肽上，冷标记时采用碘-127，既可以避免核素的消耗，还可以在无放射性条件下利用液相和质谱技术分析产物。
采用Iodogen法对YQC-5肽进行碘-127的冷标记，首先将Iodoge制备成固相，称取20 μg的Iodogen溶于40 μL二氯甲烷，微微加热下用氮气吹干，使其在EP管上形成一层均匀的Iodogen薄膜。进行标记时，向含有Iodogen 薄膜的EP管内加入20 μL，0.5 mg/mL的YQC-5肽的磷酸缓冲液（PH=7.4），然后再加入2.5 μL，1 mg/m的 Na125I磷酸缓冲液（PH=7.4），置于室温混匀反应4 min后，取出标记后的EP管内的溶液并加入至50 μL的磷酸缓冲液中（PH=7.4）。将YQC-5肽标准品以及获得的反应混合液经高效液相色谱法（HPLC）来验证127I-YQC-5的合成。具体的液相色谱条件如下：色谱柱:安捷伦Aq色谱柱，其尺寸：250 mm×4.6 mm，i.d.：5 μm。流动相A相为水（含0.1 %的TFA），流动相B为乙腈溶液（含0.1% 的TFA）；流速：1mL /min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；紫外检测波长：190-800 nm。液相梯度如下表1：
表1 液相梯度条件
Figure DEST_PATH_IMAGE001
YQC-5标准品及其与Na127I反应液的高效液相紫外色谱图分别如图3和4所示，YQC-5肽标准品的液相紫外保留时间为15.9 min，对其进行碘-127标记反应后，紫外液相图中主要存在两个峰保留时间分别为15.9 min和16.5 min，前者保留时间与YQC-5肽一致，因此判断反应液中还存在过量的YQC-5肽未完全反应（保留时间为15.9 min）。碘取代YQC-5肽中组氨酸的羟基邻位的氢原子后，按理论分析，其极性应当变小，故在液相中其保留时间会比YQC-5肽稍有滞后，因而可初步判断后者产生的新峰为标记上碘-127的127I-YQC-5（保留时间为16.5 min）。
另外为进一步确证127I-YQC-5的合成，利用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析上述反应混合液，具体的液相色谱条件如下：色谱柱：Waters Xbridge，其尺寸：75 mm×4.6 mm，i.d.：3.5μm。流动相A相为水（含0.1 %的TFA），流动相B为乙腈溶液（含0.1% 的TFA）；流速:1.5 mL /min；柱温:25 ℃；进样量:10 μL；紫外检测波长:190-800 nm。液相梯度如下表2：
表2 液质联用的液相梯度条件
Figure 475628DEST_PATH_IMAGE002
利用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）分析上述YQC-5肽与Na127I反应后的反应液，其液相紫外色谱图如图5所示，除了保留时间为0.311 min处存在的盐峰外，还存在两个主峰保留时间分别为1.083 min和1.143 min，分析这两个紫外吸收峰所对应的质谱结果分别如图6和7所示，分析图6所示保留时间为1.083 min时紫外峰对应的质谱，可发现YQC-5肽（分子量为1850.08）分别带有两个正电荷和三个正电荷的分子离子碎片峰，分别为ESI-MS m/z: [M/2+H]+ 925.4；[M/3+H]+ 617.3，说明此峰的确为YQC-5肽（RT=1.083 min），在反应的过程中YQC-5肽保持结构完整，没有受到氧化剂Iodogen的破坏。127I-YQC-5的分子量为1975.98（1850.08+125.9），分析图7所示的保留时间为1.143 min时紫外峰对应的质谱，可发现127I-YQC-5产物分别带有两个正电荷、三个和四个正电荷的分子离子碎片峰，分别为ESI-MS m/z: [M/2+H]+ 989.0；[M/3+H]+ 659.5；[M/4+H]+ 494.7，说明此峰的确为127I-YQC-5（RT=1.143 min）。因此处利用Iodogen法对YQC-5肽进行碘-127的冷标记，可成功制备127I-YQC-5肽，且仍存在过量的YQC-5肽未反应完全，127I-YQC-5产物的极性较YQC-5略有减小。基于此液质的分析结果，可确证3中的液相紫外图中保留时间为15.9 min时对应紫外峰为YQC-5肽，保留时间为16.5 min对应的物质为127I-YQC-5，上述判断正确。可成功将碘-127标记在YQC-5肽上，后续可以采用放射性核素碘-125对肽进行标记。
B：125I-YQC-5肽的制备和质量鉴定
采用Iodogen法对YQC-5肽进行放射性核素碘-125的标记，首先将Iodogen制备成固相，称取20 μg的Iodogen溶于40 μL的二氯甲烷，微微加热下用氮气吹干，使其在EP管上形成一层均匀的Iodogen薄膜。进行标记时，向Iodogen EP管内加入20 μL，0.5 mg/mL的YQC-5肽的磷酸缓冲液（PH=7.4），然后再加入300 μCi的 Na125I，置于室温混匀反应4 min后，取出标记后的EP管内的溶液并加入至50 μL的磷酸缓冲液中（pH=7.4）。放射性混合液通C-18小柱纯化后可得到标记125I后的放射性产物125I- YQC-5。将放射性标记产物经带有放射性检测器的高效液相色谱法（HPLC）进行验证。液相色谱条件同上述的液相条件相同，上样量为10 μL，活度值约为10 μCi，设置放射性检测器检测的核素种类为125I。
采用Iodogen法对YQC-5肽进行放射性核素碘-125的标记后的反应混合液通C-18小柱纯化，纯化后将放射性标记产物经带有放射性检测器的高效液相色谱法（HPLC）进行验证。液相色谱条件同上述冷标记中127I-YQC-5肽的合成后的色谱分析条件相同，结果如图8所示，产物125I-YQC-5的放射峰保留时间为RT=17.2 min，相比于图4中127I-YQC-5产物保留时间（T=16.5 min）相对应，仅滞后0.7 min，这由于待测液进样后先经HPLC的紫外检测器再经放射性检测器，故放射峰会比紫外吸收峰的保留时间存在滞后，考虑到管路的长短，滞后0.7 min在合理范围之内。因此可判断此放射峰对应的物质结构与127I-YQC-5相同，即为125I-YQC-5。计算125I-YQC-5对应放射峰峰面积与所有放射峰峰面积的比值，可得到纯化后的125I-YQC-5肽的放射性化学纯度可达98%，不存在游离未反应完全的碘，可以用于后续的体内生物分布实验。另外，此放射性标记125I-YQC-5肽在正辛醇-水中的分配系数（log P）为-0.54±0.03，具有很好的亲水性，水溶性，在生物体内会有较快的代谢速度。
3、125I-YQC-5肽在荷瘤鼠体内的SPECT-CT显像
为验证125I-YQC-5肽在体内对肿瘤的特异性靶向情况，选择并构建腺病毒高转染效率的癌细胞如人肝癌细胞株HepG2、MHCC97-H、Bel-7404、宫颈癌Hela、结肠癌SW480、胰腺癌CFPAC-1、肺癌A549和腺病毒低转染效率的人恶性脑胶质瘤细胞株U87皮下荷瘤小鼠模型作为研究对象。将荷瘤鼠分别静脉注射Na125I生理盐水溶液和125I-YQC-5肽后，利用SPTCT-CT放射性显像技术检测两者在荷瘤小鼠内的分布。
A：皮下荷瘤鼠模型的建立
选择腺病毒高转染效率的癌细胞如人肝癌细胞株HepG2、MHCC97-H、Bel-7404、宫颈癌Hela、结肠癌SW480、胰腺癌CFPAC-1、肺癌A549和腺病毒低转染效率的人恶性脑胶质瘤细胞株U87构建皮下荷瘤模型，用于研究放射性标记后的125I-YQC-5肽在荷瘤鼠模型体内对CAR受体的靶向性。
HepG2、MHCC97-H、Bel-7404、Hela、SW480、CFPAC-1、A549和U87荷瘤裸鼠模型的构建：复苏之前冻存在液氮罐中的细胞株，将含细胞的冻存管置于37℃的水浴锅，轻轻晃动细胞使之逐渐融化。在超净工作台内，用70%的乙醇擦拭干净冻存管的盖沿，将细胞分别细胞转移至培养培养瓶中，其中脑胶质瘤细胞株U87、MHCC97-H、Bel-7404、Hela、SW480、CFPAC-1、A549采用DMEM及MEM（含10 % 胎牛血清FBS）的培养液进行培养，肝癌细胞HepG2采用RPMI-1640（含10 % 胎牛血清FBS）的培养液进行培养。在37℃，5 % CO2 条件下的细胞培养箱中培养，显微镜下观察两者细胞生产处于对数生长期时，吸弃培养液，用0.25%的胰酶进行消化处理，当观察到细胞形状变圆时，分别加入适量的DMEM或RPMI-1640完全培养液来终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞，将细胞收集到10 mL的离心管中，1000 rpm/min，离心5min。吸弃上清，用适量无菌 PBS使细胞重悬，并离心1000 rpm/min，5 min。吸弃上清后用500 μL的不含血清的DMEM培养液重悬U87细胞沉淀，用500 μL的不含血清的RPMI-1640培养液重悬HepG2细胞沉淀，并细胞计数，调整细胞密度（约 2×10 6个细胞），分别获得细胞悬液，分别将两种细胞悬液注射于裸鼠右前肢（俯卧位），100 μL/裸鼠。
皮下荷瘤鼠模型构建后，定期观察接种肿瘤的生长状态，当肿瘤长至直径约1.0cm时，用于SPECT-CT显像和体内生物分布研究。
B：125I-YQC-5肽在荷瘤鼠体内的SPECT-CT显像
使用nano scan SPECT / CT临床前成像仪研究125I-YQC-5肽在具有皮下肿瘤的小鼠中的SPECT-CT显像情况。在研究前三天，每天利用200 μL质量分数为1%的碘化钾KI溶液对裸鼠进行灌胃处理，用于封闭小鼠的甲状腺，以防碘-125在甲状腺部位聚集。取上述合成并纯化后获得的放射性125I-YQC-5肽800 μCi，用生理盐水稀释至800 μL，然后用0.22 μm的微孔滤膜进行过滤。取过滤后的放射性活度为200 μCi（7.4 MBq），约197 μL的125I-YQC-5肽，经尾静脉注射进入荷瘤小鼠体内，另外设立对照组，取200 μCi的未与肽标记的Na125I的生理盐水溶液，同样方式对小鼠进行注射，两者均在注射后不同时间点0.5 min、1 h、2 h、4h、6 h、10 h和 16 h对荷瘤裸鼠进行SPECT-CT成像。在进行SPECT-CT成像前，需要将小鼠放在封闭的麻醉箱内，利用异氟烷让小鼠迅速进入深度麻醉状态，随后移至仪器的扫描床上，俯卧位，用纸胶带固定裸鼠位置防止其移动，并利用异氟烷空气麻醉机将适量的异氟烷持续输入动物扫描床的室内，为使得小鼠的处于麻醉状态并保持自主呼吸，实时检测老鼠的状态，开始进行SPECT-CT的显像。CT图像采集时，电压为70 kV；采集的投影数为360个；曝光时间设置为170 ms，合并模式（Binning）为1:4；CT重建参数为Medium；重建滤波选择Cosine。SPECT图像采集时，选择全扫描（helical scanning）模式，采集能峰：28.4 KeV，20％窗口宽度，核素种类为碘-125；扫描帧周期为20 s；扫描投影数为80；矩阵大小为256×256。将获得采集的信号，进行重建获得SPECT三维图像时，滤波为中等；迭代参数为中等48；分辨率选中等128。
于注射后不同时间点进行SPECT-CT图像的采集，并重建数据获得三维图像，Na125I和125I-YQC-5肽在荷瘤鼠体内的SPECT-CT的成像分别如图9所示，从Na125I在荷瘤鼠体内的SPECT-CT融合图像的三维（MIP）中可以明显地观察到，Na125I在荷瘤鼠体内5 min时表现出全身分布，在肾脏、胃和甲状腺聚集，随着时间的延长，甲状腺和胃部位的核素信号明显增强，而组织和器官内的放射性信号均逐渐降低，且信号很低，此外肿瘤部位的信号强度同正常肌肉组织的强度一致，放射摄取均很低。观察图9内125I-YQC-5肽在荷瘤鼠体内的SPECT-CT的成像，可发现在5 min时，小鼠肾脏和膀胱部位的放射信号很强，说明此125I-YQC-5肽主要通过肾脏进行代谢，从1 h开始就可以明显的发现小鼠的肿瘤部位有较高的放射性积累，并且在心脏、肝脏、肺和肌肉等组织中的放射性积累较少，具有较高的信噪比。从SPECT-CT图像上观察到1-4 h内均显示较高的肿瘤放射性摄取，这段时间的成像观察效果较好，从SPECT图像上可以明显的区分肿瘤部位与其他器官组织。在2 h时，此时肿瘤部位放射性摄取信号最强，2 h后由于125I-YQC-5肽在体内不断代谢，肿瘤部位的信号开始逐渐减弱，说明此125I-YQC-5肽在体内代谢快，可以快速从体内清除。说明YQC-5肽可以有效地模拟腺病毒转染过程靶向肿瘤部位，并且在肿瘤部位具有很高的放射性信号，相比于心脏、肝脏、肺、肌肉等组织肉眼上可以明显的区分肿瘤部位。
4、125I-YQC-5肽在荷瘤鼠体内的生物分布
为了能够更加准确评估及定量计算125I-YQC-5肽在荷瘤鼠体内的各个主要器官组织的生物分布，将125I-YQC-5肽经尾静脉注射进入小鼠体内，然后分别于注射后1 h、2 h、4h时处死小鼠并解剖，取下感兴趣的心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、胃、肠、肿瘤等组织和器官，称重后并利用SPECT-CT对各器官组织进行成像。成像结果所示，此解剖后的SPECT图像的生物分布结果与上述125I-YQC-5肽在荷瘤鼠活体内的成像结果相一致，在3 h时，125I-YQC-5肽主要会在肾脏、胃以及肿瘤部位明显聚集，而在其他器官内的放射性信号均相对较低，可明显看出125I-YQC-5肽可有效地靶向肿瘤部位，并且在肿瘤部位具较高的放射性摄取。观察发现，在10h时，心脏、肝脏、脾脏、肺等主要器官内的放射性信号均明显降低，几乎没有放射性信号的积累，仅在肾脏、胃和肿瘤存在少量信号，说明此125I-YQC-5肽在体内代谢速度快，可以快速到达肿瘤部位，并可快速地从体内主要经肾脏进行代谢经膀胱排出体外，可避免125I-YQC-5肽在体内主要器官长时间的滞留而带来的药物毒性作用。
勾画感兴趣区（region of interest，ROI）进行相对定量：在活体显像数据获取结束后，图像重建完成，利用Interfusion软件分析和处理所获得的SPECT-CT融合图像，从各个层面勾画小鼠的心、肝、脾、肺、胃、肠、甲状腺、骨、肉、肿瘤等器官，得到各组织器官的放射性核素摄取量，计算不同时间点下各组织器官的相对%ID/g，计算公式如下：%ID/g=（感兴趣区域内的放射性物质摄取（counts）/感兴趣区域体积（cm3））/小鼠的总放射性物质摄取（counts）*100。
解剖小鼠各组织器官进行绝对定量：使用γ 计数器研究125I-YQC-5多肽在在各荷瘤鼠体内的生物分布。在研究前三天，每天使用200 μL质量分数为0.1%的高氯酸钾溶液对裸鼠进行灌胃处理，用于封闭小鼠的甲状腺、胃黏膜，防止125I在甲状腺、胃等部位的聚集。取放射性活度为20 μCi（0.74 MBq），约200 μL的125I-YQC-5探针，分别经尾静脉注射进入各荷瘤鼠体内。在注射后1 h、2 h和4 h后，处死小鼠，解剖心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、甲状腺、骨、肉和肿瘤等组织器官，称重后置于γ计数器的放免管中，用γ计数器测定各器官的放射性计数，计算每克脏器或组织的放射性计数占总注入剂量的百分比（%ID/g），计算公式如下：%ID/g=各组织器官的γ放射性计数（cpm）/各组织器官的重量（g）/小鼠的总注射剂量（cpm）*100。
因为利用125I-YQC-5在荷瘤小鼠体内的SPECT图像来进行各器官组织放射性摄取量的定量计算时，对各器官组织的辨别会出现误差，并且得到的放射性摄取量%ID/g，实际上是单位体积感兴趣区域内放射性物质摄取量占总给药注射剂量的百分比，可以作为活体内SPECT图像中器官及组织分布成像效果的定量评价手段。此处将各器官解剖后进行称重，并利用SPECT定量计算各器官整个含有的放射量，计算得到每克组织所含放射性摄取量占总注射剂量的百分比（％ID/g），可以更加精准的评估及定量125I-YQC-5肽在荷瘤小鼠体内的各个主要器官组织的生物分布，结果如图10-17左侧所示，可以明显看出在3 h时，125I-YQC-5肽主要会在肾脏、胃以及肿瘤部位明显聚集，而在其他器官内的放射性信号均相对较低，这一结果也与各器官组织的SPECT-CT图像的结果相对一致。在肾脏中的放射性摄取量最高，在心、肝、肺等器官内信号较低，说明125I-YQC-5肽主要经过肾脏系统进行代谢，而不是通过肝脏代谢。并且125I-YQC-5肽在肿瘤部位的摄取量可达6.78±0.83％ID/g，其单位重量的摄取量仅低于肾脏和胃，相比于心脏、肝脏、脾脏、肺、肠的低放射性摄取，肿瘤部位的摄取量十分显著。说明此125I-YQC-5肽与肿瘤细胞具有高亲和力，可以有效地与其相结合，从而具有靶向腺病毒高转染效率的肿瘤作用。与SPECT图像相一致的，在10 h时，在各个器官的放射性摄取均明显的下降，说明125I-YQC-5肽在体内代谢速度很快，在10 h时，在体内的聚集量就已经较弱，在体内滞留时间短，可以很好地减少其对生物体的生物毒性作用。125I-YQC-5肽在3 h前就已到达肿瘤部位，且具有很高的摄取量。结果表明，125I-YQC-5对腺病毒高转染效率的七种肿瘤具有很好的靶向性。
综上所述，本发明的YQC-X（X=3-9）肽能够靶向到腺病毒高转染效率的细胞上，而对腺病毒低转染效率的细胞基本无靶向性，并且YQC-X（X=3-9）肽对动物基本无毒性。由此可见YQC-3、YQC-4、YQC-5、YQC-6、YQC-7、YQC-8、YQC-9肽能够成为对柯萨奇腺病毒受体高表达肿瘤进行体外诊断。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒/腺病毒的模拟肽及其应用
<130> 20190621
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Asp Pro Ser Pro Asn Cys Arg Ile His Gln Glu Leu Asp Cys Lys
1 5 10 15
<210> 2
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Asp Pro Ser Pro Asn Cys Arg Ile His Gln Glu Leu Asp Cys Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Pro Ala Pro Ser Pro Asn Cys Arg Leu Asn Ala Tyr Lys Asp Ala Lys
1 5 10 15
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Pro Asp Pro Ser Pro Asn Cys Arg Ile His Ser Asp Asn Asp Cys Lys
1 5 10 15
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Pro Ser Pro Asn Cys Ser Leu Ile Gln Glu Leu Asp Ala Lys Arg
1 5 10 15
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Ala Tyr Trp Gly Tyr Arg Gln Gly Gln Ser Val
1 5 10
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Tyr Ile Asn Ser Ser Gly Ser Thr Asp Ser Asn Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15

Claims (7)

1.一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒的模拟肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
2.一种DNA片段，其特征在于：该DNA片段为编码权利要求1所述模拟肽的核苷酸序列。
3.一种表达载体，其特征在于：含有至少一个拷贝的如权利要求2所述的DNA 片段。
4.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求3所述的表达载体。
5.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1所述的模拟肽和能杀伤肿瘤细胞的制剂。
6.一种药物组合物，其特征在于：包括权利要求1所述的模拟肽和显像制剂。
7.权利要求1所述的模拟肽在制备诊断癌症显像制剂中的用途，所述癌症为肝癌、宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌或恶性脑胶质瘤中的一种。
CN201910542600.3A 2019-06-21 2019-06-21 一种靶向肿瘤的柯萨奇病毒/腺病毒的模拟肽及其应用 Active CN110357945B (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112961215B (zh) * 2021-02-05 2022-08-23 天津医科大学 一种多肽及其肿瘤靶向肽、肿瘤检测试剂、肿瘤手术导航造影剂和肿瘤靶向药
CN113912678B (zh) * 2021-12-15 2022-03-29 中国药科大学 一种靶向柯萨奇病毒-腺病毒受体的模拟肽及其在脑卒中修复中的应用
CN117510589B (zh) * 2023-11-17 2024-07-16 安徽工程大学 一种对运动损伤具有抗菌修复作用的多肽及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102816240A (zh) * 2011-03-08 2012-12-12 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 一种融合蛋白及其融合蛋白表达载体
CN104470950A (zh) * 2012-05-11 2015-03-25 公益财团法人微生物化学研究会 抗cxadr抗体
CN104725515A (zh) * 2015-03-20 2015-06-24 扬州大学 一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用
CN106632613A (zh) * 2017-01-17 2017-05-10 中国药科大学 与柯萨奇病毒腺病毒受体相关的亲和肽

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102816240A (zh) * 2011-03-08 2012-12-12 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 一种融合蛋白及其融合蛋白表达载体
CN104470950A (zh) * 2012-05-11 2015-03-25 公益财团法人微生物化学研究会 抗cxadr抗体
CN104725515A (zh) * 2015-03-20 2015-06-24 扬州大学 一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用
CN106632613A (zh) * 2017-01-17 2017-05-10 中国药科大学 与柯萨奇病毒腺病毒受体相关的亲和肽

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Coxsackievirus and Adenovirus Receptor Cytoplasmic and Transmembrane Domains Are Not Essential for Coxsackievirus and Adenovirus Infection;XIANGHONG WANG等;《JOURNAL OF VIROLOGY》;19990531;第73卷(第3期);第2559-2562页 *
Presence of the Coxsackievirus and Adenovirus Receptor (CAR) in human neoplasms: a multitumour array analysis;M Reeh等;《BRITISH JOURNAL OF CANCER》;20131231;第109卷;第1848-4858页 *
Structural Analysis of the Mechanism of Adenovirus Binding to Its Human Cellular Receptor, CAR;Maria C. Bewley等;《SCIENCE》;19991119;第286卷;第1579-1583页 *
Structural Basis for Variation in Adenovirus Affinity for the Cellular Coxsackievirus and Adenovirus Receptor;Jason Howitt等;《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》;20031231;第278卷(第28期);第26208-26215页 *

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