CN109316609B

CN109316609B - 选择患者的方法

Info

Publication number: CN109316609B
Application number: CN201810897184.4A
Authority: CN
Inventors: G.T.达尔斯加尔德; I.A.威尔逊
Original assignee: GE Healthcare Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 2011-12-20
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2022-03-18
Anticipated expiration: 2032-12-19
Also published as: ES2676184T3; CA2859572A1; EP2795317A1; JP6186371B2; KR20140103276A; JP2015507620A; US9956303B2; CN109316609A; EP2795317B1; CA2859572C; DK2795317T3; KR102061366B1; WO2013092742A1; CN103998929A; GB201121914D0; US20140335022A1

Abstract

本发明涉及用于选择适于用靶向c‑Met的疗法来治疗的癌症患者的方法。所述方法使用包含适于在体内正电子发射断层扫描(PET)成像的¹⁸F‑放射性标记的c‑Met结合肽的成像剂。还公开了治疗方法、监测靶向c‑Met的疗法的方法以及所述成像剂和肽在本发明方法中的用途。

Description

选择患者的方法

本申请是申请日为2012年12月19日，中国国家申请号为201280063034.4，发明名称为“选择患者的方法”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于选择适于用靶向c-Met的疗法来治疗的癌症患者的方法。所述方法使用包含适于在体内正电子发射断层扫描(PET)成像的¹⁸F-放射性标记的c-Met结合肽的成像剂。还公开了治疗方法、监测c-Met疗法的方法以及所述成像剂和肽在本发明方法中的用途。

发明背景

肝细胞生长因子(HGF)，亦称为分散因子(scatter factor, SF)，是与多种生理过程(例如伤口愈合和血管发生)有关的生长因子。HGF与其受体(c-Met)相互作用的高亲和力相互作用牵涉肿瘤生长、侵袭和转移。

Knudsen等人已经综述了HGF和c-Met在前列腺癌中的作用，以及对成像和疗法可能的暗示[Adv.Cancer Res., 91, 31-67 (2004)]。WO 03/057155、EP 2127683 A1和WO2011/110642中描述了用于诊断和疗法的标记的抗-met抗体。

已表明c-Met在许多人上皮来源的癌症中涉及肿瘤生长、侵袭和转移。大多数癌表达c-Met，且已在下列癌症中检测到c-Met的表达相对于正常组织升高：肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈部癌、胃癌、肝细胞癌、卵巢癌、肾癌、胶质瘤、黑素瘤和众多肉瘤。在结肠直肠癌(CRC)中，已在发育异常的隐窝病灶(疾病的最早期瘤前病变)中检测到c-Met的过度表达。在头颈部鳞状细胞癌中，据报道大约80%的原发肿瘤表达或过度表达c-Met。在前列腺癌的骨转移中，据报道c-Met在80%以上的骨转移中过度表达。

正常情况下，c-Met在上皮细胞中表达，以旁分泌的方式被间充质衍生的HGF激活。正常细胞中c-Met的激活为瞬时事件，并且受到紧密调控。然而，在肿瘤细胞中，c-Met可具有组成型活性。在癌症中，异常的c-Met刺激可通过如下实现：c-Met扩增/过度表达、激活的c-Met突变(例如结构变更)以及通过产生自分泌信号转导环路获得自主生长控制。此外，c-Met受体的缺陷性下调也将促成细胞膜中异常的c-Met表达。尽管c-Met的过度表达为HGF依赖性的(自分泌/旁分泌)，但突变导致的结构变更为HGF非依赖性的(例如胞外结构域丢失)。

WO 2004/078778公开了结合c-Met或包含c-Met和HGF的复合物的多肽或多聚体肽构建体。描述了约10种不同结构类型的肽。WO 2004/078778公开了可用用于体外和体内应用的可检测标记或用于治疗应用的药物来标记肽。可检测标记可为：酶、荧光化合物、光学染料、顺磁性金属离子、超声造影剂或放射性核素。WO 2004/078778的优选标记陈述为放射性或顺磁性的，并最优选包含通过金属螯合剂螯合的金属。WO 2004/078778陈述了其中的放射性核素可选自：¹⁸F、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、⁷⁷Br、⁷⁶Br、^99mTc、⁵¹Cr、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴⁷Sc、¹⁶⁷Tm、¹⁴¹Ce、¹¹¹In、¹⁶⁸Yb、¹⁷⁵Yb、¹⁴⁰La、⁹⁰Y、⁸⁸Y、¹⁵³Sm、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、⁶²Cu、⁶⁴Cu、⁶⁷Cu、⁹⁷Ru、¹⁰³Ru、¹⁸⁶Re、²⁰³Pb、²¹¹Bi、²¹²Bi、^2l3Bi、^2l4Bi、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、^117mSn、¹⁴⁹Pm、¹⁶¹Tb、¹⁷⁷Lu、¹⁹⁸Au和¹⁹⁹Au。WO 2004/078778陈述了(62页)用于诊断目的的优选放射性核素为：⁶⁴Cu、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、^99mTc和¹¹¹In，特别优选^99mTc。

WO 2008/139207公开了17-30个氨基酸的c-Met结合环肽，其用适于利用波长600-1200 nm的绿至近红外光对哺乳动物机体体内成像的光学报道分子(reporter)成像部分标记。所述c-Met结合肽包含氨基酸序列：

Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶；

其中X¹为Asn、His或Tyr；

X²为Gly、Ser、Thr或Asn；

X³为Thr或Arg；

X⁴为Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；

X⁵为Ser或Thr；

X⁶为Asp或Glu；

并且Cys^a-d各自为半胱氨酸残基，使得残基a和b以及c和d环化形成两个独立的二硫键。WO 2008/139207的光学报道分子优选花菁染料。

WO 2009/016180公开了与WO 2008/139207中c-Met结合环肽相似的c-Met结合环肽，其中光学报道分子为苯并吡喃(benzopyrylium)染料。WO 2008/139207和WO 2009/016180的试剂陈述为可用于体外和体内光学应用，特别是人体的体内光学成像。结肠直肠癌的光学成像为优选应用。

WO 2011/020925公开了抗c-Met抗体及其用途。WO 2011/020925公开了所述抗体可用于帮助确定患者对用抗c-Met抗体治疗的敏感性。所述方法包括使用体外方法(肿瘤样品的免疫组织化学分析)以确定肿瘤的c-Met状态。然而，该方法仍然依赖于活检，具有上述缺陷。

Merchant等人[2011 ASCO Meeting；J.Clin.Oncol., Abstract 10632, 增刊(2011)]公开了用⁷⁶Br或⁸⁹Zr-标记的抗c-Met抗体(MetMab^TM)用于在小鼠异种移植中的c-Met分子成像。该试剂据报道表现出快速肿瘤摄取和缓慢的清除。

许多组织都在开发靶向c-Met的药物化疗药(“抗Met疗法”)。这样的药物预期通常用于转移性疾病。然而，迄今为止的临床结果表明患者预后依赖于对肿瘤的c-Met状态的了解。也有可能的是，c-Met状态对于抗c-Met疗法的反应具有预测性。目前，通过对采自患者的活检样品的免疫组织化学(IHC)分析可测定c-Met状态，但是活检是有创性的(对患者而言有某些风险)，并且可能不得到代表性样品。因此，具有采样错误的固有风险，其中采集的主要是健康组织，或因为肿瘤异质性，对于最具活性的肿瘤部分而言，采集了无代表性的分子特性(molecular profile)的一部分肿瘤[N.Engl.J.Med., 366(10)；883-892 (2012)]。另外，活检提供的信息仅针对所采样的肿瘤，而非整体上的患者肿瘤和/或肿瘤转移负荷。因为抗Met疗法有望用作第二或第三线疗法，所以代表未经治疗肿瘤的满意质量的活检材料可能难以得到，或者可能不再能代表肿瘤的分子特性。通常不进行经由活检的重新采样，因为它具有某些患病风险，并且也因为上文所述的问题。

在最近公布的研究[Cancer Discovery, 1(1)；44–53 (2011)]中，在经预治疗的具有晚期疾病的NSCLC患者(n=139)中研究了获取新活检和利用实时生物标记分析来选择治疗的价值。已经发现，根据分子特性来指派患者进行治疗，增加了阳性治疗结果的可能性。尽管据报道在试验中活检程序是良好耐受的，但气胸发生在11.5%的患者中，导致结论是，尽管对于治疗分层(treatment stratification)而言根据生物标记重新活检患者是有利的，但是并非没有风险。

在一种阻断c-Met的单克隆抗体MetMAb^TM(Roche)的II期试验中[2011 ASCOAnnual Meeting & http://www.roche.com/media/media_releases/med-cor-2011-05-19.htm]，NSCLC 患者随机接受以下之一：

(i) MetMAb + 埃罗替尼(EGFR抑制剂；或

(ii) 安慰剂 + 埃罗替尼。

通过存档样品的IHC和FISH分析测定c-Met状态(通过IHC，大约50%为阳性)。在整体患者组(即包括具有高和低的c-Met表达的患者)中，这两种治疗之间无差异。当分析数据时，根据存档活检样品的回顾性IHC分析，中位总体存活期在MetMAb组中为12.6个月，而埃罗替尼组中为3.8个月(p=0.002)。另外，具有低c-Met表达并用MetMAb与埃罗替尼联合治疗的患者与单用埃罗替尼相比具有更差的结果。治疗前的活检的前瞻性收集不包括在试验中，并且不知道基于存档样品的c-Met评分是否完全代表研究群体。

Oliner等人. [J Clin Oncol 30, 增刊, abstr 4005 (2012)]近期公布了HGF抗体rilotumumab (Amgen)与表柔比星、顺铂和卡培他滨(ECX)联合用于患有局部晚期或转移性胃或食管胃连接处癌症的患者的2期研究数据。与用安慰剂和ECX治疗的患者相比，当用联合疗法进行治疗时，具有c-Met高的肿瘤(>50%肿瘤细胞阳性)的患者具有改善的中位总体存活期。相反，与用安慰剂和ECX治疗的患者相比，当用联合疗法进行治疗时，具有c-Met低的肿瘤(≤50%阳性)的患者具有不利的总体存活期的趋势。在安慰剂和ECX组中，具有c-Met高的肿瘤的患者比具有c-Met低的肿瘤的患者具有较差的总体存活期。

因此，需要评价患者的肿瘤和/或肿瘤转移负荷的c-Met状态的较低创性的方法，以判定个体患者是否从抗Met疗法中获益。

发明内容

本发明提供在例如NSCLC、结肠直肠癌(CRC)和胃癌等癌症中判定患者肿瘤的c-Met状态的方法，以便在开始c-Met疗法之前帮助决策过程。对于抗Met疗法，治疗医生将需要在开始辅助性c-Met抑制剂疗法之前知道患者(肿瘤和转移)的c-Met状态。对于新诊断的患者，从诊断性活检的分子分析中得到答案是可能的，但对于标准疗法失败的患者而言，如果任何存档样品可用，它可能并不完全代表疾病的现有状态。

本发明的方法有助于医生判定个体患者何时从抗Met疗法中获益。重要的是，所述方法也有助于从这类治疗中排除其中抗Met疗法无效或具有负面影响的患者。

本发明的方法比起活检而言对患者的危险小得多，并具有对于所有肿瘤和转移(包括例如在难以活检的部位或在先前未知转移的部位的肿瘤表达)提供评价总体c-Met负荷的方法的优势。因此它给出了比活检样品(甚至假定这样的样品是可得的)分析更完整的患者全貌。另外，所述方法适合于在不同时间间隔重复成像，所以可用于监测抗Met疗法。

MetMab^TM表现出8-12天的组合消除半寿期，所以对于体内成像而言不具有理想的药物动力学，因为从背景清除将非常缓慢。相比之下，本发明的试剂允许在给予患者1小时内成像。

本发明还提供监测抗Met疗法的手段。预期具有以下意义：确定指定疗法证明对个体患者是成功的(并因此值得继续下去)，或是无效的，允许更早地改换成不同的治疗或药物。

发明详述

第一方面，本发明提供用于帮助判定先前诊断为罹患癌症的个体患者是否对抗Met疗法的治疗敏感的方法，所述方法包括：

(i) 提供包含¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽的成像剂；

(ii) 用步骤(i)的成像剂使所述癌症的至少一个部位成像，其中所述成像剂先前已给予所述患者；

(iii) 根据步骤(ii)的成像判定在所述部位是否增加了对所述成像剂的摄取；

(iv) 当步骤(iii)的判定显示摄取增加时，认为所述癌症过量表达c-Met，并且判定抗Met疗法适合于所述患者；

(v) 当步骤(iii)的判定显示摄取未增加时，认为所述癌症不过量表达c-Met，并且判定抗Met疗法不适合于所述患者；

其中所述c-Met结合环肽为式I的18-30聚体环肽：

Z¹-[cMBP]-Z²　　(I)

其中：

cMBP具有式II：

-(A)_x-Q-(A′)_y-　　(II)

其中Q为氨基酸序列(SEQ-1)：

-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶-

其中X¹为Asn、His或Tyr；

X²为Gly、Ser、Thr或Asn；

X³为Thr或Arg；

X⁴为Ala、Asp、Glu、Gly或Ser；

X⁵为Ser或Thr；

X⁶为Asp或Glu；

并且Cys^a-d各自为半胱氨酸残基，使得残基a和b以及c和d环化形成两个独立的二硫键；

A和A′独立地为除Cys外的任何氨基酸，前提是A和A′的至少一个存在并为Lys；

x和y独立地为数值0-13的整数，并且被选择使得[x+y] = 1至13；

Z¹连接在cMBP的N-端，并且为 H或M^IG；

Z²连接在cMBP的C-端，并且为OH、OB^c或M^IG，

其中B^c是生物相容性阳离子；

每个M^IG独立地为代谢抑制基团，其为在体内抑制或阻遏cMBP肽代谢的生物相容性基团；

其中cMBP在A或A′基团的Lys残基上用¹⁸F标记。

术语“c-Met”具有其常规含义，是指肝细胞生长因子(HGF)受体-也称为MET。HGF也称为分散因子(SF)。

术语“患者”是指哺乳动物，优选完整的哺乳动物机体体内，和更优选人类受试者。短语“先前诊断为罹患癌症”是指患者已被阳性地诊断为罹患癌症，并且优选个体患者的癌症的至少原发部位的位置是已知的。可通过本领域已知方法进行该诊断。该短语也包括癌前病灶，其中临床诊断为该病灶将发展为癌症，并且可从抗Met疗法的治疗中获益。

段语“对治疗敏感”是指个体患者正罹患一种形式的癌症，其中治疗将延长寿命预期和/或降低癌症病况对患者健康的影响。因此，对个体患者所采取的治疗的总体利益:风险比例是积极的(即有益的)。

术语“抗Met疗法”是指将药物递送给患者的化学疗法，其包含通过以下方式抑制HGF/c-Met信号转导的试剂：直接抑制受体(例如抗c-Met抗体)；通过其配体HGF的失活(例如AMG102、L2G7)；通过干扰HGF与c-Met结合(例如NK4)；或通过抑制c-Met激酶活性(例如PHA-665752和SU11274)。所述药物可通过任何合适的给药途径递送。本文所用的术语“抗Met疗法”不包括外射束放射疗法。优选的这类疗法描述于第二方面(下文)。

术语“成像剂”是指适于在哺乳动物机体的体内成像的化合物。优选地，哺乳动物是完整的哺乳动物机体体内，和更优选是人类受试者。优选地，成像剂可以以微创性方式(即在专业的医学专门技能下实施时对哺乳动物受试者无显著健康风险)给予哺乳动物机体。这样的微创性给予优选地是静脉给予所述受试者的外周静脉，无需局部或全身麻醉。本文所用的术语“体内成像”是指无创性地产生哺乳动物受试者内部状况的全部或部分的图像的那些技术。

术语“先前给予”是指涉及临床医生的步骤，其中在成像之前已经将成像剂给予哺乳动物受试者。

术语“摄取增加”是指来自在癌症目标区摄取的成像剂的信号的靶:背景比例相对于相邻组织背景中的该信号是阳性的。对于肿瘤:肌肉或肿瘤:血液比例而言，该比例的最小值是1.1:1。

术语“c-Met结合环肽”是指与肝细胞生长因子受体，也称为c-Met (或简称MET)结合的肽。合适的本发明的这类肽为式I的18-30个氨基酸的环肽。所述肽对于c-Met的表观K_D小于约20 nM。所述肽的cMBP序列包含脯氨酸残基，已知这类残基可呈现主链酰胺键的顺/反式异构化。本发明的cMBP肽包括任何这样的异构体。

Z¹基团取代cMBP末尾氨基酸残基的氨基(即氨基端)。因此，当Z¹为H时，cMBP的氨基端以末尾氨基酸残基的游离NH₂基团终止。Z²基团取代cMBP末尾氨基酸残基的羰基(即羧基端)。因此，当Z²为OH时，cMBP的羧基端以末尾氨基酸残基的游离CO₂H基团终止，当Z²为OB^c时，末端羧基作为CO₂B^c基团离子化。

术语“生物相容性阳离子”(B^c)意指与离子化的带负电基团形成盐的带正电的反离子，其中所述带正电的反离子亦为无毒的，因此适于给予哺乳动物机体，特别是人体。合适的生物相容性阳离子的实例包括：碱金属钠或钾；碱土金属钙和镁；以及铵离子。优选的生物相容性阳离子为钠和钾，最优选钠。

术语“代谢抑制基团”(M^IG)意指在氨基末端(Z¹)或羧基末端(Z²)抑制或阻遏cMBP肽体内代谢的生物相容性基团。此类基团是本领域技术人员所熟知的，并且对于肽的胺末端，合适地选自：

N-酰化基团–NH(C=O)R^G，其中酰基–(C=O)R^G具有选自以下的R^G：C_1-6烷基或C_3-10芳基或包含聚乙二醇(PEG)结构单元。对于肽的羧基末端：甲酰胺、叔丁酯、苄酯、环己酯、氨基醇或聚乙二醇(PEG)结构单元。优选的此类PEG基团为式IA或IB的生物改性剂：

(IA)

式IA的17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧杂十七烷酸

其中P为1-10的整数。或者，可使用基于式IB的丙酸衍生物的PEG-样结构：

(IB)

其中P如对于式IA所定义，q为3-15的整数。

在式IB中，p优选为1或2，q优选为5-12。

优选的此类氨基末端M^IG基团为乙酰基、苄氧羰基或三氟乙酰基，最优选乙酰基。

术语“¹⁸F-放射性标记的”是指c-Met结合环肽已经与放射性同位素¹⁸F共价缀合。¹⁸F经由C-F氟烷基或氟芳基键合适地连接，这是因为这些键在体内相对稳定，因此赋予对¹⁸F放射性标记自cMBP肽的代谢性切割具有抗性。¹⁸F优选通过C-F氟芳基键连接。¹⁸F可直接连接到cMBP的一个氨基酸上，但优选作为cMBP上放射性氟化取代基的部分而缀合。所述取代基优选具有下式：

-(L)_n-¹⁸F

其中：

L是合成的式-(A)_m-接头基团，其中每个A独立地为-CR₂-、-CR=CR-、-C≡C-、-CR₂CO₂-、-CO₂CR₂-、-NR(C=O)-、-(C=O)NR-、-NR(C=O)NR-、-NR(C=S)NR-、-SO₂NR-、-NRSO₂-、-CR₂OCR₂-、-CR₂SCR₂-、-CR₂NRCR₂-、-CR₂-O-N=、-CR₂-O-NR-、-CR₂-O-NH(CO)-、C_4-8环杂亚烷基、C_4-8环亚烷基、C_5-12亚芳基、或C_3-12杂亚芳基、氨基酸、糖或单分散聚乙二醇(PEG)结构单元；

每个R独立选自H、C_1-4烷基、C_2-4烯基、C_2-4炔基、C_1-4烷氧基烷基或C_1-4羟基烷基；

m为数值1-20的整数；

n为数值0或1的整数。

术语“氨基酸”是指L-或D-氨基酸、氨基酸类似物(例如萘基丙氨酸)或氨基酸模拟物(其可为天然存在或完全合成来源的)，并且可为光学纯的，即单一的对映体(因此为手性的)，或对映体的混合物。本文使用氨基酸的常规3字母或单字母缩写。本发明氨基酸优选为光学纯的。术语“氨基酸模拟物”意指天然存在的氨基酸的合成类似物，其为电子等排体，即设计为模拟天然化合物的立体和电子结构。这些电子等排体是本领域技术人员所熟知的，包括但不限于缩肽、反向-倒转(retro-inverso)肽、硫代酰胺、环烷烃或1,5-二取代四唑[参见M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)]。

术语“肽”意指包含两个或更多个如上所定义的通过肽键(即连接一个氨基酸的胺与另一个氨基酸的羧基的酰胺键)连接的氨基酸的化合物。

术语“糖”意指单糖、二糖或三糖。合适的糖包括：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖和乳糖。糖可任选被官能化以允许容易地偶联到氨基酸。因此，可将例如氨基酸的葡糖胺衍生物通过肽键缀合到其它氨基酸。天冬酰胺的葡糖胺衍生物(自NovaBiochem市售获得)为此类的一个实例：

。

当A和A′为“除Cys外的任何氨基酸”时，意指A和A′基团的额外氨基酸缺少游离硫醇基，特别是Cys残基。这是因为额外的Cys残基将具有形成扰乱Q序列的Cys^a-Cys^b和Cys^c-Cys^d二硫桥的二硫桥的风险，后果是c-Met结合亲和力丧失或降低。

优选的特征

在第一方面的方法中，所述癌症优选地是非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、头颈部癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胶质瘤或肉瘤、或上皮起源的其它癌症。所述癌症的肿瘤优选地是实体瘤。更优选地，所述癌症是NSCLC、结肠直肠癌或胃癌。最优选地，所述癌症是NSCLC。

优选的本发明cMBP肽对c-Met与c-Met/HGF复合物结合的K_D小于约10 nM (基于荧光偏振测定法测量)，最优选在1-5 nM的范围内，理想的为小于3nM。

式I和II的cMBP肽优选具有式IIA：

-(A)_x-Q-( A′)_z-Lys-

(IIA)

其中A如对于式II所定义，

z为数值0-12的整数，并且[x + z] = 0至12，

并且cMBP只包含一个Lys残基。

因此，在式IIA中，该单独的Lys残基特别地位于cMBP的C末端。其进而意指¹⁸F放射性标记优选位于C末端位置。

Q优选地包含SEQ-2或SEQ-3的氨基酸序列：

Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶(SEQ-2)；

Ala-Gly-Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶-Gly-Thr (SEQ-3)。

在SEQ-1、SEQ-2和SEQ-3中，X³优选地为Arg。在式I和式II中，-(A)_x-或-( A′)_y-基团优选地包含选自以下的接头肽：

-Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4)、

-Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5)或

-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6)。

第一方面的cMBP肽优选具有氨基酸序列(SEQ-7)：

Ala-Gly-Ser-Cys^a-Tyr-Cys^c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys。

优选的本发明成像剂具有受M^IG基团保护的两个cMBP肽末端，即优选Z¹和Z²二者均为M^IG，其将通常是不同的。两个肽末端均用这种方式保护对体内成像应用而言是重要的，这是因为否则预期将会快速肽代谢，后果是丧失对c-Met的选择性结合亲和力。当Z¹和Z²二者均为M^IG时，优选Z¹为乙酰基，Z²为伯酰胺。最优选Z¹为乙酰基并且Z²为伯酰胺并且¹⁸F部分连接到cMBP赖氨酸残基的ε胺侧链。

放射性氟化的取代基-(L)_n-¹⁸F可连接到c-Met结合肽N末端的α氨基上，或备选地连接到任何氨基取代的氨基酸(例如Lys残基)的胺侧链上。其优选连接到cMBP的Lys残基的epsilon (ε)氨基上。

优选的放射性氟化的取代基-(L)_n-¹⁸F具有n = 1，即，存在1个如上定义的合成的接头基团。更优选此类取代基包含结合到苯基的¹⁸F放射性标记，即，取代基具有下式：

–(A)_xC₆H₄-¹⁸F

其中：A如上定义，

x为数值0-5的整数。

最优选的此类取代基产生自Lys胺残基与氟化活性酯的N-酰化，或Lys胺残基的氨基-氧基衍生物与氟化苯甲醛的缩合，并且具有下式：

第一方面的成像剂优选地是以包含以下的成像剂组合物来提供：

(i) 如第一方面中定义的¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽；

(ii) 未标记的c-Met结合环肽；

其中：(i)和(ii)中所述c-Met结合环肽具有相同的氨基酸序列，

并且其中所述组合物中存在的未标记cMBP肽不超过所述¹⁸F-标记的cMBP肽的摩尔量的50倍。

组合物中的¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽的优选实施方案如上所述。术语“组合物”具有其常规含义，即特定组分的混合物。组合物可为固体或液体/溶液形式。

术语“未标记的”意指c-Met结合环肽为非放射性的，即没有用¹⁸F或任何其它放射性同位素放射性标记。组合物中可存在一种或多种此类肽，这些未标记的肽主要包括第四方面(下文)的非放射性前体。术语“未标记的”不包括¹⁹F标记的c-Met结合环肽，其中所述¹⁹F存在于用于放射性标记所述c-Met结合环肽的¹⁸F-氟化物中，因此为相同的放射性标记反应的产物。如本领域所知，若两种氟取代的化合物仅仅是氟原子的同位素不同，它们在化学上将会以几乎相同的方式表现，因此其分离将极其困难。未标记的c-Met结合环肽或前体优选具有已经连接的基团Z¹和/或Z²。

未标记的c-Met结合环肽优选以相应¹⁸F-标记肽的摩尔量的最多30倍，更优选最多20倍，最优选少于10倍存在于所述组合物中。所述组合物优选呈溶液形式，其中组分(i)和(ii)二者均存在于溶液中。更优选所述溶液为生物相容性溶剂，或两种或更多种此类溶剂的混合物。优选的此类生物相容性溶剂在下文中描述，并优选包含水性溶剂。

第一方面的成像剂优选地是以适于给予哺乳动物的无菌形式的药物组合物来提供，所述药物组合物包含所述成像剂以及生物相容性载体。“生物相容性载体”为流体，尤其是液体，其中成像剂可悬浮或优选溶解，使得组合物是生理学上可耐受的，即，可给予哺乳动物机体，而没有毒性或过度不适。生物相容性载体适宜地为注射用载体液体，例如无菌无热原的注射用水；水溶液，例如盐水(其可有利地是平衡的，使得用于注射的最终产品为等渗的)；包含生物相容缓冲剂的水性缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲液)；一种或多种张度-调节物质(例如等离子体阳离子与生物相容的反离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨醇或甘露醇)、二醇(例如甘油)或其它非离子多元醇物质(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水溶液。优选生物相容性载体为无热原的注射用水、等渗盐水或磷酸盐缓冲液。为了控制pH优选使用缓冲液。优选地，将组合物维持在PH 7.5或以上，任选包含5-10% v/v 乙醇作为增溶剂。药物组合物可含有额外的任选赋形剂，例如：抗微生物的防腐剂、pH调节剂、填充剂、辐射防护剂、增溶剂或重量摩尔渗透压浓度调节剂。

最优选的本发明成像剂组合物包含在水性缓冲液中的连接Z¹ = Z² = M^IG的SEQ-7的cMBP肽以及对氨基苯甲酸辐射防护剂和乙醇辐射防护剂/增溶剂的组合。这种优选组合物中优选的SEQ-7肽为肽1，并且优选的¹⁸F-标记的cMBP肽为化合物3。放射性浓度优选小于350 MBq/ml，pABA浓度为2 mg/ml，乙醇为约5-10%体积/体积，优选6.5-7.5%体积/体积。

成像剂和生物相容性载体各自在包括密封容器加上任选惰性顶空气体(例如氮气或氩气)的合适的小瓶或容器中提供，所述密封容器允许保持无菌完整性和/或放射性安全，所述惰性顶空气体同时允许通过注射器或插管加入及取出溶液。

可在无菌制备(即洁净室)条件下制备药物组合物，以提供所需的无菌无热原的产物。优选关键组分无菌，尤其是所涉及的试剂加仪器中与成像剂接触的那些部分(例如小瓶)。可通过本领域已知方法对组分及试剂灭菌，所述方法包括：除菌过滤，使用例如γ-辐射、高压灭菌、干热或化学处理(例如用环氧乙烷)进行终端灭菌。优选事先对某些组分灭菌，以使需要进行最少量的操作。然而，作为预防措施，优选包括至少除菌过滤步骤作为制备药物组合物中的最终步骤。

第一方面的成像剂可以通过合适前体的放射性氟化而制备。这样的前体包括：

(i) 式I的c-Met结合环肽，其中Z¹=Z²=M^IG；或

(ii) 氨基-氧基官能化的c-Met结合环肽。

术语“氨基-氧基官能化的c-Met结合环肽”是指与氨基-氧基官能团共价缀合的式I的c-Met结合环肽。这样的氨基-氧基基团具有式-O-NH₂，优选-CH₂O-NH₂，并具有这样的优势：在与醛形成肟醚的缩合反应中氨基-氧基基团的胺比Lys胺基团更有反应性。这样的氨基-氧基基团可合适地连接在cMBP的Lys残基，如下文所述。

前体为非放射性的，并设计为可以以高度化学纯度获得。它亦经设计使得在与合适的¹⁸F源反应时，反应有效发生并具有令人满意的放射化学纯度(RCP)。“合适的¹⁸F源”取决于前体的性质。当前体包含未标记的式I的c-Met结合肽时，未标记肽的赖氨酸(Lys)残基的胺基团被设计为放射性标记的位点。cMBP肽的末端被保护，这是因为Z¹=Z²=M^IG。优选这样的c-Met结合肽和优选的Z¹/Z²基团如第一方面中所述。因此，合适的¹⁸F源被设计为尽可能有效地与赖氨酸胺基团、优选Lys的ε胺反应。

为了制备药物组合物，前体优选为无菌形式，更优选冻干固体。前体优选为氨基-氧基官能化的c-Met结合肽。

本发明的式I的c-Met结合肽，即Z¹-[cMBP]-Z²可通过制备方法而获取，所述方法包括：

(i) 线性肽的固相肽合成，该肽具有与所需cMBP肽相同的肽序列，并且其中Cys^a和Cys^b为未保护的，Cys^c和Cys^d残基具有硫醇基保护基；

(ii) 在溶液中用水性碱处理来自步骤(i)的肽，以产生具有连接Cys^a和Cys^b的第一个二硫键的单环肽；

(iii) 除去Cys^c和Cys^d的硫醇基保护基并环化，以产生连接Cys^c和Cys^d的第二个二硫键，其为所需的二环肽产物Z¹-[cMBP]-Z²。

术语“保护基”意指这样的基团：其抑制或阻遏不需要的化学反应，但是经设计具有足够的反应性，使其可在不改变分子的其余部分的足够温和的条件下从目标官能团裂解。在脱保护后，得到所需的产物。胺保护基为本领域技术人员众所周知的，并且适宜地选自：Boc (其中Boc为叔丁氧羰基)、Fmoc (其中Fmoc为芴基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、Dde [即1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基]或Npys (即3-硝基-2-吡啶氧硫基)。合适的硫醇基保护基为Trt (三苯甲基)、Acm (乙酰胺基甲基)、t-Bu (叔丁基)、叔丁基硫代(tert-Butylthio)、甲氧基苄基、甲基苄基或Npys (3-硝基-2-吡啶氧硫基)。其它保护基的应用描述于‘Protective Groups in Organic Synthesis’，第四版，Theorodora W. Greene和Peter G. M. Wuts, [Wiley Blackwell, (2006)]。优选的胺保护基为Boc和Fmoc，最优选Boc。优选的胺保护基为Trt和Acm。

实施例1和2提供进一步的具体细节。固相肽合成的进一步细节描述于P. Lloyd-Williams, F. Albericio和E. Girald；Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins，CRC Press, 1997。cMBP肽最好在惰性气氛下储存并在冷藏箱保存。当在溶液中使用时，最好避免PH超过7，因为这样具有扰乱二硫键的风险。

氨基-氧基官能化的c-Met结合肽可以通过以下方法制备：Poethko等人[J.Nucl.Med., 45, 892-902 (2004)], Schirrmacher等人 [Bioconj.Chem., 18, 2085-2089 (2007)], Solbakken等人 [Bioorg.Med.Chem.Lett, 16, 6190-6193 (2006)]或Glaser等人 [Bioconj. Chem., 19, 951-957 (2008)]。氨基-氧基基团可任选用两步缀合。首先，将N-保护的氨基-氧基羧酸或N-保护的氨基-氧基活化酯缀合到c-Met结合肽。其次，将中间体N-保护的氨基-氧基官能化的c-Met结合肽脱保护，以产生所需产物(参见以上引用的Solbakken和Glaser论文)。N-保护的氨基-氧基羧酸例如Boc-NH-O-CH₂(C=O)OH是市售的，例如来自Novabiochem。

¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽可以按下制备：

(i) 如上所述，提供前体；

(ii) 当所述前体包含未标记的式I的c-Met结合环肽(其中Z¹=Z²=M^IG)时，在活化剂的存在下与¹⁸F-标记的活化酯或¹⁸F-标记的羧酸反应，以产生在所述环肽的cMBP的Lys残基处通过酰胺键缀合的¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽；

(iii) 当所述前体包含氨基-氧基官能化的c-Met结合环肽时，进行以下反应：

(a) 在活化剂的存在下与¹⁸F-标记的活化酯或¹⁸F-标记的羧酸反应，以产生在所述官能化肽的氨基-氧基位置处通过酰胺键缀合的¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽；或

(b) 与¹⁸F-标记的醛反应，以产生在所述官能化肽的氨基-氧基位置处通过肟醚键缀合的¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽。

术语“活化酯”或“活性酯”意指相关羧酸的酯衍生物，其被设计为更好的离去基团，并因此允许与亲核试剂例如胺更容易反应。合适的活性酯的实例是：N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基琥珀酰亚胺酯；五氟苯酚；五氟苯硫酚；对硝基苯酚；羟基苯并三唑和PyBOP (即六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷

)。优选的活性酯是N-羟基琥珀酰亚胺或五氟苯酚酯，特别是N-羟基琥珀酰亚胺酯。

术语“活化剂”意指用于促进胺与羧酸之间的偶联以产生酰胺的试剂。合适的此类活化剂在本领域中是已知的，且包括碳二亚胺，例如EDC [N-(3-二甲基氨基丙基)-N＇-乙基碳二亚胺]和N,N＇-二烷基碳二亚胺例如二环己基碳二亚胺或二异丙基碳二亚胺；和三唑，例如HBTU [六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N＇-,N＇-四甲基脲

]、HATU [六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N＇-,N＇-四甲基脲

]和PyBOP [六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷

]。进一步的细节在以下文献中给出：“March’sAdvanced Organic Chemistry”, 第5版, 第508-510页, Wiley Interscience (2001)。优选的此类活化剂为EDC。

¹⁸F-标记的活化酯，例如[¹⁸F]SFB，可以通过Glaser等人及其中的参考文献[J.Lab.Comp.Radiopharm., 52, 327-330 (2009)]的方法或Marik等人的自动化方法[Appl.Rad.Isot., 65(2), 199-203 (2007)]制备：

¹⁸F-SFB

¹⁸F-标记的羧酸可以通过以上引用的Marik等人的方法而获取。

式¹⁸F(CH₂)₂O[CH₂CH₂O]_qCH₂CHO (其中q为3)的¹⁸F-标记的脂族醛可以通过Glaser等人 [Bioconj.Chem., 19(4), 951-957 (2008)]的方法而获取。¹⁸F-氟苯甲醛可以通过Glaser等人 [J.Lab.Comp.Radiopharm., 52, 327-330 (2009)]的方法而获取。前体Me₃N⁺-C₆H₄-CHO. CF₃SO₃ ^-通过Haka等人[J.Lab.Comp.Radiopharm., 27, 823-833 (1989)]的方法而获取。

¹⁸F-标记的醛与氨基-氧基官能化的c-Met肽的缀合优选在苯胺催化剂存在的情况下进行，如 Flavell 等人[J.Am.Chem.Soc., 130(28), 9106-9112 (2008)]所述。同时，可能使用保护的氨基-氧基c-Met肽(例如化合物1)作为前体，优选游离的氨基-氧基衍生物(例如化合物2)。这是因为整个合成更易于自动化，而用保护的前体通常需要手动脱保护步骤。

优选的成像剂组合物可以如下获得：

(i) 制备¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽；

(ii) 色谱分离未标记的 c-Met结合环肽与¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽。

步骤(ii)的色谱分离可以通过HPLC或SPE (固相提取)进行，使用一个或多个SPE柱。当使用自动合成仪时优选SPE，在其它情况下优选HPLC。实施例5提供用于本发明化合物3的合适HPLC方法。

当成像剂以药物组合物形式提供时，制备方法优选使用自动合成仪装置实施。术语“自动合成仪”意指基于Satyamurthy等人[Clin.Positr.Imag., 2(5), 233-253(1999)]所述的单元操作原理的自动模块。术语“单元操作”意指复杂的过程被简化为一系列简单操作或反应，其可应用于一系列材料。这样的自动合成仪对于本发明方法是优选的，特别是当需要放射性药物组合物时。它们可购自多个供应商[Satyamurthy等人,上文]，包括：GE Healthcare；CTI Inc；Ion Beam Applications S.A. (Chemin du Cyclotron 3,B-1348 Louvain-La-Neuve, Belgium)；Raytest (Germany)和Bioscan (USA)。

第二方面，本发明提供先前诊断为罹患癌症的个体患者的治疗方法，所述方法包括：

(i) 进行第一方面的判定方法；

(ii) 当步骤(i)的判定是抗Met疗法适合于所述患者时，则对所述患者开始或继续抗Met疗法。

第二方面的成像剂和判定方法的优选方面如第一方面(上文)中所述。

术语“抗Met疗法”如第一方面(上文)中所定义。抗Met疗法优选包括：

(a)非蛋白性的c-Met抑制剂；

(b)抗Met抗体或其片段；

(c)抗HGF抗体或其片段；

(d)间接影响c-Met信号转导途径的药物；

或其组合。

术语“非蛋白性的”具有其常规含义。优选这类c-Met抑制剂是合成的。术语“合成的”具有其常规意义，即与分离自天然来源(例如自哺乳动物机体)相对而言的人造的。这类化合物具有以下优势：其制备和杂质概况可以是完全受控的。c-Met抑制剂优选是“小分子”，即分子量小于2000道尔顿，更优选小于1500道尔顿，最优选小于1000道尔顿。

段语“间接影响c-Met信号转导途径的药物”是指在上游或下游干扰c-Met信号转导途径的药理学活性化合物，其方式是对c-Met调控、表达或功能具有抑制/拮抗或激动效应。间接影响Apc基因转录和c-Met的下游表达的药物实例是：β-连环蛋白抑制剂或NFκB /IKK抑制剂。进一步的细节是Toschi等人[Clin.Cancer Res., 14(19), 5941-5946(2008)]提供的抗Met疗法。已经批准了两种抗Met疗法(crizotinib和cabozantinib)，更多的目前正处于临床开发中(根据http://clinicaltrials.gov/ct2/search和多个科学会议的摘要)，如下：

Crizotinib目前在某些国家已经上市。

第二方面，可将所述抗Met疗法作为与另外治疗的联合疗法的部分任选递送，其中所述另外治疗选自：

(i) EGFR抑制剂；

(ii) 酪氨酸激酶抑制剂；

(iii) VEGF抑制剂；

(iv) 标准癌症化疗药；

(v) β-连环蛋白抑制剂。

第三方面，本发明提供如第二方面中定义的先前诊断为罹患癌症并先前经抗Met疗法治疗的个体患者的疗法的监测方法，其中所述方法包括在开始所述疗法之后在一个或多个时间间隔分别进行第一方面的步骤(ii)和(iii)的成像和判定。

第三方面的成像剂和判定的优选实施方案如第一方面(上文)中所述。第三方面中的抗Met疗法的优选实施方案如第二方面 (上文)中所述。

在第三方面的监测方法中，预期将进行患者癌症的目标区的多次成像。比较成像技术是本领域已知的，例如图像相减和/或在不同时间点的肿瘤:背景比率分析可用于帮助判定在响应抗Met疗法或其它疗法时c-Met过量表达程度是否变化，所述其它疗法可影响c-Met表达(例如在非小细胞肺癌中用埃罗替尼失败的患者中c-Met上调[Cappuzz等人.Annal.Oncol., 20: 298–304 (2009)；Engelman,等人. Science 316, 1039-1043(2007)]，和响应电离放射的c-Met上调，导致放射抗性[De Bacco等人., J.Natl.CancerInst., 103(8), 645-61 (2011)]。然后可在以下方面改变对患者的处置，例如，继续治疗；改变剂量；改换为不同的抗Met疗法；开始联合疗法、选择性手术或结束疗程。

基线扫描测定c-Met体内表达，接着在疗法开始一个月内继续第二次扫描，有可能指示对疗法的最终响应，如在较晚时间点通过测定肿瘤大小来评价。在疗法开始之后的c-Met 表达急剧下降的假设是疗法响应的指示。其临床应用可以是减少耗费在给予无用疗法上的时间和金钱。因此，序贯扫描具有提供抗c-Met疗法未能维持抗肿瘤效应的早期信号的潜力。在这种情况下，c-Met 表达的变化(或可能上升)的缺乏有可能准确和可靠地预测疗法失败。这可能具有重要的临床应用，因为它将促进早期改换为可能证明更有效的备选疗法。

第四方面，本发明提供如第一方面中定义的¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽在第一方面的判定方法、在第二方面的治疗方法、或在第三方面的监测方法中的用途。

第四方面的¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽的优选方面如第一方面(上文)中所述。

第五方面，本发明提供如第一方面中所定义的式(I)的c-Met结合环肽在第一方面的判定方法、在第二方面的治疗方法、或在第三方面的监测方法中的用途。

第五方面的c-Met结合环肽和判定方法的优选方面如第一方面(上文)中所述。第五方面的治疗方法的优选方面如第二方面(上文)中所述。第五方面的监测方法的优选方面如第三方面(上文)中所述。

第六方面，本发明提供如第二方面中所定义的抗Met疗法在第二方面的治疗方法、或在第三方面的监测方法中的用途。

第六方面的抗Met疗法的优选方面如第一方面(上文)中所述。

本发明通过下文详述的非限制性实施例来说明。实施例1提供在两个末端含有代谢抑制基团(Z¹ = Z² = M^IG)的本发明cMBP肽(肽1)的合成。实施例2提供受保护的本发明前体(化合物1)的合成。实施例3提供氟标记c-Met肽的非放射性氟化(即¹⁹F)对应物(化合物3A)的合成。实施例4提供本发明¹⁸F -放射性氟化c-Met肽(化合物3B)的合成。实施例5提供用于分离标记和未标记的c-Met结合肽的HPLC条件。

实施例6提供本发明¹⁸F -标记的肽(化合物3B)在动物肿瘤模型中的生物分布。结果显示与HT-29肿瘤中表达的人c-Met受体结合，因此可用于肿瘤成像。实施例7证明实施例6的肿瘤摄取是特异性的，这是因为摄取可被非放射性¹⁹F -标记的c-Met结合肽(化合物3A)的共给予而抑制。

实施例8亦证明当¹⁹F -标记的c-Met结合肽被共给予时在灵长类中肝脏摄取减少约40%。肽的¹⁹F -标记的杂乱形式(scrambled version)(无c-Met受体亲和力)的共给予没有显著减少肝脏摄取。肝脏具有高水平的c-Met表达，因此认为与¹⁹F -标记的cMBP竞争后摄取的减少代表c-Met体内特异性结合的证据。

实施例9显示化合物3B的自动合成，进一步包括自动使用SPE柱纯化。结果表明，使用该方法，化合物3B 可以高纯度和令人满意的放射化学收率而获取。实施例10描述了使用本发明的成像剂的人体成像。

缩略语

使用常规单字母或三字母氨基酸缩写。

%id:　　百分比注射剂量

Ac:　　乙酰基

Acm:　　乙酰胺基甲基

ACN:　　乙腈

Boc:　　叔丁氧基羰基

DCM:　　二氯甲烷

DIPEA:　　N,N-二异丙基乙胺

DMF:　　二甲基甲酰胺

DMSO:　　二甲亚砜

EDC:　　N-3-二甲氨基丙基)-N＇-乙基碳二亚胺

Fmoc:　　9-芴基甲氧基羰基

HBTU:　　六氟磷酸O-苯并三唑-1-基-N,N,N',N'-四甲基脲

HPLC:　　高效液相色谱

HSPyU 　六氟磷酸O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N´,N´-四亚甲基脲

NHS:　　N-羟基-琥珀酰亚胺

NMM:　　N-甲基吗啉

NMP:　　1-甲基-2-吡咯烷酮

pABA:　　对氨基苯甲酸

Pbf:　　2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

PBS:　　磷酸盐缓冲盐水

p.i.:　　注射后

PyBOP:　　六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷

SPE:　　固相提取

SUV:　　标准摄取值

tBu:　　叔丁基

TFA:　　三氟乙酸

TIS:　　三异丙基甲硅烷

Trt:　　三苯甲基

本发明的化合物

其中：化合物1、2和3在肽1的羧基端Lys的ε胺基处官能化；Boc =叔丁氧基羰基。

实施例1: 肽1的合成

步骤(a): 受保护的前体线性肽的合成

前体线性肽具有以下结构：

Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH₂

将肽基树脂H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ψ^Me,Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-聚合物装配在AppliedBiosystems 433A肽合成仪上，使用Fmoc化学，开始于0.1 mmol Rink Amide Novagel树脂。在偶联步骤中，施加过量的1 mmol预活化的氨基酸(使用HBTU)。Glu-Thr假脯氨酸(Novabiochem 05-20-1122)掺入序列中。将树脂转移至氮气起泡装置，用溶于DCM (5 mL)的乙酸酐(1 mmol)和NMM (1 mmol)的溶液处理60分钟。经过滤除去酐溶液，将树脂用DCM洗涤并在氮气流下干燥。

在含有2.5% TIS、2.5% 4-硫甲酚和2.5%水的TFA (10 mL)中2小时30分钟以同时除去侧链保护基和从树脂上切下肽。通过过滤除去树脂，真空除去TFA，并将乙醚加入残余物中。将所形成的沉淀用乙醚洗涤后风干，得到264 mg粗制肽。

粗制肽通过制备型HPLC (梯度:在40分钟内20-30% B，其中A = H₂O /0.1% TFA和B = ACN/0.1% TFA，流速:10 mL/分钟，柱: Phenomenex Luna 5 μ C18 (2) 250 x21.20mm，检测:UV 214 nm，产物保留时间: 30分钟)纯化，得到100 mg纯的肽1线性前体。纯的产物通过分析型HPLC (梯度:在10分钟内10-40% B，其中A = H₂O /0.1% TFA和B = ACN/0.1%TFA,流速: 0.3 mL/分钟，柱: Phenomenex Luna 3 μ C18 (2) 50 x 2 mm,检测: UV214 nm,产物保留时间: 6.54分钟)进行分析。进一步的产物表征采用电喷雾质谱法进行(MH₂ ²⁺计算值:1464.6，MH₂ ²⁺实测值:1465.1)。

步骤(b): 单环Cys4-16二硫桥的形成

Cys4-16；Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH₂

将得自步骤(a)的线性前体(100 mg)溶于5% DMSO/水(200 mL)中，使用氨调节该溶液至PH 6。搅拌反应混合物5天。然后使用TFA调节溶液至pH 2，通过真空蒸发除去大部分溶剂。将残余物(40 mL)分批注入制备型HPLC柱中用于产物纯化。

残余物通过制备型HPLC (梯度: 0% B达10分钟，然后在40分钟内0-40% B，其中 A= H₂O /0.1% TFA 和 B = ACN/0.1% TFA，流速：10 mL/分钟，柱: Phenomenex Luna 5 μC18 (2) 250 x 21.20 mm，检测: UV 214 nm，产物保留时间: 44分钟)纯化，得到72 mg纯的化合物1单环前体。

纯的产物(作为异构体P1-P3的混合物)通过分析型HPLC (梯度:在10 分钟内 10-40% B，其中 A = H₂O/0.1 % TFA 和 B = ACN/0.1% TFA，流速:0.3 mL/分钟，柱:Phenomenex Luna 3 μ C18 (2) 50 x 2 mm,检测: UV 214 nm,产物保留时间: 5.37 min(P1)；5.61 min (P2)；6.05 min (P3))进行分析。进一步的产物表征采用电喷雾质谱法进行(MH₂ ²⁺计算值:1463.6，MH₂ ²⁺实测值:1464.1 (P1) ；1464.4 (P2) ；1464.3 (P3))。

步骤(c): 第二Cys6-14二硫桥(肽1)的形成

在氮气层下，将得自步骤(b)的单环前体(72 mg)溶于75% AcOH/水(72 mL)中。依次加入1 M HCl (7.2 mL)和含0.05 M I₂的AcOH (4.8 mL)，并搅拌混合物45分钟。加1 M抗坏血酸(1 mL)，得到无色混合物。真空蒸发大部分溶剂，将残余物(18 mL)用水/0.1% TFA(4 mL)稀释，并使用制备型HPLC纯化产物。

残余物通过制备型HPLC (梯度: 0% B 达 10 分钟，然后在 40 分钟内 20-30%B，其中 A = H₂O /0.1% TFA, B =ACN/0.1% TFA，流速:10 mL/分钟，柱: Phenomenex Luna5μ C18 (2) 250 x 21.20 mm，检测:UV 214 nm，产物保留时间:43-53分钟)纯化，得到52mg纯的肽1。

纯的产物用分析型HPLC (梯度:在10 分钟内 10-40% B，其中 A = H₂O/0.1 %TFA 和 B =ACN/0.1% TFA，流速: 0.3 mL/分钟，柱: Phenomenex Luna 3μ C18 (2) 50 x2 mm, 检测: UV 214 nm,产物保留时间: 6.54分钟)进行分析。进一步的产物表征采用电喷雾质谱法进行(MH₂ ²⁺计算值:1391.5，MH₂ ²⁺实测值:1392.5)。

实施例2: 化合物1的合成

将(Boc-氨基氧基)乙酸(Sigma-Aldrich；138 mg, 0.72 mmol)、EDC (138 mg,0.72mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(83 mg, 0.72 mmol)溶解在DMF (1 ml)中。将溶液振摇25min，然后加入到肽1 (1.0 g, 0.36 mmol)的DMF(5 ml)溶液中。将反应混合物搅拌2min。然后加入Sym.-可力丁(239 μL，1.80 mmol)，并将反应混合物搅拌3小时。用水(5 ml)稀释反应混合物，产物用制备型RP-HPLC纯化。

HPLC 条件: Waters Prep 4000 系统，溶剂 A = H₂O/0.1% TFA 和溶剂 B= ACN/0.1%TFA；梯度：60 分钟内 20-40% B；流速=50 ml/min；柱: Phenomenex Luna 10 μm C18(2) 250 x 50mm；检测: uv 214 nm。

纯化的化合物1的收率为690 mg (65%)。实测m/z: 1478.4, 预测MH₂ ²⁺: 1478.1。

实施例3: 化合物3A的合成

步骤(a): N-(4-氟苯亚甲基)氨基氧基乙酸的制备

将(Boc-氨基氧基)乙酸(96 mg, 0.50 mmol)和4-氟苯甲醛(53 μL, 0.50 mmol)溶解在甲酸(0.5 ml)中，反应混合物搅拌135 min。然后用20% ACN/水/0.1% TFA (7 ml)稀释反应混合物，产物用半制备型RP-HPLC纯化。

HPLC 条件：Beckman System Gold；溶剂 A = H₂O/0.1% TFA 和溶剂 B= ACN/0.1%TFA；梯度：40 分钟内 25-35% B；流速=10ml/min；柱: Phenomenex Luna 5 um C18(2) 250 x 21.2 mm；检测: uv 214 nm。

收率92 mg (93%)。

步骤(b): 化合物3A的制备

将N-(4-氟苯亚甲基)氨基氧基乙酸[来自步骤(a), 43 mg, 0.22 mmol]和PyBOP(112 mg, 0.22 mmol) 溶解在 DMF (2 ml)中。加入 DIPEA (157 μL, 0.90 mmol)的DMF(10 ml)溶液，并将混合物振摇1 min。然后将溶液加入到肽1 (500 mg, 0.18 mmol)的DMF(10 ml)溶液中，并将反应混合物振摇30 min。接着用水(20 ml)稀释反应混合物，产物用制备型HPLC纯化。

HPLC条件按照实施例2，除了：溶剂A = H₂O/0.1%乙酸铵和溶剂B = ACN。纯物质收率 291 mg (55%)。实测 m/z: 988.6，预测 MH₃ ³⁺: 987.7。

实施例4: 自化合物1合成化合物3B

步骤(a): 化合物1脱保护而产生化合物2

用水(10μL)和三氟乙酸(190μL)处理在5 ml反应小瓶中的化合物1 (7 mg, 2.37μM)，然后浸入密封小瓶中声波浴10分钟。接着真空除去含水的TFA (约30分钟)，残留物用柠檬酸盐缓冲液(pH 2.6, 1.7 mL)重配，并装载到位置14的自动合成仪盒(FastLab^TM，GEHealthcare Ltd)。

步骤(b) ¹⁸F-苯甲醛的合成和纯化

使用带有银靶的GEMS PETtrace回旋加速器，通过[¹⁸O](p,n) [¹⁸F]核反应，产生[¹⁸F]氟化物。使用1.5-3.5 ml的总靶体积。放射性氟化物捕获在Waters QMA柱(用碳酸盐预处理)上，并用Kryptofix_2.2.2. (4mg, 10.7μM)和碳酸钾(0.56mg, 4.1μM)的水(80 μL)和乙腈(320 μL)溶液洗脱氟化物。使用氮气驱使溶液离开QMA柱进入反应器皿。[¹⁸F]氟化物在稳定的氮气流和真空下于120℃干燥9分钟。将含苯甲醛三氟甲磺酸三甲铵(Trimethylammonium benzaldehyde triflate) [Haka等人, J.Lab.Comp.Radiopharm.,27, 823-833 (1989)] (3.3mg, 10.5μM)的二甲基亚砜(1.1mL)加入到干燥的[¹⁸F]氟化物中，并将混合物在105℃加热7分钟以产生4-[¹⁸F]氟苯甲醛。标记效率经衰变校正后为69±3%。

粗标记混合物接着用氢氧化铵溶液稀释，并装载到MCX+ SPE柱(用水预调节，作为FASTlab序列的一部分)。用水洗涤该柱并用氮气干燥，然后在乙醇(1 ml)中将4-[¹⁸F]氟苯甲醛洗脱回反应器皿中。约13% (衰变校正)的[¹⁸F]氟苯甲醛仍捕获在柱上。

步骤(c): 与氨基-氧基衍生物(化合物2)的醛缩合

将化合物2 (5mg, 1.8μmol)转移至FASTlab反应器皿中，然后洗脱的4-[¹⁸F]氟苯甲醛从MCX+柱返回。混合物接着在70℃加热17分钟。分析型HPLC证实化合物3B产物的RCP为63 ± 9%。

粗反应混合物用水(10 ml)稀释，并装载到制备型HPLC。10mM乙酸铵与乙腈系统获得粗反应混合物中3种可能放射性组分的完全分离，即[¹⁸F]氟化物(T_R =0.5分钟)、[¹⁸F]化合物3B (T_R =6分钟)和4-[¹⁸F]氟苯甲醛(T_R =9分钟)。自HPLC系统的放射性恢复良好，恢复率为97%。纯化产物通过在约6分钟保留时间时收集获得。

实施例5: HPLC分离ⁿF-标记的c-Met环肽与未标记的肽

根据实施例3制备化合物3A。

(i) 分析型HPLC条件

柱:XBridge Shield RP 18 (4,6x50) mm, 2.5 µm,

水性流动相A:10 mM NH₄Ac (缓冲液) pH约6.8；

有机流动相B:乙腈。

柱温:25℃。

流速:1.2 ml/min。

梯度:

分钟	0	1	16	19	22	22.1	26
								% B	20	20	40	100	100	20	20

(ii) 制备型HPLC条件

柱:XBridge Shield RP 18 (10x100) mm, 5 µm。

水性流动相A:10 mM NH₄Ac (缓冲液) pH约6.8；

有机流动相B:乙醇 (90%)流动相A (10%)。

柱温:25℃。流速:4 ml/min。

梯度:

分钟	0	1	16	20	25	26
							% B	15	15	40	100	100	15

(iii) 分析型和制备型HPLC结果

实施例6: ¹⁸F-标记的c-Met肽 (化合物3B)在荷瘤裸鼠中的生物分布

CD-1雄性裸鼠(约20g)在单独的通风笼中饲养，自由获取食物和水。HT-29细胞(ATCC, 目录号HTB-38)在添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的McCoy氏5a培养基(Sigma #M8403)中生长。在70-80%汇合时使用0.25%胰蛋白酶每周两次将细胞1:3分离并在5% CO₂中在37℃孵育。在轻气体麻醉(异氟烷)下使用细孔针(25 G)在一个位点(颈背部)，将标称剂量10⁶个细胞(每次注射)/ 100 μl体积)的HT-29细胞悬液皮下注射给小鼠。然后让肿瘤发展20天，或直至体积至少200mm³ (用于包括在研究中)。20天的生长时间后，通过尾静脉作为静脉推注将化合物3B (0.1 ml, 1-5 MBq/动物)注射给动物。在注射后的不同时间对动物实施安乐死，解剖，随后取出下列器官和组织。

2分钟时肿瘤摄取为2.3 %id/g，30分钟达到峰值(3.8 %id/g)，然后随时间推移在注射后120分钟时减少至1.9 %id/g。肿瘤内的整体保留为83%。存在相当快速的随时间推移的血液清除(初始2分钟血液为9.2 %id/g，注射后120分钟减少至0.81 %id/g)。关键背景组织(例如肺和肝)遵循随时间推移的血液清除概况，注射后120分钟时摄取为1.1%id/g (肝)和 1.56 %id/g (肺)。

实施例7: 化合物3B在荷瘤裸鼠中的受体阻断研究

重复实施例6的研究，共注射100和1000倍过量的非放射性类似物化合物3A (每只动物~1.5 μg和15 μg过量)，注射后120分钟解剖动物。本研究的所有动物具有相似的体重(25-30 g范围)。数据证实对于1000倍过量的未标记肽，获得化合物3B肿瘤摄取的统计学显著减少(P<0.01) (HT-29肿瘤摄取从1.9降至1.1 %id/g；40%的减少)。

实施例8: 化合物3B的灵长类PET成像

通过PET测量了三只雌性食蟹猴中化合物3B的生物分布。各情况进行两次示踪剂注射：

(a) 单用示踪剂(化合物3B) 3 MBq/kg (基线研究)；

(b)基线注射后4小时，示踪剂 9 MBq/kg与0.15 mg/kg化合物3A (阻断研究)共注射。

以1-3 ml的推注剂量注射示踪剂，随后注射1 ml盐水。

在给予后210分钟内按照时间间隔抽取血液样品(0.2 ml)，用于放射性测定。在动力学研究中，目标区域从骨、心、肾、肺、肝和肌肉中取出。在全身研究中，目标区域从骨、脑、结肠、心、肾、肺、肝、肌肉、胰、小肠、脾和膀胱取出。生成时间-活性数据，表示为标准摄取值(SUV)。

使用冷冻切片自动射线影像术，在猕猴肝脏体外观察到特异性结合(~40%)。猕猴肌肉未见有任何特异性结合。食蟹猴的体内研究显示肝中的快速摄取，其在共注射0.15mg/kg化合物3A之后减少>40%。在体内未见肌肉的特异性结合。

实施例9: 化合物3B的自动合成，使用SPE 纯化

使用FastLab^TM (GE Healthcare Ltd)自动合成仪装置进行实施例4的合成。将盒配置为具有试剂、注射器和SPE柱。

QMA (甲基季铵水(quaternary methyl ammonium water)处理)、MCX+ (混合阳离子交换)和C2 (低疏水性) SPE柱均得自Waters。

在FASTlab序列期间，柱(串联)用乙醇调节。即将使用前，柱用稀(0.2%)磷酸装填(prime)。粗反应混合物用1%磷酸稀释，并装载到SPE。SPE用水洗涤，然后用6ml水(80%乙醇)洗脱产物，用分析型HPLC分析放射化学纯度(RCP)。

根据18F-氟化物的开始用量，结果如下：

起始活性(MBq)	结束时的合成收率 (%)	RCP
			493	21	>99 %
750	25	>99 %
			1,000	26	>99 %
49,000	19	94 %
			61,000	18	98 %
67,400	21	96 %

实施例10: 人类研究

在先前诊断为罹患头颈部鳞状细胞癌的6个人类患者中研究了用化合物3B来成像。所述试剂是良好耐受的(无不良反应)。6个患者中有5个具有示踪剂的中/高摄取，1个患者具有低摄取(类似于对侧)。这与文献报道的80%这类患者过量表达c-Met是一致的。

序列表

<110> 通用电气健康护理有限公司

<120> 选择患者的方法

<130> PZ11108 WO

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 二硫键

<222> (1)..(13)

<220>

<221> 变体

<222> (2)..(2)

<223> N, H或Y

<220>

<221> 二硫键

<222> (3)..(11)

<220>

<221> 变体

<222> (4)..(4)

<223> G, S, T或N

<220>

<221> 变体

<222> (8)..(8)

<223> T或R

<220>

<221> 变体

<222> (15)..(15)

<223> A, D, E, G或S

<220>

<221> 变体

<222> (16)..(16)

<223> S或T

<220>

<221> 变体

<222> (17)..(17)

<223> D或E

<400> 1

Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys Tyr Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 二硫键

<222> (2)..(14)

<220>

<221> 变体

<222> (3)..(3)

<223> N, H或Y

<220>

<221> 二硫键

<222> (4)..(12)

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> G, S, T或N

<220>

<221> 变体

<222> (9)..(9)

<223> T或R

<220>

<221> 变体

<222> (16)..(16)

<223> A, D, E, G或S

<220>

<221> 变体

<222> (17)..(17)

<223> S或T

<220>

<221> 变体

<222> (18)..(18)

<223> D或E

<400> 2

Ser Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys Tyr Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa

<210> 3

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 二硫键

<222> (4)..(16)

<220>

<221> 变体

<222> (5)..(5)

<223> N, H或Y

<220>

<221> 二硫键

<222> (6)..(14)

<220>

<221> 变体

<222> (7)..(7)

<223> G, S, T或N

<220>

<221> 变体

<222> (11)..(11)

<223> T或R

<220>

<221> 变体

<222> (18)..(18)

<223> A, D, E, G或S

<220>

<221> 变体

<222> (19)..(19)

<223> S或T

<220>

<221> 变体

<222> (20)..(20)

<223> D或E

<400> 3

Ala Gly Ser Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys

1 5 10 15

Tyr Xaa Xaa Xaa Gly Thr

20

<210> 4

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 4

Gly Gly Gly Lys

1

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

Gly Ser Gly Lys

1

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<400> 6

Gly Ser Gly Ser Lys

1 5

<210> 7

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> 二硫键

<222> (4)..(16)

<220>

<221> 二硫键

<222> (6)..(14)

<400> 7

Ala Gly Ser Cys Tyr Cys Ser Gly Pro Pro Arg Phe Glu Cys Trp Cys

1 5 10 15

Tyr Glu Thr Glu Gly Thr Gly Gly Gly Lys

20 25

Claims

1.¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽在制备成像剂中的用途，所述成像剂用于帮助判定先前诊断为罹患癌症的个体患者是否对用抗Met疗法的治疗敏感，包括：

(i) 提供包含¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽的成像剂；

其中所述c-Met结合环肽具有下式：

其中肽1是Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH₂，在Cys4-16和Cys6-14处具有二硫桥，

n=18；并且所述c-Met结合环肽在肽1的羧基端Lys的ε胺基处官能化，

其中所述癌症是非小细胞肺癌、结肠直肠癌、胃癌、胰腺癌、头颈部癌、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、胶质瘤或肉瘤。

2.权利要求1的用途，其中所述癌症是非小细胞肺癌、结肠直肠癌或胃癌。

3.¹⁸F-放射性标记的c-Met结合环肽在制备成像剂中的用途，所述成像剂用于治疗先前诊断为罹患癌症的个体患者，包括：

(i) 进行权利要求1-2中任一项的判定方法；

4.权利要求3的用途，其中所述抗Met疗法包括：

(a)非蛋白性的c-Met抑制剂；

(b)抗Met抗体或其片段；

(c)间接影响c-Met信号转导途径的药物；

或其组合。

5.权利要求3或4的用途，其中将所述抗Met疗法作为与另外治疗的组合疗法的部分来递送，其中所述另外治疗选自：

(i) EGFR抑制剂；

(ii) 酪氨酸激酶抑制剂；

(iii) VEGF抑制剂；

(iv) 标准癌症化学疗法；

(v) β-连环蛋白抑制剂。

6.权利要求3的用途，其中所述判定方法包括在开始所述疗法之后在一个或多个时间间隔分别进行权利要求1-2中任一项的步骤(ii)和(iii)的成像和判定。

7.权利要求6的用途，其中所述抗Met疗法如权利要求4或5中所定义。