CN103547291B - 锝标记的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含适于体内SPECT或PET成像的放射性标记的c‑Met结合肽的锝成像剂。c‑Met结合肽通过螯合剂缀合物标记。还公开了药物组合物、制备所述成像剂和组合物的方法以及使用所述组合物进行体内成像的方法，尤其是用于癌症诊断的方法。

Description

锝标记的肽
发明领域
本发明涉及包含适于体内SPECT或PET成像的放射性标记的c-Met结合肽的锝成像剂。c-Met结合肽通过螯合剂缀合物标记。还公开了药物组合物、制备所述成像剂和组合物的方法以及使用所述组合物进行体内成像的方法，尤其是用于癌症诊断的方法。
发明背景
肝细胞生长因子(HGF)，亦称分散因子(SF)，是参与各种生理学过程例如伤口愈合和血管发生的生长因子。HGF与其受体(c-Met)相互作用的高亲和力相互作用涉及肿瘤生长、侵入和转移。
Knudsen等人对HGF和c-Met在前列腺癌中的作用进行了综述，其可推论用于成像和治疗[Adv. Cancer Res.，91，31-67 (2004)]。用于诊断和治疗的标记的抗met抗体描述于WO 03/057155。
已表明c-Met在许多人类上皮源癌症中涉及肿瘤生长、侵入和转移。大多数癌表达c-Met，在包括以下的许多癌症中检测出与正常组织相比c-Met表达升高：肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌、肾癌、神经胶质瘤、黑素瘤和多种肉瘤。在结肠直肠癌(CRC)中，在发育异常的异常隐窝病灶(该病最早的肿瘤发生前病变)中检测到c-Met过量表达。在头颈鳞状细胞癌中，据报道c-Met在大约80%的原发肿瘤中表达或过量表达。在前列腺癌到骨的转移中，有报道称c-Met在超过80%的骨转移中过量表达。
在正常条件下，c-Met在上皮细胞中表达，并被间充质来源的HGF以旁分泌方式激活。正常细胞中c-Met的活化是一个瞬变事件，并受严格调节。然而，在肿瘤细胞中，c-Met可以是组成型活性的。在癌中，可通过c-Met扩增/过量表达、激活c-Met突变(例如结构改变)和通过产生自分泌信号转导环获得自主生长控制，来实现异常的c-Met刺激。另外，c-Met受体有缺陷的减量调节也促进细胞膜中的异常c-Met表达。虽然c-Met的过量表达是HGF依赖性的(自分泌/旁分泌)，但是由突变引起的结构变化是HGF非依赖性的(例如胞外域丧失)。
WO 2004/078778公开了结合c-Met或包含c-Met和HGF的络合物的多肽或多聚体肽构建体。描述了大约10种不同的结构类别的肽。WO 2004/078778公开了这些肽可用可检测标记进行标记用于体外和体内应用，或可用药物标记用于治疗应用。可检测标记可以是酶、荧光化合物、光学染料、顺磁金属离子、超声造影剂或放射性核素。WO2004/078778的优选标记被描述为放射性的或顺磁的，最优选包括被金属螯合剂螯合的金属。WO2004/078778描述其中的放射性核素可选自：18F、124I、125I、131I、123I、77Br、76Br、99mTc、51Cr、67Ga、68Ga、47Sc、167Tm、141Ce、111In、168Yb、175Yb、140La、90Y、88Y、153Sm、166Ho、165Dy、166Dy、62Cu、64Cu、67Cu、97Ru、103Ru、186Re、203Pb、211Bi、212Bi、2l3Bi、2l4Bi、105Rh、109Pd、117mSn、149Pm、161Tb、177Lu、198Au和199Au。WO 2004/078778描述(第62页)用于诊断目的的优选的放射性核素为：64Cu、67Ga、68Ga、99mTc和111In，其中特别优选99mTc。
WO 2004/078778在实施例14-17中教导延长c-Met结合肽的血清停留时间的方法：与非共价结合人血清白蛋白的部分缀合、与PEG缀合、与血清蛋白质融合和与马来酰亚胺缀合。
WO 2009/016180公开了包含下式I的缀合物的成像剂：
其中：
Z1与cMBP的N端连接，并且为H或MIG；
Z2与cMBP的C端连接，并且为OH、OBc或MIG，
其中Bc为生物相容性阳离子；
cMBP为17-30个氨基酸的cMet结合环肽，其包含以下氨基酸序列(SEQ-1)：
Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6；
其中X1为Asn、His或Tyr；
X2为Gly、Ser、Thr或Asn；
X3为Thr或Arg；
X4为Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；
X5为Ser或Thr；
X6为Asp或Glu；
并且Cysa-d各自为半胱氨酸残基，使得残基a和b以及c和d环化形成两个独立的二硫键；
MIG为代谢抑制基团；
L为合成的接头基团；
BzpM为苯并吡喃染料。
WO 2008/139207公开了类似于WO 2009/016180的那些cMet结合环肽的cMet结合环肽，在该情况下，用特殊类别的花青染料标记。
报道WO 2009/016180和WO 2008/139207的光学成像剂可用于光学成像以获得体内c-Met过量表达或定位部位的图像，特别用于使结肠直肠癌成像。
本发明
本发明涉及包含放射性锝(99mTc或94mTc)标记的c-Met结合肽的成像剂组合物，其适于体内正电子发射断层扫描术(PET)或单光子发射断层扫描术(SPECT)成像。c-Met结合肽通过肽的螯合剂缀合物用二胺二肟配基标记。缀合物在温和的室温条件下用锝进行放射性标记，以高收率和放射化学纯度得到所需的放射性金属络合物。99mTc成像剂可容易地由无菌的非放射性试剂盒制备，所述试剂盒用来自市售的99mTc发生器的[99mTc]-高锝酸盐复溶。
成像剂显示良好的体内靶特异性肿瘤吸收。另外成像剂还在临床前模型中表现出良好的耐受性。
发明详述
第一个方面，本发明提供包含c-Met结合肽的螯合剂缀合物的放射性xTc络合物的成像剂，所述螯合剂缀合物具有下式I的结构：
其中：
xTc为放射性同位素94mTc或99mTc；
cMBP为下式II的18-30聚体c-Met结合环肽：
其中Q为以下氨基酸序列(SEQ-1)：
-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-
其中X1为Asn、His或Tyr；
X2为Gly、Ser、Thr或Asn；
X3为Thr或Arg；
X4为Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；
X5为Ser或Thr；
X6为Asp或Glu；
且Cysa-d各自为半胱氨酸残基，使得残基a和b以及c和d环化形成两个独立的二硫键；
A和A′独立地为Cys以外的任何氨基酸，或A和A′之一为Lys(ε-Z3)；
x和y独立地为取值0-13的整数，且其经选择使得[x + y] = 1-13；
Z1与cMBP的N端连接，且为MIG或Z3；
Z2与cMBP的C端连接，且为MIG或Z3；
其中每个MIG独立地为代谢抑制基团，所述代谢抑制基团为抑制或阻抑cMBP肽体内代谢的生物相容性基团；
Z3为下式(III)的螯合剂：
(III)
其中E1-E6各自独立地为R´基团；
每个R´独立地为H或C1-4烷基、C3-7烷基芳基、C2-7烷氧基烷基、C1-4羟基烷基、C1-4氟烷基、C2-7羧基烷基或C1-4氨基烷基，或者两个或更多个R´基团与它们所连接的原子一起形成碳环、杂环、饱和或不饱和的环；
L为式-(A)m-的合成的接头基团，其中每个A独立地为-CR2-、-CR=CR-、-C≡C-、-CR2CO2-、-CO2CR2-、-NRCO-、-CONR-、-NR(C=O)NR-、-NR(C=S)NR-、-SO2NR-、-NRSO2-、-CR2OCR2-、-CR2SCR2-、-CR2NRCR2-、C4-8亚环杂烷基、C4-8亚环烷基、C5-12亚芳基或C3-12亚杂芳基或单分散的聚乙二醇(PEG)组件；
每个R独立地选自H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基、C1-4烷氧基烷基或C1-4羟基烷基；
m为取值1-10的整数；
前提条件是式I的缀合物包含一个Z3基团，且所述Z3基团与xTc一起形成金属络合物。
术语“成像剂”意指适于使哺乳动物体成像的化合物。优选哺乳动物是完整的哺乳动物体体内，更优选为人受试者。通常以非药理的量，即以经设计对哺乳动物受试者具有最小生物影响的剂量给予成像剂。优选可以最低限度的侵入方式(即当在专业的医学技术下进行时不会为哺乳动物受试者带来实质的健康风险)，将成像剂给予哺乳动物体。这类最低限度的侵入给予优选为在不需要局部或全身麻醉的情况下静脉内给予所述受试者的外周静脉。
本文所用术语“体内成像”是指非侵入性地产生哺乳动物受试者的全部或部分的体内面貌的图像的那些技术。
术语“螯合剂缀合物”意指螯合剂与cMBP肽共价键合。
术语“c-Met结合环肽”意指与肝细胞生长因子受体，亦称为c-Met (或简称MET)结合的肽。本发明合适的这类肽是式I的18-30个氨基酸的环肽。这类肽对c-Met的表观Kd小于约20 nM。所述肽的cMBP序列包含脯氨酸残基，且已知这类残基可显示顺/反异构化的主链酰胺键。本发明的cMBP肽包括任何这类异构体。本发明的cMBP适于用作单体，即cMBP的二聚体和/或异二聚体不在此范围内。
Z1基团取代cMBP的最末氨基酸残基(即氨基端或N端)的胺基。Z2基团取代cMBP最末氨基酸残基(即羧基端或C端)的羰基。
术语“代谢抑制基团” (MIG)意指生物相容性基团，其在氨基端(Z1)或羧基端(Z2)任一个上抑制或阻抑cMBP肽的体内代谢。对于本发明的成像剂，MIG包括Z3基团，即式III的螯合剂。如果那样的话，锝络合物在cMBP N端或C端处共价连接(分别作为Z1或Z2)，且锝络合物用来阻断cMBP的代谢。对于肽的胺端，其它的这类MIG基团为本领域技术人员所熟知，并且可适宜地选自：
N-酰化基团-NH(C=O)RG，其中酰基-(C=O)RG具有选自以下的RG：C1-6烷基或C3-10芳基，或者包含聚乙二醇(PEG)组件。优选的这类PEG基团是式IA或IB的生物调节剂(biomodifier)：
式IA的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七烷酸
其中p为1-10的整数。或者，可使用基于式IB的丙酸衍生物的PEG类结构：
(IB)
其中p如对式IA所定义，并且q为3-15的整数。
式IB中，p优选为1或2，q优选为5-12。
优选的这类氨基端MIG基团为乙酰基、苄氧基羰基或三氟乙酰基，最优选乙酰基。
术语“氨基酸”意指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如萘丙氨酸)或可为天然存在的或完全合成来源的氨基酸模拟物，并且可以是旋光纯的，即单一对映体并因此是手性的，或对映体的混合物。本文使用氨基酸的常规三字母或单字母缩写。优选本发明的氨基酸是旋光纯的。术语“氨基酸模拟物”意指其为等构物(即经设计以模拟天然化合物的空间和电子结构)的天然存在的氨基酸的合成类似物。已知这类等构物氨基酸用于肽内，包括但不限于酯肽、逆倒位肽(retro-inverso peptide)、硫代酰胺、环烷或1、5-二取代的四唑[参见M.Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)]。
术语“肽”意指包含通过肽键(即连接一个氨基酸的胺基与另一氨基酸的羧基的酰胺键)连接的上述定义的两个或更多个氨基酸的化合物。
如果A和A′是“Cys以外的任何氨基酸”，则意指A和A′基团的其它氨基酸没有游离巯基，具体地说是Cys残基。这是因为额外的Cys残基可能使二硫桥处于搅乱Q序列的Cysa-Cysb和Cysc-Cysd二硫桥的风险，其后果为丧失c-Met结合亲和力。
式(I)中，Z3基团(即式III的螯合剂)适于在以下位置(i)-(iii)之一处连接：
(i) cMBP的氨基端，作为Z1基团。这类缀合可利用式III的羧基官能化螯合剂；
(ii) cMBP的羧基端，作为Z2基团。C端处的这类连接可直接使用式III的胺基官能化螯合剂实现。对于这类缀合，允许螯合剂缀合的额外Lys残基因此是不必要的。另外，所连接的锝络合物可起MIG基团的作用；
(iii)与位于A或A′基团中的Lys残基的Lys (ε)胺基侧链连接。
如果x为94m，则锝放射性同位素是94mTc，其特别适于体内正电子发射断层扫描术(PET)成像。如果x为99m，则锝放射性同位素是99mTc，其特别适于体内单光子发射断层扫描术(SPECT)成像。优选xTc为99mTc。
术语“螯合剂的放射性xTc络合物”意指螯合剂的放射性金属络合物。术语“放射性金属络合物”意指放射性金属与式(III)螯合剂的配位金属络合物，其中所述螯合剂通过式I的接头基团(L)与cMBP肽共价连接。术语“螯合剂(chelator)”或“螯合剂(chelatingagent)”具有其常规含义，是指所排列的两个或更多个金属供体原子使得在金属配位时产生螯合环。式(III)螯合剂具有二胺二肟供体组。因此，本发明的xTc络合物被认为具有下式(IV)：
(IV)
其中E1-E6和L如对式(III)所定义。
术语“包含(comprising)”或“包括(comprises)”在整个本申请中具有其常规含义，意味着所列组分必须存在，但是其它未指定的化合物或物类另外也可存在。术语“包含”包括作为优选亚类的“基本上由……组成”，其意指组合物具有所列的组分而不存在其它化合物或物类。
优选的特征
本发明优选的cMBP肽对于c-Met与c-Met/HGF络合物结合的Kd小于约10 nM (根据荧光偏振测定法测量)，最优选在1-5 nM的范围内，其中小于3 nM是理想的。
优选以适于哺乳动物给予的形式提供第一方面的成像剂。短语“以适于哺乳动物给予的形式”意指这样的组合物，其是无菌的、无热原的、不会产生毒副作用的化合物，并且在生物相容性pH (约pH 6.5-8.5)和生理相容性重量摩尔渗透压浓度(osmolality)下配制。这类组合物没有可能有引起体内栓子的风险的颗粒，并且经配制使得与生物流体(例如血液)发生接触时不发生沉淀。这类组合物还只含有生物相容性赋形剂，并且优选是等渗的。优选的这类形式是第四方面的放射性药物组合物(见下文)。
本发明的成像剂适宜具有两个受MIG基团保护的通常是不同的cMBP肽末端。具有以这种方式保护的两个肽末端对于体内成像应用是重要的，因为否则的话将预期快速的肽代谢，其结果为丧失对c-Met的选择性结合亲和力。如果Z1和Z2两者均为MIG，则优选Z1为乙酰基，Z2为伯酰胺。最优选Z1为乙酰基，Z2为伯酰胺，且xTc部分与cMBP的赖氨酸残基的ε胺基侧链连接。
Q优选包含SEQ-2或SEQ-3的氨基酸序列：
Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6 (SEQ-2)；
Ala-Gly-Ser-Cysa-X1-Cysc-X2-Gly-Pro-Pro-X3-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-X4-X5-X6-Gly-Thr (SEQ-3)。
SEQ-1、SEQ-2和SEQ-3中，X3优选为Arg。第一方面的cMBP肽优选具有氨基酸序列(SEQ-7)：
Ala-Gly-Ser-Cysa-Tyr-Cysc-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cysd-Trp-Cysb-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys。
优选选择式(I)的成像剂，使得A和A′之一为Lys(ε-Z3)，且cMBP只含一个这类Lys残基。更优选单一Lys(ε-Z3)部分位于羧基端，使得cMBP具有下式IIA：
其中：
z为取值0-12的整数，且[x + z] = 0-12。
式I和式II中，-(A)x-或-(A′)y-基团优选包含选自以下的接头肽：
-Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4)、
-Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5)或
-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6)，
且Z3基团与所述接头肽的Lys残基的ε胺基连接。
式(III)螯合剂优选在C端(Z2基团)处连接，或作为Lys(ε-Z3)部分连接。更优选作为Lys(ε-Z3)部分连接，并且最优选Lys(ε-Z3)部分位于羧基端，如对于上式(IIA)而言。
在式(I)的成像剂中，螯合剂优选具有下式IIIA：
(IIIA)
其中q为取值1-6的整数，A为如对式(III)所定义。
式(IIIA)中，(A)q优选为-(NH)(A)t-，其中t为取值0-5的整数。
第一方面的成像剂可按第三方面(下文)中的描述来制备。
第二方面，本发明提供如第一方面定义的式I的螯合剂缀合物。第二方面的式(II)的cMBP肽和式(III)的螯合剂的优选方面如第一方面(上文)所述。
第二方面的螯合剂缀合物可通过双官能螯合物方法获得。术语“双官能螯合物”具有其常规含义，是指其上共价连接有侧官能团的螯合剂。所述官能团用作使螯合剂与cMBP肽连接的反应活性部位。双官能螯合物方法和相关合成法已由Bartholoma等[Chem.Rev.,110(5), 2903-2920 (2010)]、Chakraborty等[Curr.Top.Med.Chem., 10(11), 1113-1134(2010)]和Brechbiel等[Quart.J.Nucl.Med.Mol.Imaging, 52(2), 166-173 (2008)]所描述。本发明的官能团优选为胺、羧酸或活化酯，更优选伯胺或活性酯。具有侧胺官能团的双官能螯合剂可与肽的羧基缀合。具有羧基或活化酯官能团的双官能螯合剂可与肽的胺基缀合。
术语“活化酯”或“活性酯”意指被设计成为更好的离去基团，并因此允许与亲核基团(例如胺)更易反应的相关羧酸的酯衍生物。合适活性酯的实例为：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酚、五氟苯硫酚、对硝基苯酚、羟基苯并三唑和PyBOP (即苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷磷六氟磷酸酯)。优选的活性酯为N-羟基琥珀酰亚胺酯或五氟苯酚酯，尤其为N-羟基琥珀酰亚胺酯。
本发明的式cMBP的c-Met结合肽可通过以下制备方法获得，所述方法包括：
(i)线性肽的固相肽合成，所述线性肽具有与所需cMBP肽相同的肽序列，且其中Cysa和Cysb未受保护，而Cysc和Cysd残基具有巯基保护基；
(ii)得自步骤(i)的肽用溶液中的含水碱处理，得到具有连接Cysa和Cysb的第一个二硫键的单环肽；
(iii)脱去Cysc和Cysd巯基保护基并环化，得到连接Cysc和Cysd的第二个二硫键，这便是所需的二环肽产物Z1-[cMBP]-Z2。
术语“保护基”意指这样的基团，该基团抑制或阻抑不合乎需要的化学反应，但被设计成为有充分的反应性，在不改变所述分子的其余部分的足够温和的条件下可从所述官能团上切除。在脱保护后，获得所需产物。胺保护基为本领域技术人员所熟知，并且其适宜选自：Boc (其中Boc为叔丁氧基羰基)、Fmoc (其中Fmoc为芴基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde [即1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代亚环己基)乙基]或Npys (即3-硝基-2-吡啶次磺酰基)。合适的巯基保护基为Trt (三苯甲基)、Acm (乙酰氨基甲基)、t-Bu (叔-丁基)、叔-丁基硫基(tert-Butylthio)、甲氧基苄基、甲基苄基或Npys (3-硝基-2-吡啶次磺酰基)。其它保护基的使用描述于Protective Groups in Organic Synthesis (有机合成 中的保护基), 第4版, Theorodora W. Greene和Peter G. M. Wuts, [Wiley Blackwell,(2006)]。优选的胺保护基为Boc和Fmoc，最优选为Boc。优选的巯基保护基为Trt和Acm。
实施例1和2提供更具体的详述。固相肽合成的更多细节描述于P. Lloyd-Williams, F. Albericio和E. Girald；Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins (合成肽和蛋白质的化学方法), CRC出版, 1997。cMBP肽最好保存在惰性气氛下，并保持在冰箱中。当用于溶液中时，最好避免pH大于7，因为这有搅乱二硫桥的风险。
优选的双官能二胺二肟螯合剂是具有下式的螯合剂1：
其中桥头的伯胺基与L (即接头基团)和/或cMBP肽缀合。
式III的二胺二肟螯合剂可通过使合适的二胺与以下任一种反应来制备：
(i)合适的氯亚硝基衍生物Cl-C(E2E3)-CH(NO)E1；
(ii)式Cl-C(E2E3)-C(=NOH)E1的α-氯代肟；
(iii)式Br-C(E2E3)-C(=O)E1的α-溴酮，接着将二胺二酮产物转化为具有羟胺的二胺二肟。
S. Jurisson等人[Inorg. Chem., 26, 3576-82 (1987)]描述了路线(i)。如本领域已知，可通过用亚硝酰氯(NOCl)处理合适的烯烃来获得氯亚硝基化合物。以下文献给出了氯亚硝基化合物的更多合成细节：Ramalingam [Synth. Commun., 25(5), 743-752(1995)]；Glaser [J. Org. Chem., 61(3), 1047-48 (1996)]；Clapp [J. Org Chem., 36(8) 1169-70 (1971)]；Saito [Shizen Kagaku, 47, 41-49 (1995)]和Schulz [Z.Chem., 21(11), 404-405 (1981)]。Nowotnik等人[Tetrahedron, 50(29), 第8617-8632页(1994)]以宽泛的条件描述了路线(iii)。α-氯-肟可通过对市售可获得的相应的α-氯-酮或醛进行肟化来获得。α-溴酮是市购可获得的。
在支持实施例中提供了本发明的特定羧基官能化和胺官能化螯合剂的更多细节及其与cMBP肽的缀合。
第三方面，本发明提供制备第一方面的成像剂的方法，所述方法包括第一方面的式I的螯合剂缀合物在合适的溶剂中与一定量的第一方面中所定义的xTc反应。
螯合剂缀合物中cMBP肽和螯合剂的优选方面和第三方面中的xTc如第一方面(上文)所述。
合适的溶剂在性质上通常是含水的，且为优选为如第四方面(下文)所定义的生物相容性载体溶剂。
99mTc可市购获自放射性同位素发生器，放射性同位素发生器以无菌形式提供[99mTc]-高锝酸盐。制备锝络合物的方法是本领域众所周知的[参见例如I.Zolle (编辑)Technetium-99m Pharmaceuticals (锝-99m药物), Springer, New York (2007)]。94mTc可通过Bigott等人[Nucl.Med.Biol, 33(7), 923-933 (2006)]的方法制备和处理。
第四方面，本发明以适于哺乳动物给予的形式提供包含第一方面的成像剂以及生物相容性载体的放射性药物组合物。
第四方面的成像剂的优选方面如第一方面所定义。术语“以适于哺乳动物给予的形式”如上文中所定义。
“生物相容性载体”是成像剂可悬浮或优选溶于其中的流体，尤其为液体，使得组合物是生理上可耐受的，即其可给予哺乳动物体而无毒性或过多不适。生物相容性载体适宜为可注射的载体液体，例如：无菌无热原注射用水；水性溶液例如盐水(其可被有利地平衡，使得最终的注射用产品是等渗的)；包含生物相容性缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂)的水性缓冲液；一种或多种张力调节物质(例如具有生物相容性抗衡离子的血浆阳离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水性溶液。优选生物相容性载体是无热原的注射用水、等渗盐水或磷酸盐缓冲剂。
成像剂和生物相容性载体各自以合适的包括密封容器的小瓶或容器供给，密封容器允许保持无菌完整性和/或放射性安全性，加上任选顶部空间惰性气体(例如氮气或氩气)，同时允许通过注射器或套管添加和抽取溶液。优选的这类容器是隔膜密封的小瓶，其中气密罩(closure)是有卷边的，其具有顶封(通常为铝制的)。该罩适于用皮下注射针头单次或多次穿刺(例如有卷边的隔膜密封罩)，同时保持无菌完整性。这类容器具有额外的优点，如有需要(例如改变顶部空间气体或脱气溶液)该罩可承受真空，并承受压力变化，例如在不允许外部大气气体(例如氧气或水蒸汽)进入的情况下降低压力。
优选的多剂量容器包括装有多次患者剂量的单一容积小瓶(例如10-30 cm3体积)，因此可在制备物的活力使用期限内，以不同的时间间隔，从中将单次患者剂量抽取到临床级注射器中以适于临床环境。设计预装注射器以包括单次人剂量，或“单位剂量”，因此优选适于临床应用的一次性注射器或其它注射器。本发明的药物组合物优选具有适于单个患者的剂量，并以上述合适的注射器或容器提供。
药物组合物可含有另外任选的辅剂，例如：抗微生物防腐剂、pH调节剂、填充剂、辐射防护剂、增溶剂或重量摩尔渗透压浓度调节剂。
术语“抗微生物防腐剂”意指抑制潜在的有害微生物(例如细菌、酵母或霉菌)生长的作用剂。抗微生物防腐剂还可显示某些杀菌性质，这取决于所用剂量。本发明的抗微生物防腐剂的主要作用是抑制药物组合物中任何这类微生物的生长。然而，抗微生物防腐剂还可任选用于抑制在给药前用于制备所述组合物的试剂盒的一种或多种组分中潜在有害的微生物的生长。合适的抗微生物防腐剂包括对羟基苯甲酸酯类，即对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯或其混合物；苯甲醇；苯酚；甲酚；溴化十六烷基三甲铵和硫柳汞。优选的抗微生物防腐剂为对羟基苯甲酸酯类。
术语“pH调节剂”意指用于确保组合物的pH对于人或哺乳动物给予而言在可接受的极限值内(对于本发明的成像剂而言，约pH 4.0-10.5，优选6.5-8.5)的化合物或化合物的混合物。合适的这类pH调节剂包括药学上可接受的缓冲剂，例如曲辛、磷酸盐或TRIS [即三(羟甲基)氨基甲烷]和药学上可接受的碱例如碳酸钠、碳酸氢钠或其混合物。当以试剂盒形式使用组合物时，pH调节剂可任选以单独的小瓶或容器提供，使得试剂盒的用户可将调节pH作为多步程序的部分。
术语“填充剂”意指药学上可接受的填料，其可在生产和冻干期间有利于原料处理。合适的填充剂包括无机盐例如氯化钠和水溶性糖或糖醇例如蔗糖、麦芽糖、甘露糖醇或海藻糖。
术语“辐射防护剂”意指通过俘获高反应性自由基(例如因水的辐射分解而产生的含氧自由基)来抑制降解反应(例如氧化还原过程)的化合物。可以使用两种或更多种不同辐射防护剂的组合。本发明的辐射防护剂适宜选自：乙醇、抗坏血酸、对氨基苯甲酸(即4-氨基苯甲酸)、龙胆酸(即2,5-二羟基苯甲酸)和这类酸与生物相容性阳离子的适当的盐。术语“生物相容性阳离子” (Bc)意指与电离的带负电荷的基团形成盐的带正电荷的抗衡离子，其中所述带正电荷的抗衡离子同样是无毒的，因此适于给予哺乳动物体，尤其给予人体。合适的生物相容性阳离子的实例包括碱金属钠或钾、碱土金属钙和镁以及铵离子。优选的生物相容性阳离子是钠和钾，最优选为钠。本发明的辐射防护剂优选包含抗坏血酸或抗坏血酸钠。
术语“增溶剂”意指存在于组合物中、提高成像剂在溶剂中的溶解度的添加剂。优选的这类溶剂是水性介质，因此增溶剂优选提高水中的溶解度。合适的这类增溶剂包括：C1-4醇；甘油；聚乙二醇(PEG)；丙二醇；聚氧乙稀脱水山梨糖醇单油酸酯；脱水山梨糖醇单油酸酯；聚山梨醇酯；聚(氧乙烯)聚(氧丙烯)聚(氧乙烯)嵌段共聚物(Pluronics™)；环糊精(例如α、β或γ环糊精、羟丙基-β-环糊精或羟丙基-γ-环糊精)和卵磷脂。优选的增溶剂为环糊精、C1-4醇和Pluronics™，更优选为环糊精和C2-4醇。如果增溶剂为醇，则优选为乙醇或丙醇，更优选为乙醇。乙醇具有潜在的双重作用，因为它还可起辐射防护剂的作用。如果增溶剂为环糊精，则优选为γ环糊精，更优选为羟丙基-β-环糊精(HPCD)。环糊精的浓度可为约0.1-约40 mg/mL，优选约5-约35 mg/mL，更优选为20-30 mg/ml，最优选约25 mg/ml。
本发明的放射性药物组合物可通过以下各种方法制备：
(i)无菌制备技术，其中放射性金属络合物形成在洁净室环境进行；
(ii)终末灭菌，其中放射性金属络合物形成在不用无菌制备的情况下进行，然后在最终步骤灭菌[例如通过γ辐射、高压灭菌干热处理或化学处理(例如用环氧乙烷)]；
(iii)试剂盒方法，其中使包含式I的螯合剂缀合物和任选的赋形剂的无菌、非放射性试剂盒制剂与一定量的所需锝放射性金属反应。
优选方法(iii)，且用于该方法的试剂盒描述于第五实施方案(下文)。
优选选择这样的成像剂组合物，其使得任何未标记的cMBP肽以不超过xTc-标记的cMBP肽的摩尔量50倍的量存在于所述组合物中。因此，用于xTc放射性标记的化学过量的螯合剂缀合物可高达超过xTc 1000倍的量，且未标记的缀合物可体内竞争c-Met部位。然而，低浓度的螯合剂缀合物可影响RCP。因此，对于99mTc，使用45钠摩尔的化合物1可达到>90%的RCP值，但如果使用15-30钠摩尔时，RCP值则在70%与95%之间变化。任何过量的未标记的肽可通过HPLC或SPE除去。
术语“未标记的”意指c-Met结合环肽是非放射性的，即不用xTc或任何其它放射性同位素进行放射性标记。这类未标记的肽主要包括第二方面(上文)的非放射性螯合剂缀合物。术语“未标记的”不包括用99Tc标记的c-Met结合环肽，其中所述99Tc存在于用于对所述c-Met结合环肽进行放射性标记的99mTc中，因此为相同放射性标记反应的产物。优选未标记的c-Met结合环肽以小于相应xTc-标记的肽的摩尔量的20倍、更优选小于10倍、最优选小于5倍存在于所述组合物中。
第五方面，本发明提供用于制备第四方面的放射性药物组合物的试剂盒，其包括呈无菌固体形式的第二方面的螯合剂缀合物，使得在用含有无菌的一定量的放射性金属的生物相容性载体复溶时，产生溶解得到所需放射性药物组合物。
在第五方面中螯合剂缀合物的优选方面描述于本发明的第二方面(上文)。
术语“试剂盒”意指一个或多个非放射性药用级容器，包括制备所需放射性药物组合物的必需化学药品以及操作说明书。所述试剂盒设计为用所需放射性金属复溶，以在最少操作的情况下产生适于人给予的溶液。
所述无菌固定形式优选为冻干固体。
对于99mTc，试剂盒优选为冻干的，且被设计成用来自99mTc放射性同位素发生器的无菌99mTc-高锝酸盐(TcO4 -)复溶，无需进一步操作产生适于人给予的溶液。合适的试剂盒包括容器(例如隔膜密封的小瓶)，容器装有呈游离碱或酸盐形式的螯合剂缀合物以及生物相容性还原剂例如连二亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、甲脒亚磺酸、亚锡离子、Fe(II)或Cu(I)。生物相容性还原剂优选为亚锡盐例如氯化亚锡或酒石酸亚锡。或者，试剂盒可任选包括非放射性金属络合物，所述非放射性金属络合物在加入锝时，进行金属转移作用(即金属互换)，产生所需产物。非放射性试剂盒还可任选包括上文定义的其它组分，例如转螯合剂(transchelator)、辐射防护剂、抗微生物防腐剂、pH调节剂或填充剂。
第六方面，本发明提供使人体或动物体成像的方法，所述方法包括使用PET或SPECT产生所述机体的至少一部分的图像，其中第一方面的成像剂或第二方面的放射性药物组合物分布在所述体内，其中提前已将所述成像剂或组合物给予所述机体。
第六方面的成像剂或组合物的优选方面分别描述于本发明的第一和第四方面(上文)。优选使用第四方面的放射性药物组合物。
优选哺乳动物是完整哺乳动物体体内，更优选为人受试者。优选可以最低限度的侵入方式(即甚至在专业的医学技术下进行时也不会给哺乳动物受试者带来实质的健康风险)，将成像剂给予哺乳动物体。这类最低限度的侵入给予优选为在不需要局部或全身麻醉的情况下静脉内给予所述受试者的外周静脉。
第六方面的成像优选为c-Met过量表达或定位的部位。c-Met过量表达或定位的部位优选为癌或癌前病变。
第六方面的成像方法可任选重复进行，以监测用药物或放射治疗人体或动物体的效果，所述成像在所述治疗之前和之后产生，还任选在所述治疗期间产生。特别令人关注的是早期监测癌症疗法的功效，以确保在病况变成晚期前恶性生长受到控制。
这个方面包括哺乳动物体体内c-Met过量表达或定位的部位的诊断方法，其包括第六方面的成像方法。
第七方面，本发明提供第一方面的成像剂、第四方面的放射性药物组合物或第五方面的试剂盒在人体或动物体的诊断方法中的用途。
第七方面的成像剂或组合物的优选方面分别描述于本发明的第一和第四方面(上文)。第七方面的诊断方法优选包括第六方面的成像方法及其优选方面。
通过以下详述描述的非限制性实施例对本发明进行说明。实施例1提供在两端具有代谢抑制基团(Z1 = Z2 = MIG)的本发明的cMBP肽(肽1)的合成。实施例2-4提供本发明的双官能胺官能化螯合剂(螯合剂1)的合成。实施例5提供本发明的双官能活性酯官能化螯合剂(螯合剂1A)的合成。实施例6提供本发明的肽(肽1)与螯合剂1 (“化合物1”)的螯合剂缀合物的合成。实施例7提供本发明的99mTc络合物(99mTc-化合物1)的制备，并显示络合作用在室温下以高放射化学产率有效进行。实施例8提供99mTc-化合物1的生物分布，并表明锝络合物显示具有良好肿瘤:背景比的有效的肿瘤吸收。
缩略语
使用常规单字母或三字母氨基酸缩写。
%id：百分比注射剂量
Ac：乙酰基
Acm：乙酰氨基甲基
ACN：乙腈
Boc：叔-丁氧基羰基
tBu：叔-丁基
DCM：二氯甲烷
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲亚砜
EDC：N-3-二甲基氨基丙基-N'-乙基碳二亚胺
Fmoc：9-芴基甲氧基羰基
HATU：O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基尿六氟磷酸酯
HBTU：O-苯并三唑-1-基- N,N,N',N'-四甲基尿六氟磷酸酯
HPLC：高效液相色谱法
HSPyU：O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四亚甲基尿六氟磷酸酯
NHS：N-羟基-琥珀酰亚胺
NMM：N-甲基吗啉
NMP：1-甲基-2-吡咯啉酮
Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PyBOP：苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷磷六氟磷酸酯
s.c.：皮下地
tBu：叔-丁基
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
TIS：三异丙基硅烷
Trt：三苯甲基。
本发明的化合物
其中：
化合物1在肽1羧基端Lys的ε胺基处官能化。
实施例1：肽1的合成。
步骤(a)：受保护的前体线性肽的合成。
前体线性肽具有以下结构：
Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。
采用Fmoc化学法，用0.1 mmol Rink Amide Novagel树脂开始，在AppliedBiosystems 433A肽合成仪上组装肽基树脂H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ψMe,Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-聚合物。在偶联步骤中，施加过量的1 mmol预活化的氨基酸(使用HBTU)。将Glu-Thr假脯氨酸(pseudoproline) (Novabiochem 05-20-1122)掺入序列内。将树脂转移至氮气起泡装置，用溶于DCM (5 mL)的乙酸酐(1 mmol)和NMM (1 mmol)的溶液处理60分钟。经过滤除去酐溶液，将树脂用DCM洗涤并在氮气流下干燥。
在含有2.5% TIS、2.5% 4-硫甲酚和2.5%水的TFA (10 mL)中处理2小时30分钟以同时除去侧链保护基和从树脂上切下肽。通过过滤除去树脂，真空除去TFA，并将乙醚加入残余物中。将所形成的沉淀用乙醚洗涤后风干，得到264 mg粗制肽。
粗制肽通过制备型HPLC (梯度：在40分钟内20-30% B，其中A = H2O/0.1% TFA和B= ACN/0.1% TFA，流速：10 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250 x 21.20 mm，检测：UV 214 nm，产物保留时间：30分钟)纯化，得到100 mg纯的肽1线性前体。纯的产物通过分析型HPLC (梯度：在10分钟内10-40% B，其中A = H2O/0.1% TFA和B = ACN/0.1% TFA，流速：0.3 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x 2 mm，检测：UV 214 nm，产物保留时间：6.54分钟)进行分析。进一步的产物表征采用电喷雾质谱法进行(MH2 2+计算值：1464.6，MH2 2+实测值：1465.1)。
步骤(b)：单环Cys4-16二硫桥的形成。
Cys4-16; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2。
将得自步骤(a)的线性前体(100 mg)溶于5% DMSO/水(200 mL)中，使用氨调节该溶液至pH 6。搅拌反应混合物5天。然后使用TFA调节溶液至pH 2，通过真空蒸发除去大部分溶剂。将残余物(40 mL)分批注入制备型HPLC柱中用于产物纯化。
残余物通过制备型HPLC (梯度：0% B达10分钟，然后在40分钟内0-40% B，其中A =H2O/0.1% TFA和B = ACN/0.1% TFA，流速：10 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 5μ C18 (2)250 x 21.20 mm，检测：UV 214 nm，产物保留时间：44分钟)纯化，得到72 mg纯的肽1单环前体。纯的产物(作为异构体P1-P3的混合物)通过分析型HPLC (梯度：在10分钟内10-40% B，其中A = H2O/0.1% TFA和B = ACN/0.1% TFA，流速：0.3 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 3μC18 (2) 50 x 2 mm，检测：UV 214 nm，产物保留时间：5.37分钟(PI)；5.61分钟(P2)；6.05分钟(P3))进行分析。进一步的产物表征采用电喷雾质谱法进行(MH2 2+计算值：1463.6，MH2 2+实测值：1464.1 (P1)；1464.4 (P2)；1464.3 (P3))。
步骤(c)：第二Cys6-14二硫桥(肽1)的形成。
在氮气层下，将得自步骤(b)的单环前体(72 mg)溶于75% AcOH/水(72 mL)中。依次加入1 M HCl (7.2 mL)和含0.05 M I2的AcOH (4.8 mL)，并搅拌混合物45分钟。加入1 M抗坏血酸(1 mL)，得到无色混合物。真空蒸发大部分溶剂，将残余物(18 mL)用水/0.1% TFA(4 mL)稀释，并使用制备型HPLC纯化产物。残余物通过制备型HPLC (梯度：0% B达10分钟，然后在40分钟内20-30% B，其中A = H2O/0.1% TFA，B =ACN/0.1% TFA，流速：10 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250 x 21.20 mm，检测：UV 214 nm，产物保留时间：43-53分钟)纯化，得到52 mg纯的肽1。纯的产物用分析型HPLC (梯度：在10分钟内10-40% B，其中A = H2O/0.1% TFA和B =ACN/0.1% TFA，流速：0.3 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 3μC18 (2) 50 x 2 mm，检测：UV 214 nm，产物保留时间：6.54分钟)进行分析。进一步的产物表征采用电喷雾质谱法进行(MH2 2+计算值：1391.5，MH2 2+实测值：1392.5)。
实施例2：1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷的合成。
步骤1(a)：3(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯。
将含甲酯基亚甲基三苯基正膦(167g，0.5mol)的甲苯(600ml)用3-酮戊二酸二甲酯(87g，0.5mol)处理，在氮气氛下，将反应物在120℃油浴中加热至100℃达36小时。然后将反应物真空浓缩，将油状残余物用600ml的40/60石油醚(petrol ether)/乙醚1:1研磨。三苯基氧膦沉淀出来，滗析/滤出上清液。在高真空Bpt (烘箱温度180-200℃，在0.2托下)对经真空蒸发的残余物进行Kugelrohr蒸馏，得到3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯(89.08g，53%)。
NMR 1H(CDCl3): δ 3.31 (2H, s, CH2), 3.7(9H, s, 3xOCH3), 3.87 (2H, s,CH2), 5.79 (1H, s, =CH, ) ppm。
NMR 13C(CDCl3), δ 36.56,CH3, 48.7, 2xCH3, 52.09和52.5 (2xCH2); 122.3和146.16 C=CH; 165.9, 170.0和170.5 3xCOO ppm。
步骤1(b)：3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯的氢化。
在氢气氛(3.5巴)下，将含3-(甲氧基羰基亚甲基)戊二酸二甲酯(89g，267mmol)的甲醇(200ml)用(10%披钯木炭：50%水) (9 g)振荡(30小时)。溶液经硅藻土过滤后真空浓缩，得到3-(甲氧基羰基甲基)戊二酸二甲酯，为油状物，收率(84.9g，94%)。
NMR 1H(CDCl3), δ 2.48 (6H, d, J=8Hz, 3xCH2), 2.78 (1H, hextet, J=8HzCH, ) 3.7 (9H, s, 3xCH3)。
NMR 13C(CDCl3), δ 28.6, CH; 37.50, 3xCH3; 51.6, 3xCH2; 172.28,3xCOO。
步骤1(c)：三甲酯至三乙酸酯的还原和酯化。
在氮气氛下，在三颈2L圆底烧瓶中，将含氢化锂铝(20g，588mmol)的THF (400ml)小心地用含三(甲氧基羰基甲基)甲烷(40g，212mmol)的THF (200ml)处理1小时。产生强放热反应，引起溶剂剧烈回流。将反应物在90℃油浴中在回流下加热3天。通过小心滴加乙酸(100ml)直到氢气释放停止，来使反应猝灭。以引起轻缓回流的速率小心地用乙酸酐溶液(500ml)处理经搅拌的反应混合物。配备烧瓶用于蒸馏和搅拌，然后在90℃ (油浴温度)加热以馏出THF。加入另一份乙酸酐(300ml)，反应回到回流配置中，在140℃油浴中搅拌并加热5小时。使反应物冷却并过滤。氧化铝沉淀用乙酸乙酯洗涤，将合并的滤液在旋转蒸发器中在50℃水浴温度下真空(5 mmHg)浓缩，得到油状物。使油状物在乙酸乙酯(500ml)中吸收，用饱和碳酸钾水溶液洗涤。将乙酸乙酯溶液分离，经硫酸钠干燥，并真空浓缩，到得油状物。在高真空中对油状物进行Kugelrohr蒸馏，得到三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g，95.9%)，为油状物。在0.1 mmHg下沸点220℃。
NMR 1H(CDCl3), δ 1.66(7H, m, 3xCH2, CH), 2.08(1H, s, 3xCH3); 4.1(6H, t,3xCH2O)。
NMR 13C(CDCl3), δ 20.9, CH3; 29.34, CH; 32.17, CH2; 62.15, CH2O; 171,CO。
步骤1(d)：由三乙酯中脱去乙酸酯基。
将含三(2-乙酰氧基乙基)甲烷(45.3g，165mM)的甲醇(200ml)和880氨水(100ml)在80℃油浴中加热2天。反应物用另一部分880氨水(50ml)处理，并在80℃油浴中加热24小时。加入另一部分880氨水(50ml)，将反应物在80℃下加热24小时。然后将反应物真空浓缩除去全部溶剂，得到油状物。将此在880氨水(150ml)中吸收，并在80℃下加热24小时。然后将反应物真空浓缩除去全部溶剂，得到油状物。Kugelrohr蒸馏得到乙酰胺，bp 170-1800.2mm。将含有乙酰胺的滴状物(bulb)洗净，并继续蒸馏。在bp 220℃ 0.2mm下馏出三(2-羟基乙基)甲烷(22.53g，92%)。
NMR 1H(CDCl3), δ 1.45(6H, q, 3xCH2), 2.2(1H, quintet, CH); 3.7(6H, t3xCH2OH); 5.5(3H, brs, 3xOH)。
NMR 13C(CDCl3), δ 22.13, CH; 33.95, 3xCH2; 57.8, 3xCH2OH。
步骤1(e)：三元醇至三(甲烷磺酸酯)的转化。
在氮气氛下，以温度不会升至超过15℃的速率，向搅拌的冰冷的含三(2-羟基乙基)甲烷(10g，0.0676mol)的二氯甲烷(50ml)中慢慢滴入甲烷磺酰氯(40g，0.349mol)的二氯甲烷(50ml)溶液。然后以放热反应温度不会升至超过15℃的速率滴加溶于二氯甲烷(50ml)的吡啶(21.4g，0.27mol，4eq)。在室温下搅拌反应物24小时，然后用5N盐酸溶液(80ml)处理，分离各层。水层用另外的二氯甲烷(50ml)萃取，合并有机萃取物，经硫酸钠干燥，过滤后真空浓缩，得到受过量甲烷磺酰氯污染的三[2-(甲基磺酰基氧基)乙基]甲烷。理论产量为25.8g。
NMR 1H(CDCl3), δ 4.3 (6H, t, 2xCH2), 3.0 (9H, s, 3xCH3), 2 (1H,hextet, CH), 1.85 (6H, q, 3xCH2)。
步骤1(f)：1,1,1-三(2-叠氮基乙基)甲烷的制备。
在氮气下，在15分钟内，将经搅拌的三[2-(甲基磺酰基氧基)乙基]甲烷[得自步骤1(e)，被过量甲烷磺酰氯污染] (25.8g，67mmol，理论值)的无水DMF (250ml)溶液用叠氮化钠(30.7g，0.47mol)分批处理。观察到放热，使反应物在冰浴中冷却。30分钟后，将反应混合物在50℃油浴中加热24小时。反应物的颜色变成褐色。使反应物冷却，用稀碳酸钾溶液(200ml)处理，并用40/60石油醚/乙醚10:1 (3x150ml)萃取3次。有机萃取物用水(2x150ml)洗涤，经硫酸钠干燥后过滤。将乙醇(200ml)加入汽油/醚溶液中以保持三叠氮化物处于溶解状态，在真空将体积降至不小于200ml。加入乙醇(200ml)，再次真空浓缩除去最后的痕量汽油，留下不小于200ml的乙醇溶液。三叠氮化物的乙醇溶液直接用于步骤1(g)。
小心：不要移动所有溶剂，因为叠氮化物有可能爆炸，并且应总是保持在稀溶液状态。
真空蒸发少于0.2ml的溶液以除去乙醇，在该少部分样品中运行NMR：NMR 1H(CDCl3), δ 3.35 (6H, t, 3xCH2), 1.8 (1H, septer, CH), 1.6 (6H, q, 3xCH2)。
步骤1(g)：1,1,1-三(2-氨基乙基)甲烷的制备。
将含三(2-叠氮基乙基)甲烷(15.06g，0.0676 mol) (假设得自前一反应的100%收率)的乙醇(200ml)用10%披钯木炭(2g，50%水)处理并氢化12小时。每2小时对反应容器抽真空以除去从反应中释放的氮气，并且再充入氢气。取出样品用于NMR分析以证实三叠氮化物完全转化成三胺。注意：未还原的叠氮化物在蒸馏时可能爆炸。使反应物通过硅藻土垫过滤除去催化剂并真空浓缩，得到三(2-氨基乙基)甲烷，为油状物。将该油状物在0.4mm/Hg下通过Kugelrohr蒸馏(bp. 180-200℃)进一步纯化，得到无色油状物(8.1g，自三元醇的82.7%总体收率)。
NMR 1H(CDCl3), δ 2.72 (6H, t, 3xCH2N), 1.41 (H, septet, CH), 1.39 (6H,q, 3xCH2).
NMR 13C(CDCl3), δ 39.8 (CH2NH2), 38.2 (CH2), 31.0 (CH)。
实施例3：3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷的制备。
将2-甲基丁-2-烯(147ml，1.4mol)和亚硝酸异戊酯(156ml，1.16mol)的混合物在干冰(cardice)和甲醇浴中冷却至-30℃，用顶置式空气搅拌器(overhead air stirrer)剧烈搅拌，以保持温度低于-20℃的这种速率用浓盐酸(140ml，1.68mol)逐滴处理。这需要约1小时，因为有明显放热，并且必须小心以防过热。加入乙醇(100ml)以降低在添加结束时形成的浆液的粘度，在-20℃至-10℃下再搅拌反应物2小时以完成反应。沉淀通过真空过滤收集，用4x30ml冷的(-20℃)乙醇和100ml冰冷的水洗涤，真空干燥，得到3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷，为白色固体。乙醇滤液和洗涤物经合并，用水(200ml)稀释并冷却，并使其在-10℃下静置1小时，此时又一批3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷结晶出来。沉淀经过滤收集，用最少量的水洗涤后真空干燥，得到经NMR>98%纯度的3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷总收率(115g，0.85mol，73%)。
NMR 1H(CDCl3), 为异构体的混合物(异构体1, 90%) 1.5 d, (2H, CH3), 1.65d, (4H, 2 xCH3), 5.85,q, 和5.95, q, 连同1H。 (异构体2, 10%), 1.76 s, (6H, 2xCH3), 2.07(3H, CH3)。
实施例4：双[N-(1,1-二甲基-2-N-羟基亚胺丙基)2-氨基乙基]-(2-氨基乙基)甲 烷(螯合剂1)的合成。
在氮气氛下，在室温下在剧烈搅拌的同时，向三(2-氨基乙基)甲烷(4.047g，27.9mmol)的无水乙醇(30ml)溶液中加入无水碳酸钾(7.7g，55.8mmol，2eq)。将3-氯-3-甲基-2-亚硝基丁烷(7.56g，55.8mol，2eq)的溶液溶于无水乙醇(100ml)中，将75ml的该溶液慢慢滴入反应混合物中。反应之后是二氧化硅TLC [板在二氯甲烷、甲醇、浓(0.88sg)氨水100/30/5中运行；TLC板通过用茚三酮喷雾并加热显色]。随RF递增顺序观察到一、二和三烷基化产物。使用PRP反相柱，以在3%氨水中含7.5-75%乙腈的梯度运行分析型HPLC。将反应物真空浓缩除去乙醇，并重新悬浮于水(110ml)中。含水浆液用乙醚(100ml)萃取以除去一些三烷基化化合物和亲脂性杂质，在水层中留下一烷基化产物和所需的二烷基化产物。水性溶液用乙酸铵(2eq，4.3g，55.8mmol)缓冲以确保进行良好的色谱法。将水性溶液保存在4℃下过夜，之后通过自动制备型HPLC纯化。
收率(2.2g，6.4mmol，23%)。
质谱法；阳离子10 V锥孔电压。实测值：344；计算值M+H= 344。
NMR 1H(CDCl3), δ 1.24(6H, s, 2xCH3), 1.3(6H, s, 2xCH3), 1.25-1.75(7H,m, 3xCH2,CH), (3H, s, 2xCH2), 2.58 (4H, m, CH2N), 2.88(2H, t CH2N2), 5.0 (6H,s, NH2 , 2xNH, 2xOH)。
NMR 1H ((CD3)2SO) δ 1.1 4xCH; 1.29, 3xCH2; 2.1 (4H, t, 2xCH2)；
NMR 13C((CD3)2SO), δ 9.0 (4xCH3), 25.8 (2xCH3), 31.0 2xCH2, 34.6 CH2,56.8 2xCH2N; 160.3, C=N。
HPLC条件：流速8ml/分钟，使用25mm PRP柱[A=3%氨溶液(sp.gr = 0.88) /水；B =乙腈]。
每次运行加载3ml水溶液，并在12.5-13.5分钟的时间窗内收集。
实施例5：螯合剂1-戊二酸的四氟苯硫酯(螯合剂1A)的合成。
a) [螯合剂1]-戊二酸中间体的合成。
将螯合剂1 (100 mg，0.29 mmol)溶于DMF (10 mL)，搅拌的同时分批加入戊二酐(33 mg，0.29 mmol)。搅拌反应物23小时，得到完全转化的所需产物。在RP-HPLC后，得到良好产率的纯酸。
b) 螯合剂1A的合成。
向含[螯合剂1]-戊二酸(得自步骤a；300 mg，0.66 mmol)的DMF (2 mL)中加入HATU (249 mg，0.66 mmol)和NMM (132 μL，1.32 mmol)。搅拌混合物5分钟，然后加入四氟苯硫酚(0.66 mmol，119 mg)。搅拌溶液10分钟，然后将反应混合物用20%乙腈/水(8 mL)稀释，产物通过RP-HPLC纯化，冷冻干燥后得到110 mg所需产物。
实施例6：肽1与螯合剂1的缀合物(化合物1)的合成。
将螯合剂1A (3.8 mg，实施例5)、肽1 (3.4 mg)和均三甲基吡啶(1.6 µL)溶于DMF(1 mL)中，搅拌溶液90分钟。将反应混合物用水(6 mL)稀释，产物采用制备型HPLC纯化。
粗制肽通过制备型HPLC (1在40分钟内0-20% B，其中A = H2O/0.1% TFA和B =ACN/0.1% TFA，流速：10 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 5μ C18 (2) 250 x 21.20 mm，检测：UV 214 nm)纯化，得到1.1 mg (28%)纯的化合物1。纯化的物质通过分析型HPLC (梯度：在5分钟内10-40% B，其中A = H2O/0.1% TFA和B = ACN/0.1% TFA，流速：0.6 mL/分钟，柱：Phenomenex Luna 3 μ C18 (2) 20 x 2 mm，检测：UV 214 nm，tR：3.04分钟)进行分析。进一步的产物表征采用电喷雾质谱法进行(实测m/z：1611.2，预期MH2 2+：1611.2)。
实施例7：化合物1的99mTc-放射性标记
步骤(i)：冻干小瓶。
将化合物1 (45 nmol)在第一小瓶(小瓶1)中冻干。单独配制含有下列配方的冻干试剂盒(小瓶2)：
组分 M.Wt mg µmoles
SnCl2.2H2O 225.63 0.016 0.07
MDP(H4) 176.00 0.025 0.14
NaHCO3 84.01 4.5 53.6
Na2CO3 105.99 0.6 5.66
NaPABA 159.12 0.20 1.26
步骤(ii)：放射性标记
小瓶1用水:乙醇溶液(0.1 mL的50:50混合物)复溶，对小瓶进行超声处理或混合10分钟。然后将所得到的化合物1溶液(0.1 mL)加入小瓶2中。然后将得自Drytec™发生器(GE Healthcare；0.9 ml，0.25-2.18 GBq)的99mTc-高锝酸盐洗出液加入小瓶中，在HPLC分析前，使溶液在室温下静置20分钟。RCP为93-94%。
实施例8：荷瘤裸小鼠中99mTc-化合物1的生物分布。
将CD-1雄性裸小鼠(约20g)关养在单独的通风笼中，自由进食和饮水。HT-29细胞(ATCC，目录号HTB-38)在补充10%胎牛血清和青霉素/链霉素的McCoy 5a培养基(Sigma #M8403)中培养。在70-80%汇合时，使用0.25%胰蛋白酶将细胞按1:3一周分传两次，并在5%CO2中于37℃下温育。在轻微的气体麻醉(异氟烷)下，使用细孔针(25 G)在一个部位(颈部)，以100 μl的体积106个细胞/注射的额定剂量给小鼠s. c注射HT-29细胞悬液。然后使肿瘤生长20天，或直到体积至少200mm3 (对于本研究中的内含物)。
20天生长时间后，通过尾静脉以静脉内推注给动物注射99mTc-化合物1 (0.1 ml，1-5 MBq/动物)。在注射后的不同时间点，使动物安乐死，解剖，取出下列器官和组织。120分钟p.i.的结果如下：
在120分钟p.i.时体内保持的44%的活性存在于肿瘤中。

Claims (11)

1.一种成像剂，其包含c-Met结合肽的螯合剂缀合物的放射性xTc络合物，所述螯合剂缀合物具有下式：
其中：
xTc为放射性同位素94mTc或99mTc；
肽1是Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2，在Cys4-16和Cys6-14处存在二硫桥；
螯合剂1是
。
2.权利要求1的成像剂，其中xTc为99mTc。
3.权利要求1所定义的螯合剂缀合物。
4.一种制备权利要求1-2中任一项的成像剂的方法，所述方法包括使权利要求3的螯合剂缀合物在合适的溶剂中与一定量的权利要求1或2定义的xTc反应。
5.一种放射性药物组合物，其包含呈适于哺乳动物给予的形式的权利要求1-2中任一项的成像剂以及生物相容性载体。
6.一种用于制备权利要求5的放射性药物组合物的试剂盒，其包括呈无菌固体形式的权利要求3的螯合剂缀合物，使得在用含有无菌的一定量的放射性xTc的生物相容性载体复溶时发生溶解，得到所需的放射性药物组合物；
其中xTc如权利要求1或2所定义。
7.权利要求1-2中任一项的成像剂或权利要求5的放射性药物组合物在制备用于使人体或动物体成像的药物中的用途，所述用途包括采用PET或SPECT产生所述人体或动物体的至少一部分的图像，其中所述成像剂或组合物分布在所述人体或动物体中，其中提前已将所述成像剂或组合物给予所述人体或动物体。
8.权利要求7的用途，其中所述图像具有c-Met过量表达或定位的部位。
9.权利要求8的用途，其中c-Met过量表达或定位的部位是癌症或癌前病变。
10.权利要求7-9中任一项的用途，其重复进行以监测用药物或放射治疗人体或动物体的效果，所述成像在治疗之前和之后、任选还在治疗期间形成。
11.权利要求1-2中任一项的成像剂、权利要求5的组合物或权利要求6的试剂盒在制备用于人体或动物体的诊断方法的药物中的用途。
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