KR20140012112A

KR20140012112A - 테크네튬 표지화 펩티드

Info

Publication number: KR20140012112A
Application number: KR1020137025744A
Authority: KR
Inventors: 피터 브라이언 이베슨; 바드 인드레볼; 벤 뉴튼; 라지브 발라; 에드빈 빌헬름 요한슨
Original assignee: 지이 헬쓰케어 리미티드
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2012-03-02
Publication date: 2014-01-29
Also published as: JP2014506910A; CN103547291A; CA2828655A1; CN103547291B; US9259496B2; US20140004041A1; WO2012119937A1; ES2651334T3; EP2680888A1; AU2012224728A1; GB201103696D0; JP5961191B2; EP2680888B1; BR112013022020A2

Abstract

본 발명은 생체내 SPECT 또는 PET 영상화에 적합한 방사성표지화 c-Met 결합 펩티드를 포함하는 테크네튬 영상화제에 관한 것이다. c-Met 결합 펩티드는 킬레이터 접합체를 통해 표지화된다. 또한, 제약 조성물, 제제 및 조성물의 제조 방법, 및 특히 암 진단에 사용하기 위한 조성물을 사용한 생체내 영상화 방법이 개시되어 있다.

Description

테크네튬 표지화 펩티드{TECHNETIUM LABELLED PEPTIDES}

간세포 성장 인자(HGF)(또한, 산란 인자(SF)로서 공지됨)는 다양한 생리학적 과정, 예컨대 상처 치유 및 혈관신생에 관여하는 성장인자이다. HGF와 그의 수용체(c-Met) 상호작용의 고 친화력 상호작용이 종양 성장, 침습 및 전이에 연루되어 있다.

크누드슨(Knudsen) 등은 영상화 및 치료에 미칠 수 있는 영향과 함께 전립선 암에서의 HGF 및 c-Met의 역할을 검토하였다(문헌 [Adv.Cancer Res., 91, 31-67 (2004)]). 진단 및 치료를 위한 표지화 항-met 항체가 WO 03/057155에 기재되어 있다.

c-Met은 상피 기원의 많은 인간 암에서 종양 성장, 침습 및 전이에 관여하는 것으로 밝혀졌다. c-Met은 대부분의 암종에 의해 발현되고, 정상 조직에 비해 그의 상승된 발현이 폐, 유방, 직결장, 췌장, 두경부, 위, 간세포, 난소, 신장, 신경교종, 흑색종 및 다수의 육종을 비롯한, 수많은 암에서 검출되었다. 직결장 암종(CRC)에서, c-Met의 과다발현이 질병의 초기 종양전 병변인 이형성 이상선와에서 검출되었다. 두경부 편평세포 암에서는, c-Met은 대략 80%의 원발성 종양에서 발현되거나 과발현되는 것으로 보고되었다. 뼈로의 전립선암 전이에서, c-Met은 뼈 전이의 80%를 초과하여 과다발현되는 것으로 보고되었다.

정상 상태 하에서는, c-Met은 상피 세포에서 발현되고, 중간엽 유래 HGF에 의하여 주변분비(paracrine) 방식으로 활성화된다. 정상 세포에서 c-Met의 활성화는 일시적인 현상이고, 엄격히 조절된다. 그러나, 종양 세포에서는, c-Met은 구성적으로 활성일 수 있다. 암에서는, c-Met 증폭/과다발현, c-Met 돌연변이의 활성화(예, 구조적 변경) 및 자가분비(autocrine) 신호 루프의 발생을 통한 자율 성장 조절의 획득을 통해 이상 c-Met 자극이 달성될 수 있다. 추가로, c-Met 수용체의 결함적 하향-조절도 세포 막에서 이상 c-Met 발현에 기여할 것이다. c-Met의 과다발현은 HGF 의존적인 반면(자가분비/주변분비), 돌연변이에 의해 유발된 구조적 변경은 HGF 비의존적이다(예, 세포외 도메인의 손실).

WO 2004/078778은 c-Met 또는 c-Met와 HGF를 포함하는 복합체와 결합하는 폴리펩티드 또는 다량체 펩티드 구조체를 개시하고 있다. 대략, 10개의 상이한 펩티드 구조적 부류가 기재되어 있다. WO 2004/078778은, 펩티드가 시험관내 및 생체내 응용을 위해 검출가능한 표지로 표지화되거나 또는 치료학적 응용을 위해 약물로 표지화될 수 있다는 것을 개시한다. 검출가능한 표지는 효소, 형광 화합물, 광학 염료, 상자성 금속 이온, 초음파 조영제 또는 방사성핵종일 수 있다. WO 2004/078778의 바람직한 표지가 방사성 또는 상자성으로 진술되어 있으며, 가장 바람직한 것은 금속 킬레이터에 의해 킬레이트화된 금속을 포함한다. WO 2004/078778은, 이 문헌에서의 방사성핵종이 ¹⁸F, ¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹²³I, ⁷⁷Br, ⁷⁶Br, ⁹⁹ ^mTc, ⁵¹Cr, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁴⁷Sc, ¹⁶⁷Tm, ¹⁴¹Ce, ¹¹¹In, ¹⁶⁸Yb, ¹⁷⁵Yb, ¹⁴⁰La, ⁹⁰Y, ⁸⁸Y, ¹⁵³Sm, ¹⁶⁶Ho, ¹⁶⁵Dy, ¹⁶⁶Dy, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁹⁷Ru, ¹⁰³Ru, ¹⁸⁶Re, ²⁰³Pb, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ² ^l3Bi, ^2l4Bi, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁹Pd, ¹¹⁷ ^mSn, ¹⁴⁹Pm, ¹⁶¹Tb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁹⁸Au 및 ¹⁹⁹Au로부터 선택될 수 있다고 진술한다. WO 2004/078778은 진단 목적에 바람직한 방사성핵종이 ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁹⁹ ^mTc 및 ¹¹¹In이며, ⁹⁹ ^mTc가 특히 바람직하다는 것을 진술한다(62페이지).

WO 2004/078778은, 실시예 14 내지 17에서 c-Met 결합 펩티드의 혈청 체류 시간을 증가시키는 방법이 비공유결합으로 인간 혈청 알부민에 대해 결합하는 모이어티와의 접합, PEG와의 접합, 혈청 단백질과의 융합 및 말레이미드와의 접합임을 교시한다.

WO 2009/016180은 하기 화학식 I의 접합체를 포함하는 영상화제를 개시한다.

<화학식 I>

상기 식에서,

Z¹은 cMBP의 N-말단에 부착되고, H 또는 M^IG이고;

Z²는 cMBP의 C-말단에 부착되고, OH, OB^c, 또는 M^IG이고, B^c는 생체적합성 양이온이고;

cMBP는 하기 아미노산 서열(SEQ-1)을 포함하는 17 내지 30개의 아미노산의 cMet 결합 시클릭 펩티드이고:

Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶;

(상기 식에서, X¹은 Asn, His 또는 Tyr이고;

X²는 Gly, Ser, Thr 또는 Asn이고;

X³은 Thr 또는 Arg이고;

X⁴는 Ala, Asp, Glu, Gly 또는 Ser이고;

X⁵는 Ser 또는 Thr이고;

X⁶은 Asp 또는 Glu이고;

Cys^a ^-d는 각각 잔기 a와 b 뿐만 아니라 c와 d가 고리화하여 2개의 별개의 디술피드 결합이 형성되도록 하는 시스테인 잔기이고);

M^IG은 물질대사 억제기이고;

L은 합성 링커기이고;

Bzp^M은 벤조피릴륨 염료이다.

WO 2008/139207은 WO 2009/016180과 유사한 cMet 결합 시클릭 펩티드를 개시하고, 이 경우에서는 특정 부류의 시아닌 염료로 표지화된다.

WO 2009/016180 및 WO 2008/139207의 광학 영상화제는 생체내 c-Met 과다발현 또는 국소화 부위의 영상을 수득하기 위한 광학 영상화, 특히 결장암의 영상화에 유용하다고 진술되어 있다.

본 발명은 생체내 양전자 방출 단층촬영(PET) 또는 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT) 영상화에 적합한 방사능 테크네튬(⁹⁹ ^mTc 또는 ⁹⁴ ^mTc) 표지화 c-Met 결합 펩티드를 포함하는 영상화제 조성물에 관한 것이다. c-Met 결합 펩티드는 펩티드와 디아민디옥심 리간드의 킬레이터 접합체를 통해 표지화된다. 온화한 실온 조건 하에서 접합체를 테크네튬으로 방사성표지화 하여 높은 수율 및 방사화학 순도로 원하는 방사성금속 복합체를 수득한다. ⁹⁹ ^mTc 영상화제는 시판되는 ⁹⁹ ^mTc 생성기로부터 [^99mTc]-과테크니튬산으로 재구성된 멸균성 비-방사능 키트로부터 쉽게 제조될 수 있다.

영상화제는 생체내에서 양호하고 목표-특이적인 종양 흡수를 나타낸다. 영상화제는 또한 임상전 모델에서 내약성이 강한 것으로도 보인다.

제1 측면에서, 본 발명은 c-Met 결합 펩티드의 킬레이터 접합체의 방사능 ^xTc 복합체를 포함하고, 상기 킬레이터 접합체가 하기 화학식 I인 영상화제를 제공한다.

<화학식 I>

Z¹-[cMBP]-Z²

[상기 식에서,

^xTc는 방사성동위원소 ⁹⁴ ^mTc 또는 ⁹⁹ ^mTc이고;

cMBP는 하기 화학식 II의 18량체 내지 30량체 c-Met 결합 시클릭 펩티드이고:

<화학식 II>

-(A)_x-Q-(A')_y-

{상기 식에서, Q는 하기 아미노산 서열(SEQ-1)이고:

-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶-

(상기 식에서, X¹은 Asn, His 또는 Tyr이고;

X²는 Gly, Ser, Thr 또는 Asn이고;

X³은 Thr 또는 Arg이고;

X⁴는 Ala, Asp, Glu, Gly 또는 Ser이고;

X⁵는 Ser 또는 Thr이고;

X⁶은 Asp 또는 Glu이고;

Cys^a ^-d는 각각 잔기 a와 b 뿐만 아니라 c와 d가 고리화하여 2개의 별개의 디술피드 결합이 형성되도록 하는 시스테인 잔기이다);

A 및 A'는 독립적으로 Cys 이외의 임의의 아미노산이거나, 또는 A 및 A' 중 하나는 Lys(ε-Z³)이고;

x 및 y는 독립적으로 0 내지 13의 정수이고, [x + y] = 1 내지 13이 되도록 선택된다};

Z¹은 cMBP의 N-말단에 부착되고, M^IG 또는 Z³이고;

Z²는 cMBP의 C-말단에 부착되고, M^IG 또는 Z³이되:

{여기에서, 각각의 M^IG은 독립적으로 cMBP 펩티드의 생체내 물질대사를 억제하거나 저지하는 생체적합성 기인 물질대사 억제기이고;

Z³은 하기 화학식 III의 킬레이터이고:

<화학식 III>

(상기 식에서, E¹ 내지 E⁶은 각각 독립적으로 R' 기이고;

각각의 R'은 독립적으로 H 또는 C₁ _-4 알킬, C₃ _-7 알킬아릴, C₂ _-7 알콕시알킬, C_1-4 히드록시알킬, C₁ _-4 플루오로알킬, C₂ _-7 카르복시알킬 또는 C₁ _-4 아미노알킬이거나, 또는 2개 이상의 R' 기는 이들이 부착된 원자와 함께 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 고리를 형성하고;

L은 화학식 -(A)_m-의 합성 링커기이고, 각각의 A는 독립적으로 -CR₂-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR₂-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂-, C₄ _-8 시클로헤테로알킬렌 기, C_4-8 시클로알킬렌 기, C₅ _-12 아릴렌 기, 또는 C₃ _-12 헤테로아릴렌 기, 또는 단분산성 폴리에틸렌글리콜(PEG) 빌딩 블록이고;

각각의 R은 독립적으로 H, C₁ _-4 알킬, C₂ _-4 알케닐, C₂ _-4 알키닐, C₁ _-4 알콕시알킬 또는 C₁ _-4 히드록시알킬로부터 선택되고;

m은 1 내지 10의 정수이다)};

단 화학식 I의 접합체는 하나의 Z³ 기를 포함하고, 상기 Z³ 기는 ^xTc와 금속 복합체를 형성한다]

용어 "영상화제"란 포유동물 신체의 영상화에 적합한 화합물을 의미한다. 바람직하게, 포유동물은 생체내 온전한 포유동물 신체이고, 보다 바람직하게는 인간 대상체이다. 영상화제는 일반적으로 비-약리학적 양으로, 즉 포유동물 대상체에게 최소의 생물학적 영향을 주도록 설계된 투여량으로 투여된다. 바람직하게는, 영상화제는 최소의 침습 방식으로, 즉 전문적인 의료적 판단 하에서 수행될 때, 포유동물 대상체에게 실질적인 건강상의 위험없이 포유동물 신체에 투여될 수 있다. 이러한 최소의 침습 투여는 바람직하게는 국소 또는 전신 마취의 필요없이 상기 대상체의 말초 정맥으로의 정맥내 투여이다.

본원에서 사용되는 용어 "생체내 영상화"란 포유동물 대상체의 내부 측면 모두 또는 그 일부의 영상을 비-침습적으로 생성하는 기술을 지칭한다.

용어 "킬레이터 접합체"란 cMBP 펩티드에 공유결합으로 결합된 킬레이터를 의미한다.

용어 "c-Met 결합 시클릭 펩티드"란 c-Met(또는 단순히 MET)라고도 알려진 간세포 생장 인자 수용체에 결합하는 펩티드를 의미한다. 본 발명의 적합한 이러한 펩티드에는 화학식 I의 18 내지 30개의 아미노산의 시클릭 펩티드가 있다. 이러한 펩티드는 약 20 nM 미만의 c-Met에 대한 겉보기 K_d를 갖는다. 상기 펩티드의 cMBP 서열은 프롤린 잔기를 포함하며, 상기 잔기는 주쇄 아미드 결합의 시스/트랜스 이성질체화를 나타낼 수 있다고 알려져 있다. 본 발명의 cMBP 펩티드는 임의의 상기와 같은 이성질체를 포함한다. 본 발명의 cMBP는 적합하게는 단량체로서 사용되고, 즉 cMBP의 이량체 및/또는 헤테로이량체는 본 발명의 범주가 아니다.

Z¹ 기는 cMBP의 최종 아미노산 잔기의 아민 기, 즉 아미노- 또는 N-말단을 치환한다. Z² 기는 cMBP의 최종 아미노산 잔기의 카르보닐 기, 즉 카르복시 또는 C-말단을 치환한다.

용어 "물질대사 억제기" (M^IG)란 아미노 말단(Z¹) 또는 카르복시 말단(Z²)에서 cMBP 펩티드의 생체내 물질대사를 억제하거나 저지하는 생체적합성 기를 의미한다. 본 발명의 영상화제의 경우, M^IG은 Z³ 기, 즉 화학식 III의 킬레이터를 포함한다. 상기의 경우에서, 테크네튬 복합체는 cMBP N- 또는 C-말단에(각각 Z¹ 또는 Z²로서) 공유결합으로 부착되고, 테크네튬 복합체는 cMBP의 물질대사를 차단하는 작용을 한다. 다른 상기와 같은 M^IG 기가 당업자에게 널리 알려져 있으며, 펩티드 아민 말단의 경우 적합하게는 N-아실화 기 -NH(C=O)R^G로부터 선택되고, 여기서 아실 기 -(C=O)R^G는 C₁ _-6 알킬, 또는 C₃ _-10 아릴 기로부터 선택된 R^G를 가지거나, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 빌딩 블록을 포함한다. 바람직한 상기와 같은 PEG 기에는 하기 화학식 IA 또는 IB의 생체개질제가 있다.

<화학식 IA>

화학식 IA의 17-아미노-5-옥소-6-아자-3,9,12,15-테트라옥사헵타데칸산

상기 식에서, p는 1 내지 10의 정수이다. 별법으로는, 하기 화학식 IB의 프로피온산 유도체를 기재로 한 PEG-유사 구조를 사용할 수 있다.

<화학식 IB>

상기 식에서, p는 화학식 IA에 대해 정의된 바와 같고, q는 3 내지 15의 정수이다. 화학식 IB에서, p는 바람직하게는 1 또는 2이고, q는 바람직하게는 5 내지 12이다.

바람직한 상기와 같은 아미노 말단 M^IG 기는 아세틸, 벤질옥시카르보닐 또는 트리플루오로아세틸이고, 가장 바람직하게는 아세틸이다.

용어 "아미노산"이란 L- 또는 D- 아미노산, 아미노산 유사체(예, 나프틸알라닌), 또는 자연 발생적 또는 순수한 합성 기원일 수도 있는 아미노산 모방체를 의미하고, 광학적으로 순수, 즉 단일 거울상이성질체일 수 있고, 키랄 또는 거울상이성질체의 혼합물일 수도 있다. 본원에서는 아미노산에 대한 통상의 3문자 또는 1문자 약어가 사용된다. 바람직하게, 본 발명의 아미노산은 광학적으로 순수하다. 용어 "아미노산 모방체"는 동배체, 즉 천연 화합물의 입체 및 전자 구조를 모방하도록 설계된 자연발생적 아미노산의 합성 유사체를 의미한다. 상기 동배체 아미노산은 펩티드 내에 사용되는 것으로 알려져 있고, 데프시펩티드, 레트로-인버소(retro-inverso) 펩티드, 티오아미드, 시클로알칸 또는 1,5-이치환된 테트라졸이 포함되나 이에 제한되지 않는다(문헌 [M. Goodman, Biopolymers, 24, 137, (1985)] 참조).

용어 "펩티드"란 상기 정의된 바와 같이 펩티드 결합(즉, 하나의 아미노산의 아민을 다른 아미노산의 카르복실에 연결시키는 아미드 결합)에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 화합물을 의미한다.

A 및 A'가 "Cys 이외의 임의의 아미노산"인 경우, 이는 A 및 A' 기의 추가의 아미노산에 자유 티올 기, 특히 Cys 잔기가 없다는 것을 의미한다. 이는 추가의 Cys 잔기가 Q 서열의 Cys^a-Cys^b 및 Cys^c-Cys^d 디술피드 다리결합과 혼동될 위험이 있는 디술피드 다리결합이고, 그 결과 c-Met 결합 친화력이 손실되기 때문이다.

화학식 I에서, Z³ 기(즉, 화학식 III의 킬레이터)는 적합하게는 하기 위치 (i) 내지 (iii) 중 어느 하나에 부착된다:

(i) Z¹ 기로서 cMBP의 아미노 말단. 상기 접합은 화학식 III의 카르복시-관능화 킬레이터를 사용할 수 있다;

(ii) Z² 기로서 cMBP의 카르복시 말단. C-말단에서의 직접적인 상기와 같은 부착은 화학식 III의 아민-관능화 킬레이터를 사용하여 달성될 수 있다. 상기 접합의 경우, 따라서 킬레이터 접합을 가능하게 하는 추가의 Lys 잔기는 불필요하다. 또한, 부착된 테크네튬 복합체는 M^IG 기로서 작용할 수 있다;

(iii) A 또는 A' 기에 위치한 Lys 잔기의 Lys (엡실론) 아민 측쇄로의 부착.

x가 94m인 경우, 테크네튬 방사성동위원소는 ⁹⁴ ^mTc이고, 이는 특히 생체내 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화에 적합하다. x가 99m인 경우, 테크네튬 방사성동위원소는 ⁹⁹ ^mTc이고, 이는 특히 생체내 단일 광자 방출 단층촬영(SPECT) 영상화에 적합하다. 바람직하게는, ^xTc는 ⁹⁹ ^mTc이다.

용어 "킬레이터의 방사능 ^xTc 복합체"란 킬레이트화제의 방사성금속 복합체를 의미한다. 용어 "방사성금속 복합체"란 화학식 III의 킬레이터에 의한 방사성금속의 배위 금속 복합체를 의미하고, 상기 킬레이터는 화학식 I의 링커기(L)를 통해 cMBP 펩티드에 공유결합으로 결합된다. 용어 "킬레이터" 또는 "킬레이트화제"란 그의 통상적인 의미를 가지며, 금속이 배위되는 경우, 킬레이트 고리를 생성하도록 배열된 2개 이상의 금속 공여체 원자를 지칭한다. 화학식 III의 킬레이터는 디아민디옥심 공여체 세트를 갖는다. 따라서, 본 발명의 ^xTc 복합체는 하기 화학식 IV일 것으로 여겨진다.

<화학식 IV>

상기 식에서, E¹ 내지 E⁶ 및 L은 화학식 III에 대해 정의된 바와 같다.

용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는 본 출원의 전반에 걸쳐 그의 통상적인 의미를 가지며, 이는 열거된 구성성분들이 존재해야 하지만, 다른 언급되지 않은 화합물들 또는 종들도 추가로 존재할 수 있다는 것을 암시한다. 상기 용어 "포함하는"은 바람직한 서브세트로서, 조성물이 다른 화합물 또는 종이 존재하지 않는 상태에서 열거된 구성성분을 갖는다는 것을 의미하는 "~으로 본질적으로 이루어진"이라는 것을 포함한다.

바람직한 특성.

본 발명의 바람직한 cMBP 펩티드는, c-Met/HGF 복합체에 대한 c-Met의 결합에 대해 K_d가 약 10 nM 미만이고(형광 편광 분석 측정 기준), 가장 바람직하게는 1 내지 5 nM의 범위이고, 3 nM 미만이 이상적이다.

제1 측면의 영상화제는 바람직하게는 포유동물 투여에 적합한 형태로 제공된다. "포유동물 투여에 적합한 형태로"라는 어구는, 조성물이 멸균성이고, 발열원 무함유이며, 독성이거나 유해한 효과를 초래하는 화합물은 포함하지 않으며, 생체적합한 pH(대략 pH 6.5 내지 8.5) 및 생리학적으로 상용가능한 삼투질 농도에서 제제화된다는 것을 의미한다. 상기 조성물은 생체내에서 색전증을 유발할 수 있는 위험 요소가 될 수 있는 미립자를 포함하지 않으며, 생물학적 유체(예컨대, 혈액)와의 접촉시 침전이 일어나지 않도록 제제화된다. 상기 조성물은 또한 생물학적으로 상용가능한 부형제만을 함유하고, 바람직하게는 등장성을 띤다. 바람직한 상기 형태에는 제4 측면의 방사성 의약품 조성물이 있다(하기 참조).

본 발명의 영상화제는 적합하게는 M^IG 기에 의해 보호된 양쪽 cMBP 펩티드 말단을 가지며, 이들은 보통 상이하다. 양쪽 펩티드 말단을 이러한 방식으로 보호하는 것은, 그렇지 않으면 빠른 펩티드 물질대사가 예상되고 그 결과 c-Met에 대한 선택적인 결합 친화력이 손실되기 때문에, 생체내 영상화 응용을 위해 중요하다. Z¹ 및 Z² 둘 다가 M^IG일 때, 바람직하게는 Z¹이 아세틸이고 Z²가 1차 아미드이다. 가장 바람직하게는, Z¹이 아세틸이고, Z²가 1차 아미드이고, ^xTc 모이어티가 cMBP의 라이신 잔기의 엡실론 아민 측쇄에 부착된다.

Q는 바람직하게는 하기 아미노산 서열 SEQ-2 또는 SEQ-3을 포함한다:

Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶

(SEQ-2);

Ala-Gly-Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-

X⁴-X⁵-X⁶-Gly-Thr (SEQ-3).

서열 SEQ-1, SEQ-2 및 SEQ-3에서, X³은 바람직하게는 Arg이다. 제1 측면의 cMBP 펩티드는 바람직하게는 하기 아미노산 서열(SEQ-7)을 갖는다:

Ala-Gly-Ser-Cys^a-Tyr-Cys^c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.

화학식 I의 영상화제는, 바람직하게는 A 및 A' 중 하나가 Lys(ε-Z³)이고 cMBP가 단지 하나의 상기 Lys 잔기를 포함하도록 선택된다. 보다 바람직하게는, 단일 Lys(ε-Z³) 모이어티가 카르복시 말단에 위치하여 cMBP는 하기 화학식 IIA가 된다:

<화학식 IIA>

-(A)_x-Q-(A')_z-Lys(ε-Z³)-

상기 식에서,

z는 0 내지 12의 정수이고, [x + z] = 0 내지 12이다.

화학식 I 및 화학식 II에서, -(A)_x- 또는 -(A')_y- 기는 바람직하게는 하기:

-Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4),

-Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5) 또는

-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6),

로부터 선택된 링커 펩티드를 포함하고, Z³ 기는 상기 링커 펩티드의 Lys 잔기의 엡실론 아민 기에 부착된다.

화학식 III의 킬레이터는 바람직하게는 C-말단(Z² 기)에서 부착되거나, 또는 Lys(ε-Z³) 모이어티로서 부착된다. 보다 바람직하게는, 화학식 III의 킬레이터는 Lys(ε-Z³) 모이어티로서 부착되고, 가장 바람직한 것은 Lys(ε-Z³) 모이어티가 상기 화학식 IIA의 경우에 대해 카르복시 말단에 위치할 때이다.

화학식 I의 영상화제에서, 킬레이터는 바람직하게는 하기 화학식 IIIA이다.

<화학식 IIIA>

상기 식에서, q는 1 내지 6의 정수이고, A는 화학식 III에 대해 정의된 바와 같다.

화학식 IIIA에서, (A)_q는 바람직하게는 -(NH)(A)_t-이고, t는 0 내지 5의 정수이다.

제1 측면의 영상화제는 제3 측면(하기)에서 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

제2 측면에서, 본 발명은 제1 측면에서 정의된 바와 같은, 화학식 I의 킬레이터 접합체를 제공한다. 제2 측면에서의 화학식 II의 cMBP 펩티드 및 화학식 III의 킬레이터의 바람직한 측면은 제1 측면(상기)에서 기재한 바와 같다.

제2 측면의 킬레이터 접합체는 2관능성 킬레이트 공정방법에 의해 수득될 수 있다. 용어 "2관능성 킬레이트"는 그의 통상의 의미를 가지며, 이에 공유결합으로 부착된 측쇄 관능기를 갖는 킬레이트화제를 지칭한다. 상기 관능기는 cMBP 펩티드에 킬레이터를 부착하기 위한 반응성 부위로서 사용된다. 2관능성 킬레이트 공정방법 및 관련 합성법은 바르톨로마(Bartholoma) 등의 문헌 [Chem.Rev., 110(5), 2903-2920 (2010)]; 차크라보티(Chakraborty) 등의 문헌 [Curr.Top.Med.Chem., 10(11), 1113-1134 (2010)] 및 브레흐비엘(Brechbiel) 등의 문헌 [Quart.J.Nucl.Med.Mol.Imaging, 52(2), 166-173 (2008)]에 의해 기재되어 있다. 본 발명의 관능기는 바람직하게는 아민, 카르복실산 또는 활성화된 에스테르이고, 보다 바람직하게는 1차 아민 또는 활성화된 에스테르이다. 측쇄 아민 관능기를 갖는 2관능성 킬레이터는 펩티드의 카르복실 기에 접합될 수 있다. 카르복실 또는 활성화된 에스테르 관능기를 갖는 2관능성 킬레이터는 펩티드의 아민 기에 접합될 수 있다.

용어 "활성화된 에스테르" 또는 "활성 에스테르"란, 더 양호한 이탈기가 되도록 설계된 카르복실산 관련 에스테르 유도체를 의미하고, 따라서 아민과 같은 친핵체와 보다 용이하게 반응할 수 있다. 적합한 활성 에스테르의 예에는 N-히드록시숙신이미드(NHS); 술포-숙신이미딜 에스테르; 펜타플루오로페놀; 펜타플루오로티오페놀; 파라-니트로페놀; 히드록시벤조트리아졸 및 PyBOP(즉, 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트)가 있다. 바람직한 활성 에스테르는 N-히드록시숙신이미드 또는 펜타플루오로페놀 에스테르이며, 특히 N-히드록시숙신이미드 에스테르이다.

본 발명의 화학식 cMBP의 c-Met 결합 펩티드는

(i) 원하는 cMBP 펩티드와 동일한 펩티드 서열을 갖고 Cys^a 및 Cys^b가 비보호되며 Cys^c 및 Cys^d 잔기가 티올-보호기를 갖는 선형 펩티드를 고체상 펩티드 합성하고;

(ii) 용액 중에서 수성 염기로 단계 (i)로부터의 펩티드를 처리하여, Cys^a와 Cys^b를 연결한 제1 디술피드 결합을 가진 모노시클릭 펩티드를 제공하고;

(iii) Cys^c 및 Cys^d 티올-보호기를 제거하고, 고리화하여 Cys^c와 Cys^d를 연결한 제2 디술피드 결합을 제공하고, 이것이 원하는 비시클릭 펩티드 생성물 Z¹-[cMBP]-Z²인 것

을 포함하는 제조 방법에 의해 수득될 수 있다.

용어 "보호기"란 바람직하지 않은 화학 반응을 억제하거나 저지하지만, 분자의 나머지 부분은 변형시키지 않는 충분히 온화한 조건 하에서 해당 작용기로부터 절단될 수 있게 충분한 반응성을 띠도록 설계된 기를 의미한다. 탈보호화 후, 원하는 생성물이 수득된다. 아민 보호기는 당업자에게 널리 알려져 있고, 이는 Boc (여기서, Boc는 tert-부틸옥시카르보닐이다); Fmoc (여기서, Fmoc는 플루오레닐메톡시카르보닐이다); 트리플루오로아세틸; 알릴옥시카르보닐; Dde[즉, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸] 또는 Npys(즉, 3-니트로-2-피리딘 술페닐)로부터 적합하게 선택된다. 적합한 티올 보호기는 Trt(트리틸), Acm(아세트아미도메틸), t-Bu(tert-부틸), tert-부틸티오, 메톡시벤질, 메틸벤질 또는 Npys(3-니트로-2-피리딘 술페닐)이다. 추가의 보호기 사용에 관해서는 문헌 [Protective Groups in Organic Synthesis, 4^th Edition, Theorodora W. Greene and Peter G. M. Wuts, [Wiley Blackwell, (2006)]]에 기재되어 있다. 바람직한 아민 보호기는 Boc 및 Fmoc이고, 가장 바람직한 것은 Boc이다. 바람직한 티올 보호기는 Trt 및 Acm이다.

실시예 1 및 2는 추가의 구체적인 세부사항을 제공한다. 고체상 펩티드 합성의 추가의 세부사항은 문헌 [P. Lloyd-Williams, F. Albericio and E. Girald; Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC Press, 1997]에 기재되어 있다. cMBP 펩티드는 불활성 분위기 하에서 가장 잘 보관되고, 냉동기에서 유지된다. 용액 중에 사용되는 경우, 디술피드 다리결합과 혼동될 위험이 있으므로, 7 초과의 pH를 피하는 것이 가장 좋다.

바람직한 2관능성 디아민디옥심 킬레이터는 하기 킬레이터 1이며, 하기 화학식을 갖는다:

상기 식에서, 다리결합된 1차 아민 기는 L(즉, 링커기) 및/또는 cMBP 펩티드에 접합된다.

화학식 III의 디아민디옥심 킬레이터는 적절한 디아민을 하기:

(i) 적절한 클로로니트로소 유도체 Cl-C(E²E³)-CH(NO)E¹;

(ii) 화학식 Cl-C(E²E³)-C(=NOH)E¹의 알파-클로로 옥심;

(iii) 화학식 Br-C(E²E³)-C(=O)E¹의 알파-브로모케톤

중 어느 하나와 반응시키고, 이어서 히드록실아민으로 디아민디케톤 생성물을 디아민디옥심으로 전환시킴으로써 제조될 수 있다.

방법 (i)은 에스. 쥬리슨(S. Jurisson) 등의 문헌 [Inorg. Chem., 26, 3576-82 (1987)]에 기재되어 있다. 클로로니트로소 화합물은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 적절한 알켄을 니트로실 클로라이드(NOCl)로 처리함으로써 수득될 수 있다. 클로로니트로소 화합물의 합성에 대한 추가의 세부사항은 하기에 의해 제공된다: 라말링감(Ramalingam)의 문헌 [Synth. Commun., 25(5), 743-752 (1995)]; 글라세르(Glaser)의 문헌 [J. Org. Chem., 61(3), 1047-48 (1996)]; 클랩(Clapp)의 문헌 [J. Org Chem., 36(8) 1169-70 (1971)]; 사이토(Saito)의 문헌 [Shizen Kagaku, 47, 41-49 (1995)] 및 슐츠(Schulz)의 문헌 [Z. Chem., 21(11), 404-405 (1981)]. 방법 (iii)은 노워트닉(Nowotnik) 등의 문헌 [Tetrahedron, 50(29), p.8617-8632 (1994)]에 의해 광범위하게 기재되어 있다. 알파-클로로-옥심은 상응하는 알파-클로로-케톤 또는 알데히드의 옥심화에 의해 수득될 수 있고, 이는 시판되고 있다. 알파-브로모케톤이 시판되고 있다.

본 발명의 구체적인 카르복시-관능화 킬레이터 및 아민-관능화 킬레이터, 및 cMBP 펩티드에 대한 이들의 접합에 대한 추가의 세부사항은 이를 지지하는 실시예에 제공되어 있다.

제3 측면에서, 본 발명은 제1 측면의 영상화제의 제조 방법을 제공하고, 이 방법은 제1 측면의 화학식 I의 킬레이터 접합체를 적합한 용매 중에서 제1 측면에서 정의된 바와 같은 ^xTc의 공급원과 반응시키는 것을 포함한다.

킬레이터 접합체 중 cMBP 펩티드 및 킬레이터, 및 제3 측면에서의 ^xTc의 바람직한 측면은 제1 측면(상기)에서 기재된 바와 같다.

적합한 용매는 일반적으로 성질이 수성이며, 바람직하게는 제4 측면(하기)에서 정의된 바와 같은 생체적합성 담체 용매이다.

⁹⁹ ^mTc는 방사성동위원소 생성기로부터 상업적으로 입수가능하며, 멸균성 형태의 [⁹⁹ ^mTc]-과테크니튬산을 제공한다. 테크네튬 복합체의 제조 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [I.Zolle (Ed) Technetium-99m Pharmaceuticals, Springer, New York (2007)] 참조). ⁹⁴ ^mTc는 비고트(Bigott) 등의 문헌 [Nucl.Med.Biol., 33(7), 923-933 (2006)]의 방법에 의해 제조되고 가공될 수 있다.

제4 측면에서, 본 발명은 포유동물 투여에 적합한 형태의, 생체적합성 담체와 함께 제1 측면의 영상화제를 포함하는 방사성 의약품 조성물을 제공한다.

제4 측면의 영상화제의 바람직한 측면은 제1 측면에서 정의된 바와 같다. 용어 "포유동물 투여에 적합한 형태의"란 상기 정의된 바와 같다.

"생체적합성 담체"란, 유체, 특히 액체이고, 여기서 영상화제는 조성물이 생리학적으로 허용가능하도록, 즉 독성 없이 또는 과도한 불편함 없이 포유동물 신체로 투여될 수 있도록 그 중에 현탁되거나 바람직하게는 용해될 수 있다. 생체적합성 담체는, 적합하게는 주사용 담체 액체, 예컨대 멸균성 발열원 무함유 주사용수; 수용액, 예컨대 염수(이롭게는 주사용 최종 생성물이 등장성이 되도록 균형을 맞출 수 있음); 생체적합성 완충제를 포함하는 완충제 수용액(예컨대, 포스페이트 완충제); 1종 이상의 장성(tonicity)-조절 물질(예컨대, 생체적합성 반대이온과의 혈장 양이온의 염), 당류(예컨대, 글루코스 또는 수크로스), 당 알콜류(예컨대, 소르비톨 또는 만니톨), 글리콜류(예컨대, 글리세롤), 또는 다른 비-이온성 폴리올 물질 (예컨대, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등)의 수용액이다. 바람직하게, 생체적합성 담체는 발열원 무함유 주사용수, 등장성 염수 또는 포스페이트 완충제이다.

영상화제 및 생체적합성 담체는 각각 멸균 완전성 및/또는 방사능 안전성을 유지할 수 있게 하는 밀봉된 용기 및 임의적으로는 불활성 헤드스페이스 기체(예컨대, 질소 또는 아르곤)를 포함하는 적합한 바이알 또는 용기로 공급되는데, 이와 동시에 주사기 또는 캐뉼러에 의해 용액의 첨가 및 배출이 가능하다. 바람직한 상기와 같은 용기에는 격막-밀봉된 바이알이 있으며, 여기서 기밀 폐쇄부는 오버실(overseal; 전형적으로는 알루미늄 재질)을 사용하여 크림핑된다(crimped). 상기 폐쇄부(예컨대, 크림핑된 격막 밀봉 폐쇄부)는 멸균 완전성을 유지하면서 피하 주사침을 사용한 하나 또는 다수개의 펀칭에 적합하다. 상기 용기는, 상기 폐쇄부가 필요한 경우에(예컨대, 헤드스페이스 기체를 교환하거나 용액을 탈기시키기 위해) 진공을 견뎌낼 수 있고, 외부 대기 기체, 예컨대 산소 또는 수증기의 유입을 허용하지 않으면서 압력 감소와 같은 압력 변화를 견뎌낼 수 있다는 추가의 이점을 가진다.

바람직한 다수 투여(multiple dose) 용기는 다수개의 환자 투여량을 함유하는 단일의 벌크 바이알(예컨대, 부피 10 내지 30 ㎤)을 포함하고, 이에 의해 1회 환자 투여량이, 임상적 상황에 적합하도록 제조물의 생존가능한 수명 동안에 다양한 시간 간격을 두고 임상 등급의 주사기 내로 배출될 수 있다. 사전 충전된 주사기는 1회 인간 투여량, 또는 "단위 투여량(unit dose)"을 함유하도록 설계되며, 따라서 이는 바람직하게는 일회용 또는 임상적 사용에 적합한 다른 주사기이다. 본 발명의 제약 조성물은 바람직하게 단일 환자에 적합한 투여량을 가지며, 상기 기재된 바와 같이, 적합한 주사기 또는 용기에 제공된다.

제약 조성물은 추가의 임의적 부형제, 예컨대 항균 보존제, pH 조정제, 충전제, 방사성 보호제, 가용화제 또는 삼투압 조정제를 함유할 수 있다.

용어 "항균 보존제"는 잠재적으로 유해한 미생물, 예컨대 세균, 효모 또는 곰팡이의 성장을 억제하는 제제를 의미한다. 항균 보존제는 또한 사용되는 투여량에 따라 약간의 항균 특성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 항균 보존제(들)의 주된 역할은 제약 조성물 중 임의의 상기 미생물의 성장을 억제시키는 것이다. 그러나, 항균 보존제는 또한 투여 이전에 상기 조성물의 제조에 사용되는 키트의 1종 이상의 구성성분 중에서 잠재적으로 유해한 미생물의 성장을 억제시키기 위해 임의적으로 사용될 수 있다. 적합한 항균 보존제(들)로는 파라벤, 즉 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 파라벤 또는 그의 혼합물; 벤질 알콜; 페놀; 크레졸; 세트리미드 및 티오머살을 포함한다. 바람직한 항균 보존제(들)는 파라벤이다.

용어 "pH 조정제"는, 조성물의 pH가 인간 또는 포유동물에게로의 투여에 대한 허용 한계값(본 발명의 제제의 경우 대략 pH 4.0 내지 10.5, 바람직하게는 6.5 내지 8.5) 내에 있도록 하는 유용한 화합물 또는 화합물의 혼합물을 의미한다. 적합한 상기 pH 조정제로는 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 트리신, 포스페이트 또는 트리스[즉, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄], 및 제약상 허용되는 염기, 예컨대 탄산나트륨, 중탄산나트륨 또는 그의 혼합물이 포함된다. 조성물이 키트 형태로 사용될 때, pH 조정제는 임의적으로 개별 바이알 또는 용기에 제공되어, 상기 키트의 사용자가 다단계 과정의 일부로서 pH를 조정할 수 있다.

용어 "충전제"는 제조 및 동결건조 동안 물질의 취급을 용이하게 할 수 있는 제약상 허용되는 벌크화제(bulking agent)를 의미한다. 적합한 충전제에는 무기 염, 예컨대 염화나트륨, 및 수용성 당 또는 당 알콜, 예컨대 수크로스, 말토스, 만니톨 또는 트레할로스가 포함된다.

용어 "방사성 보호제"란 고도로 반응성인 자유 라디칼, 예컨대 물의 방사선 분해로부터 생성되는 산소-함유 자유 라디칼을 포획하여 분해 반응, 예컨대 산화환원 과정을 억제시키는 화합물을 의미한다. 2종 이상의 상이한 방사성 보호제의 조합을 사용할 수 있다. 본 발명의 방사성 보호제는 에탄올, 아스코르브산, 파라-아미노벤조산(즉, 4-아미노벤조산), 겐티스산(즉, 2,5-디히드록시벤조산)으로부터 적합하게 선택되고, 여기서 상기 산과 생체적합성 양이온의 염이 적용가능하다. 용어 "생체적합성 양이온"(B^c)이란 이온화된, 음으로 하전된 기와 염을 형성하는 양으로 하전된 반대이온을 의미하는데, 여기서 상기 양으로 하전된 반대이온은 또한 비독성이고, 따라서 포유동물 신체, 특히 인간 신체에 투여하기에 적합하다. 적합한 생체적합성 양이온의 예로는 알칼리 금속 나트륨 또는 칼륨; 알칼리 토금속 칼슘 및 마그네슘; 및 암모늄 이온이 포함된다. 바람직한 생체적합성 양이온은 나트륨 및 칼륨이고, 가장 바람직한 것은 나트륨이다. 본 발명의 방사성 보호제는 바람직하게는 아스코르브산 또는 아스코르브산나트륨을 포함한다.

용어 "가용화제"는 용매 중에서의 영상화제의 용해도를 증가시키는, 조성물 중에 존재하는 첨가제를 의미한다. 바람직한 상기와 같은 용매는 수성 매질이고, 따라서 상기 가용화제는 바람직하게 수용해도를 개선시킨다. 적합한 상기와 같은 가용화제로는 C₁ _-4 알콜; 글리세린; 폴리에틸렌 글리콜(PEG); 프로필렌 글리콜; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트; 소르비탄 모노올레이트; 폴리소르베이트; 폴리(옥시에틸렌)폴리(옥시프로필렌)폴리(옥시에틸렌) 블록 공중합체(플루로닉스(Pluronics)™); 시클로덱스트린(예컨대, 알파, 베타 또는 감마 시클로덱스트린, 히드록시프로필-β-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-γ-시클로덱스트린) 및 레시틴이 포함된다. 바람직한 가용화제는 시클로덱스트린, C₁ _-4 알콜 및 플루로닉스™이고, 보다 바람직하게는 시클로덱스트린 및 C₂ _-4 알콜이다. 가용화제가 알콜인 경우, 이는 바람직하게는 에탄올 또는 프로판올이고, 보다 바람직하게는 에탄올이다. 에탄올은 잠재적인 이중 역할을 갖는데, 왜냐하면 에탄올이 방사성 보호제로서도 작용할 수 있기 때문이다. 가용화제가 시클로덱스트린인 경우, 이는 바람직하게는 감마 시클로덱스트린이고, 보다 바람직하게는 히드록시프로필-β-시클로덱스트린(HPCD)이다. 시클로덱스트린의 농도는 약 0.1 내지 약 40 mg/mL, 바람직하게는 약 5 내지 약 35 mg/mL, 보다 바람직하게는 20 내지 30 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 25 mg/ml일 수 있다.

본 발명의 방사성 의약품 조성물은 하기 다양한 방법으로 제조될 수 있다:

(i) 방사성금속 복합체 형성을 클린룸 환경에서 수행하는 무균 제조 기법;

(ii) 무균 제조법을 사용하지 않고 방사성금속 복합체 형성을 수행하고, 이어서 최종 단계에서 멸균화시키는[예컨대, 감마선 조사, 오토클레이빙, 건조 가열 또는 화학적 처리(예컨대, 에틸렌 옥시드를 사용함)에 의해] 최종 멸균화;

(iii) 화학식 I의 킬레이터 접합체 및 임의의 부형제를 포함하는 멸균성의 비-방사능 키트 제제를 원하는 테크네튬 방사성금속의 공급원 반응시키는 키트 방법.

방법 (iii)이 바람직하며, 이러한 방법에 사용하기 위한 키트가 제5 실시양태(하기)에 기재되어 있다.

바람직하게는, 영상화제 조성물은, 임의의 비표지화 cMBP 펩티드가 ^xTc-표지화 cMBP 펩티드 몰량의 50배 이하로 상기 조성물 중에 존재하도록 선택된다. 따라서, ^xTc 방사성표지화에 사용되는 화학적으로 과량의 킬레이터 접합체가 ^xTc보다 1000배 초과하여 많을 수 있고, 비표지화 접합체가 생체내 c-Met 부위에 대해 경쟁할 수 있다. 그러나, 저농도의 킬레이터 접합체는 RCP에 영향을 줄 수 있다. 따라서, ^99mTc의 경우, 45 나노몰의 화합물 1을 사용하여 >90%의 RCP 값을 달성할 수 있으나, 15 내지 30 나노몰을 사용하는 경우에는 70 내지 95% 범위에서 달라진다. 임의의 과량의 비표지화 펩티드는 HPLC 또는 SPE에 의해 제거될 수 있다.

용어 "비표지화"란, c-Met 결합 시클릭 펩티드가 비-방사능임을, 즉 ^xTc 또는 임의의 다른 방사성동위원소로 방사성표지화되지 않음을 의미한다. 이러한 비표지화 펩티드는 주로 제2 측면(상기)의 비-방사능 킬레이터 접합체를 포함한다. 용어 "비표지화"는 ⁹⁹Tc로 표지화된 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 제외하며, 여기에서 상기 ⁹⁹Tc는 상기 c-Met 결합 시클릭 펩티드를 방사성표지화 하기 위해 사용되는 ⁹⁹ ^mTc 중에 존재하고, 따라서 이는 동일한 방사성표지화 반응의 생성물이다. 바람직하게는, 비표지화 c-Met 결합 시클릭 펩티드는 상응하는 ^xTc-표지화 펩티드 몰량의 20배 미만, 보다 바람직하게는 10배 미만, 가장 바람직하게는 5배 미만으로 상기 조성물 중에 존재한다.

제5 측면에서, 본 발명은 제4 측면의 방사성 의약품 조성물의 제조용 키트를 제공하고, 상기 키트는 생체적합성 담체 중 방사성금속의 멸균 공급원에 의한 재구성시에 분해가 일어나 원하는 방사성 의약품 조성물을 제공하도록, 멸균성 고체 형태의 제2 측면의 킬레이터 접합체를 포함한다.

제5 측면의 킬레이터 접합체의 바람직한 측면은 본 발명의 제2 측면(상기)에서 기재된 바와 같다.

용어 "키트"란 하나 이상의 비-방사능 제약 등급 용기를 의미하며, 작업 조작과 함께 원하는 방사성 의약품 조성물의 제조에 필요한 화학물질을 포함한다. 키트는, 원하는 방사성금속으로 재구성되어 최소의 조작으로 인간 투여에 적합한 용액을 제공하도록 설계된다.

멸균성 고체 형태는 바람직하게는 동결건조된 고체이다.

⁹⁹ ^mTc의 경우, 키트는 바람직하게는 동결건조되고, ⁹⁹ ^mTc 방사성동위원소 생성기로부터의 멸균성 ⁹⁹ ^mTc-과테크니튬산(TcO₄ ^-)으로 재구성되어 추가의 조작없이 인간 투여에 적합한 용액을 제공하도록 설계된다. 적합한 키트는 디티온산나트륨, 아황산수소나트륨, 아스코르브산, 포름아미딘 술핀산, 주석 이온, Fe(II) 또는 Cu(I)와 같은 생체적합성 환원제와 함께, 자유 염기 염 형태 또는 자유 산 염 형태의 킬레이터 접합체를 함유하는 용기(예를 들어, 격막-밀봉 바이알)를 포함한다. 생체적합성 환원제는 바람직하게는 염화제일주석 또는 주석 주석산염과 같은 주석 염이다. 별법으로는, 키트는, 임의로 테크네튬의 첨가시, 금속교환반응(즉, 금속 교환)이 일어나 원하는 생성물을 제공하는 비-방사성 금속 복합체를 함유할 수도 있다. 비-방사능 키트는 임의로는 추가의 구성성분, 예컨대 상기 기재된 바와 같은 트랜스킬레이터, 방사성 보호제, 항균 보존제, pH-조정제 또는 충전제를 더 포함할 수도 있다.

제6 측면에서, 본 발명은, 제1 측면의 영상화제 또는 제2 측면의 방사성 의약품 조성물이 분포된 인간 또는 동물 신체의 적어도 일부의 영상을 PET 또는 SPECT를 사용하여 생성하는 것을 포함하고, 상기 영상화제 또는 조성물이 상기 인간 또는 동물 신체에 미리 투여되는, 인간 또는 동물 신체의 영상화 방법을 제공한다.

제6 측면에서의 영상화제 또는 조성물의 바람직한 측면은 각각 본 발명의 제1 및 제4 측면(상기)에서 기재된 바와 같다.

바람직하게는, 제4 측면의 방사성 의약품 조성물이 사용된다.

바람직하게는, 포유동물은 생체내 온전한 포유동물 신체이고, 보다 바람직하게는 인간 대상체이다. 바람직하게는, 영상화제는 최소의 침습 방식으로, 즉 전문적인 의학적 판단 하에서 수행될 때에도 포유동물 대상체에게 실질적인 건강 상의 위험없이 포유동물 신체에 투여될 수 있다. 이러한 최소의 침습 투여는 바람직하게는 국소 또는 전신 마취의 필요없이 상기 대상체의 말초 정맥으로의 정맥내 투여이다.

제6 측면의 영상화는 바람직하게는 c-Met 과다발현 또는 국소화 부위의 것이다. c-Met 과다발현 또는 국소화 부위는 바람직하게는 암 또는 전구암성 병변이다.

제6 측면의 영상화 방법은 임의로는 약물 또는 방사선으로 인간 또는 동물 신체의 처리 효과를 반복적으로 모니터하기 위해 수행될 수 있고, 상기 영상화는 상기 처리 전 및 처리 후, 및 임의로 상기 처리 도중에도 영향을 받는다. 질환이 말기에 도달하기 이전에 악성 성장이 확실하게 조절되도록 암 치료의 효능을 조기에 모니터하는 것이 특히 관심의 대상이 된다.

제6 측면의 영상화 방법을 포함하는, 생체내 포유동물 신체의 c-Met 과다발현 또는 국소화 부위의 진단 방법이 이러한 측면에 포함된다.

제7 측면에서는, 본 발명은, 인간 또는 동물 신체의 진단 방법에서의, 제1 측면의 영상화제, 제4 측면의 방사성 의약품 조성물, 또는 제5 측면의 키트의 용도를 제공한다.

제7 측면의 영상화제 또는 조성물의 바람직한 측면은 각각 본 발명의 제1 측면 및 제4 측면(상기)에 기재된 바와 같다. 제7 측면의 진단 방법은 바람직하게는 제6 측면 및 그의 바람직한 측면의 영상화 방법을 포함한다.

본 발명은 하기 상술된 비제한적인 실시예들에 의해 예시된다. 실시예 1은 양쪽 말단에 물질대사 억제기(Z¹ = Z² = M^IG)를 갖는 본 발명의 cMBP 펩티드(펩티드 1)의 합성을 제공한다. 실시예 2 내지 4는 본 발명의 2관능성 아민-관능화 킬레이터(킬레이터 1)의 합성을 제공한다. 실시예 5는 본 발명의 2관능성 활성 에스테르-관능화 킬레이터(킬레이터 1A)의 합성을 제공한다. 실시예 6은 본 발명의 펩티드(펩티드 1)의 킬레이터 접합체와 킬레이터 1의 합성("화합물 1")을 제공한다. 실시예 7은 본 발명의 ⁹⁹ ^mTc 복합체(^99mTc-화합물 1)의 제조를 제공하며, 복합체화가 실온에서 높은 방사화학 수율로 효율적으로 진행됨을 나타낸다. 실시예 8은 ⁹⁹ ^mTc-화합물 1의 생체분포를 제공하며, 테크네튬 복합체가 양호한 종양:배경 비로 유용한 종양 흡수를 보인다는 것을 나타낸다.

약어.

통상의 1문자 또는 3문자 아미노산 약어가 사용된다.

%id: 주사 투여량 백분율

Ac: 아세틸

Acm: 아세트아미도메틸

ACN: 아세토니트릴

Boc: tert-부틸옥시카르보닐

tBu: 3차-부틸

DCM: 디클로로메탄

DMF: 디메틸포름아미드

DMSO: 디메틸술폭시드

EDC: N-3-디메틸아미노프로필-N'-에틸카르보디이미드

Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐

HATU: O-(7-아자벤조트리아졸-1-yl)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HBTU: O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트

HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피

HSPyU: O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸렌우로늄 헥사플루오로포스페이트

NHS: N-히드록시-숙신이미드

NMM: N-메틸모르폴린

NMP: 1-메틸-2-피롤리디논

Pbf: 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐

PBS: 포스페이트-완충 염수

PyBOP: 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트

s.c.: 피하

tBu: tert-부틸

TFA: 트리플루오로아세트산

THF: 테트라히드로퓨란

TIS: 트리이소프로필실란

Trt: 트리틸

상기 식에서,

화합물 1은 펩티드 1의 카르복시 말단 Lys의 엡실론 아민 기에서 관능화된다.

실시예 1: 펩티드 1의 합성.

단계 (a): 보호된 전구체 선형 펩티드의 합성.

전구체 선형 펩티드는 하기 구조를 갖는다:

Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH₂

0.1 mmol 링크 아미드 노바겔(Rink Amide Novagel) 수지로 시작하여 Fmoc 화학을 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 433A 펩티드 합성장치에서 펩티딜 수지 H-Ala-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Cys(Acm)-Ser(tBu)-Gly-Pro-Pro-Arg(Pbf)-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Acm)-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(ψ^Me ^, ^Mepro)-Glu(OtBu)-Gly-Thr(tBu)-Gly-Gly-Gly-Lys(Boc)-중합체를 조립하였다. 과량의 1 mmol 예비-활성화된 아미노산(HBTU를 사용함)을 결합 단계에서 적용하였다. Glu-Thr 슈도프롤린(노바바이오켐 05-20-1122)을 서열에 도입하였다. 수지를 질소 기포화 장치로 옮기고, DCM (5 mL) 중에 용해된 아세트산 무수물 (1 mmol) 및 NMM (1 mmol)의 용액으로 60분 동안 처리하였다. 무수물 용액을 여과에 의해 제거하고, 수지를 DCM으로 세척하고, 질소 스트림 하에 건조시켰다.

2.5% TIS, 2.5% 4-티오크레졸 및 2.5% 물을 함유하는 TFA (10 mL) 중에서 2시간 30분 동안 측쇄 보호기의 제거 및 수지로부터 펩티드의 절단을 동시에 수행하였다. 여과에 의해 수지를 제거하고, TFA를 진공 하에 제거하고, 디에틸 에테르를 잔류물에 첨가하였다. 형성된 침전물을 디에틸 에테르로 세척하고, 통풍 건조하여 264 mg의 조 펩티드를 수득하였다.

조 펩티드를 분취용 HPLC(구배: 40분에 걸쳐 20-30% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 30분)에 의해 정제하여 100 mg의 순수한 펩티드 1 선형 전구체를 수득하였다. 순수한 생성물을 분석 HPLC에 의해 분석하였다(구배: 10분에 걸쳐 10-40% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54분). 전기분무 질량 분광법을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다(MH₂ ² ⁺ 계산치: 1464.6, MH₂ ² ⁺ 실측치: 1465.1).

단계 (b): 모노시클릭 Cys4 -16 디술피드 다리결합의 형성.

Cys4-16; Ac-Ala-Gly-Ser-Cys-Tyr-Cys(Acm)-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys(Acm)-Trp-Cys-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys-NH₂ _.

단계 (a)로부터의 선형 전구체 (100 mg)를 5% DMSO/물 (200 mL) 중에 용해시키고, 암모니아를 사용하여 용액을 pH 6으로 조정하였다. 반응 혼합물을 5일 동안 교반하였다. 이어서, TFA를 사용하여 상기 용액을 pH 2로 조정하고, 용매의 대부분을 진공 증발시켜 제거하였다. 잔류물 (40 mL)을 생성물 정제를 위하여 분취용 HPLC 컬럼 상에 소량씩 주입하였다.

잔류물을 분취용 HPLC(구배: 10분 동안 0% B, 이어서 40분에 걸쳐 0-40% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 44분)에 의해 정제하여 72 mg의 순수한 펩티드 1 모노시클릭 전구체를 수득하였다. 순수한 생성물(이성질체 P1 내지 P3의 혼합물로서)을 분석 HPLC에 의해 분석하였다(구배: 10분에 걸쳐 10-40% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 5.37분(P1); 5.61분(P2); 6.05분(P3)). 전기분무 질량 분광법을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다(MH₂ ² ⁺ 계산치: 1463.6, MH₂ ² ⁺ 실측치: 1464.1(P1); 1464.4(P2); 1464.3(P3)).

단계 (c): 제2 Cys6 -14 디술피드 다리결합의 형성(펩티드 1).

단계 (b)로부터의 모노시클릭 전구체 (72 mg)를 질소 블랭킷 하에서 75% AcOH/물 (72 mL) 중에 용해시켰다. 1M HCl (7.2 mL) 및 AcOH (4.8 mL) 중의 0.05M I₂를 순서대로 첨가하고, 45분 동안 혼합물을 교반하였다. 1M 아스코르브산 (1 mL)을 첨가하여 무색 혼합물을 수득하였다. 대부분의 용매를 진공 증발시키고, 잔류물 (18 mL)을 물/0.1% TFA (4 mL)로 희석하고, 분취용 HPLC를 사용하여 생성물을 정제하였다. 잔류물을 분취용 HPLC(구배: 10분 동안 0% B, 이어서 40분에 걸쳐 20-30% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250×21.20 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 43-53분)에 의해 정제하여 52 mg의 순수한 펩티드 1을 수득하였다. 순수한 생성물을 분석 HPLC에 의해 분석하였다(구배: 10분에 걸쳐 10-40% B, 여기에서 A=H₂O/0.1% TFA 및 B=ACN/0.1% TFA, 유량: 0.3 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 50×2 mm, 검출: UV 214 nm, 생성물 체류 시간: 6.54분). 전기분무 질량 분광법을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다(MH₂ ² ⁺ 계산치: 1391.5, MH₂ ² ⁺ 실측치: 1392.5).

실시예 2: 1,1,1- 트리스(2-아미노에틸)메탄의 합성.

단계 1(a): 3(메톡시카르보닐메틸렌)글루타르산 디메틸에스테르.

톨루엔 (600 ml) 중의 카르보메톡시메틸렌트리페닐포스포란 (167 g, 0.5 mol)을 디메틸 3-옥소글루타레이트 (87 g, 0.5 mol)로 처리하고, 상기 반응을 질소 분위기 하에서 36시간 동안 120℃의 오일조에서 100℃로 가열하였다. 이어서, 상기 반응을 진공 농축시키고, 오일성 잔류물을 40/60 페트롤 에테르/디에틸에테르 1:1, 600 ml로 정제 처리하였다. 침전된 트리페닐포스핀 옥시드 및 상층 액체를 디캔팅/여과 제거하였다. 진공 증발시킨 잔류물을 고 진공 Bpt(0.2 torr에서 오븐 온도 180 내지 200℃) 하에 쿠겔로어(Kugelrohr) 증류시켜, 3-(메톡시카르보닐메틸렌)글루타르산 디메틸에스테르 (89.08 g, 53%)를 수득하였다.

단계 1(b): 3-( 메톡시카르보닐메틸렌 ) 글루타르산 디메틸에스테르의 수소화.

메탄올 (200 ml) 중의 3-(메톡시카르보닐메틸렌)글루타르산 디메틸에스테르 (89 g, 267 mmol)를 (30시간) 동안 수소 기체의 분위기(3.5 bar) 하에서 (10% 목탄상 팔라듐:50% 물) (9 g)로 진탕시켰다. 상기 용액을 키젤거(kieselguhr)를 통해 여과하고, 진공 농축시켜, 오일로서 3-(메톡시카르보닐메틸)글루타르산 디메틸에스테르를 수득하였다(수율(84.9 g, 94%)).

단계 1(c): 트리아세테이트로의 트리메틸 에스테르의 환원 및 에스테르화 .

3구 2 L 둥근 바닥 플라스크 내의 질소 분위기 하에서 THF (400 ml) 중의 수소화 알루미늄 리튬 (20 g, 588 mmol)을 1시간에 걸쳐 THF (200 ml) 중의 트리스(메틸옥시카르보닐메틸)메탄 (40 g, 212 mmol)으로 조심스럽게 처리하였다. 강한 발열 반응이 발생하여, 용매의 강한 환류를 유도하였다. 상기 반응을 3일 동안 환류시키면서 90℃의 오일조에서 가열하였다. 수소 발생이 멈출 때까지 아세트산 (100 ml)을 조심스럽게 적가하여 상기 반응을 켄칭하였다. 교반된 반응 혼합물을 온화한 환류를 유도하기 위한 속도로 아세트산 무수물 용액 (500 ml)으로 조심스럽게 처리하였다. 플라스크에 증류를 위한 장비를 구비시키고, 교반시키고, 이어서 90℃(오일조 온도)에서 가열하여 THF를 증류 제거하였다. 아세트산 무수물 (30 ml)의 일부를 더 첨가하고, 상기 반응을 다시 환류 배치시켜, 교반하고, 5시간 동안 140℃의 오일조에서 가열하였다. 상기 반응을 냉각시키고, 여과하였다. 알루미늄 옥시드 침전물을 에틸 아세테이트로 세척하고, 조합된 여과물을 수조 온도가 50℃인 진공상태(5 mmHg)의 회전 증발기에서 농축시켜 오일을 수득하였다. 상기 오일을 에틸 아세테이트 (500 ml) 중에 용해시키고, 포화 수성 칼륨 카르보네이트 용액으로 세척하였다. 상기 에틸 아세테이트 용액을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 농축시켜 오일을 수득하였다. 상기 오일을 고 진공에서 쿠겔로어 증류시켜 오일로서 트리스(2-아세트옥시에틸)메탄 (45.3 g, 95.9%)을 수득하였다. Bp. 0.1 mmHg에서 220℃.

단계 1(d): 트리아세테이트로부터의 아세테이트 기의 제거.

메탄올 (200 ml) 중의 트리스(2-아세트옥시에틸)메탄 (45.3 g, 165 mM) 및 880 암모니아 (100 ml)를 2일 동안 80℃의 오일조에서 가열하였다. 상기 반응을 추가의 880 암모니아 (50 ml)의 일부로 처리하고, 24시간 동안 80℃의 오일조에서 가열하였다. 880 암모니아 (50 ml)의 일부를 추가로 첨가하고, 상기 반응을 24시간 동안 80℃에서 가열하였다. 이어서, 반응을 진공 농축시켜 모든 용매를 제거하여 오일을 수득하였다. 이를 880 암모니아 (150 ml) 중에 용해시키고, 24시간 동안 80℃에서 가열하였다. 이어서, 상기 반응을 진공 농축시켜 모든 용매를 제거하여 오일을 수득하였다. 쿠겔로어 증류에 의해 아세트아미드를 수득하였다(bp 170 내지 180, 0.2 mm). 아세트아미드를 함유하는 벌브를 깨끗이 세척하고, 증류를 계속하였다. 트리스(2-히드록시에틸)메탄 (22.53 g, 92%)을 bp 220℃, 0.2 mm에서 증류하였다.

단계 1(e): 트리올의 트리스(메탄술포네이트)로의 전환.

교반되고 얼음 냉각된 디클로로메탄 (50 ml) 중의 트리스(2-히드록시에틸)메탄 (10 g, 0.0676 mol) 용액에 디클로로메탄 (50 ml) 중의 메탄술포닐 클로라이드 (40 g, 0.349 mol) 용액을 온도가 15℃를 초과하여 상승하지 않는 속도로 질소 하에서 천천히 적하하였다. 이어서, 디클로로메탄 (50 ml) 중에 용해된 피리딘 (21.4 g, 0.27 mol, 4eq)을 온도가 15℃를 초과하여 상승(발열 반응)하지 않는 속도로 적가하였다. 상기 반응을 24시간 동안 실온에서 교반하여 두고, 이어서 5N 염산 용액 (80 ml)으로 처리하고, 층을 분리하였다. 수성층을 추가의 디클로로메탄 (50 ml)으로 추출하고, 유기 추출물을 조합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축시켜 과량의 메탄술포닐 클로라이드로 오염된 트리스[2-(메틸술포닐옥시)에틸]메탄을 수득하였다. 이론상 수율은 25.8 g이었다.

단계 1(f): 1,1,1- 트리스(2-아지도에틸)메탄의 제조.

질소 하에서 교반된 무수 DMF (250 ml) 중의 트리스[2-(메틸술포닐옥시)에틸]메탄 [단계 1(e)로부터의 것, 과량의 메틸술포닐 클로라이드로 오염됨] (25.8 g, 67 mmol, 이론상) 용액을 15분에 걸쳐 조금씩 아지드화나트륨 (30.7 g, 0.47 mol)으로 처리하였다. 발열이 관찰되었고, 반응을 빙조상에서 냉각시켰다. 30분 후, 반응 혼합물을 24시간 동안 50℃의 오일조에서 가열하였다. 상기 반응의 색은 갈색이 되었다. 반응을 냉각시키고, 묽은 칼륨 카르보네이트 용액 (200 ml)으로 처리하고, 40/60 페트롤 에테르/디에틸에테르 10:1로 3회 추출하였다(3x150 ml). 유기 추출물을 물(2x150 ml)로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하였다. 페트롤/에테르 용액에 에탄올 (200 ml)을 첨가하여 트리아지드를 용액 중에 유지시키고, 200 ml 이상으로 부피를 진공에서 감소시켰다. 에탄올 (200 ml)을 첨가하고, 진공에서 재농축시켜, 마지막 미량의 페트롤을 제거하고, 에탄올 용액은 200 ml 이상 남겨두었다. 트리아지드의 에탄올 용액을 단계 1(g)에 바로 사용하였다.

주의 : 아지드는 폭발할 가능성이 있으므로 용매 전부를 제거하지 말고, 항상 희석 용액 중에서 유지시켜야 한다.

0.2 ml 미만의 상기 용액을 진공 증발시켜 에탄올을 제거하고, 이 소량의 샘플에 대해 NMR을 수행하였다:

단계 1(g): 1,1,1- 트리스(2-아미노에틸)메탄의 제조.

에탄올 (200 ml) 중의 트리스(2-아지도에틸)메탄 (15.06 g, 0.0676 mol), (이전 반응으로부터 100% 수율을 가정함)을 10% 목탄상 팔라듐 (2 g, 50% 물)으로 처리하고, 12시간 동안 수소화시켰다. 상기 반응 용기를 매 2시간마다 배기시켜 반응에서 발생한 질소를 제거하고, 수소로 재충전하였다. 샘플을 취해 NMR 분석을 수행하여 트리아민으로의 트리아지드의 완전한 전환을 확인하였다.

주의: 환원되지 않은 아지드는 증류시 폭발할 수 있다. 상기 반응을 셀라이트 패드를 통해 여과하여 촉매를 제거하고, 진공 농축시켜 오일로서 트리스(2-아미노에틸)메탄을 수득하였다. 이를 0.4 mm/Hg에서 bp. 180 내지 200℃의 쿠겔로어 증류에 의해 정제하여 무색 오일(8.1 g, 트리올로부터의 총 수율 82.7%)을 수득하였다.

실시예 3: 3- 클로로 -3- 메틸 -2- 니트로소부탄의 제조.

2-메틸부트-2-엔 (147 ml, 1.4 mol)과 이소아밀 나이트라이트 (156 ml, 1.16 mol)의 혼합물을 카드아이스(cardice)와 메탄올의 조에서 -30℃로 냉각시키고, 오버헤드 공기 교반기로 격렬하게 교반시키고, 온도가 -20℃ 미만에서 유지되는 속도로 진한 염산 (140 ml, 1.68 mol)으로 적가 처리하였다. 유의한 발열 반응이 일어나서 과열을 방지하기 위해 주의해야하기 때문에, 약 1시간이 소요된다. 에탄올 (100 ml)을 가하여 첨가의 마지막에 형성된 슬러리의 점도를 감소시키고, 반응을 추가의 2시간 동안 -20℃ 내지 -10℃에서 교반하여 반응을 완료하였다. 침전물을 진공 하의 여과에 의해 수집하고, 냉(-20℃) 에탄올 4x30 ml 및 빙냉 물 100 ml로 세척하고, 진공 건조시켜 백색 고체로서 3-클로로-3-메틸-2-니트로소부탄을 수득하였다. 에탄올 여과액 및 세척액을 조합하고, 물 (200 ml)로 희석시키고, 냉각시키고, 추가량의 3-클로로-3-메틸-2-니트로소부탄이 결정화될 때, -10℃에서 1시간 동안 정치시켰다. 침전물을 여과 수집하고, 최소량의 물로 세척하고, 진공 건조시켜, 3-클로로-3-메틸-2-니트로소부탄 (115 g, 0.85 mol, 73%)의 총 수율을 수득하였고, NMR에 의한 순도는 >98%이었다.

실시예 4: 비스 [N-(1,1-디메틸-2-N-히드록시이민 프로필)2- 아미노에틸 ]-(2-아미노에틸)메탄 ( 킬레이터 1)의 합성.

무수 에탄올 (30 ml) 중의 트리스(2-아미노에틸)메탄 (4.047 g, 27.9 mmol) 용액에 칼륨 카르보네이트 무수물 (7.7 g, 55.8 mmol, 2eq)을 질소 분위기 하에서 격렬하게 교반시키면서 실온에서 첨가하였다. 3-클로로-3-메틸-2-니트로소부탄 (7.56 g, 55.8 mol, 2eq)의 용액을 무수 에탄올 (100 ml) 중에 용해시키고, 이 용액 75 ml를 상기 반응 혼합물에 천천히 적하하였다. 상기 반응에 이어 실리카상에서 TLC[플레이트를 디클로로메탄, 메탄올, 진한(0.88sg) 암모니아 100/30/5 중에서 진행시키고, TLC 플레이트는 닌하이드린을 분무 및 가열하여 전개시킴]하였다. 모노-, 디- 및 트리-알킬화 생성물은, RF가 상기 순서대로 증가하는 것으로 나타났다. 구배가 3% 암모니아 수용액 중에서 7.5-75% 아세토니트릴인 PRP 역상 컬럼을 사용하여 분석 HPLC를 진행하였다. 상기 반응을 진공 농축하여 에탄올을 제거하고, 물 (110 ml) 중에 재현탁시켰다. 수성 슬러리를 에테르 (100 ml)로 추출하여 트리알킬화 화합물 및 친유성 불순물의 일부를 제거하였고, 모노 및 원하는 디알킬화 생성물은 수성층에 남겨두었다. 양호한 크로마토그래피를 보장하도록 상기 수용액을 암모늄 아세테이트 (2eq, 4.3 g, 55.8 mmol)로 완충시켰다. 수용액을 자동화 분취용 HPLC로 정제하기 전에 밤새 4℃에서 보관하였다.

수율 (2.2 g, 6.4 mmol, 23%).

질량 분광측정법: 양이온 10 V 콘(cone) 전압. 실측치: 344; 계산치 M+H= 344.

HPLC 조건: 유량 8 ml/분, 25 mm PRP 컬럼을 사용함[A=3% 암모니아 용액 (sp.gr = 0.88)/물; B=아세토니트릴].

매 진행시에 3 ml의 수용액을 로딩하였고, 12.5 내지 13.5분의 시간 윈도우의 범위에서 수집하였다.

실시예 5: 킬레이터 1- 글루타르산의 테트라플루오로티오페닐 에스테르( 킬레이터 1A)의 합성.

a) [ 킬레이터 1]- 글루타르산 중간체의 합성.

킬레이터 1 (100 mg, 0.29 mmol)을 DMF (10 mL) 중에 용해시키고, 교반하면서 글루타르산 무수물 (33 mg, 0.29 mmol)을 조금씩 첨가하였다. 상기 반응을 23시간 동안 교반하여 원하는 생성물로의 완전한 전환을 수득하였다. RP-HPLC 후 양호한 수율로 순수한 산을 수득하였다.

b) 킬레이터 1A의 합성.

DMF (2 mL) 중의 [킬레이터 1]-글루타르산(단계 a로부터의 것; 300 mg, 0.66 mmol)에 HATU (249 mg, 0.66 mmol) 및 NMM (132 ㎕ 1.32 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 5분 동안 교반하고, 이어서 테트라플루오로티오페놀 (0.66 mmol, 119 mg)을 첨가하였다. 상기 용액을 10분 동안 교반하고, 이어서 상기 반응 혼합물을 20% 아세토니트릴/물 (8 mL)로 희석하고, 생성물을 냉동-건조시킨 후 RP-HPLC로 정제하여 110 mg의 원하는 생성물을 수득하였다.

실시예 6: 펩티드 1 접합체와 킬레이터 1의 합성(화합물 1).

킬레이터 1A (3.8 mg, 실시예 5), 펩티드 1 (3.4 mg) 및 sym.-콜리딘 (1.6 ㎕)을 DMF (1 mL) 중에 용해시키고, 상기 용액을 90분 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 물 (6 mL)로 희석하고, 생성물을 분취용 HPLC를 사용하여 정제하였다.

조 펩티드를 분취용 HPLC(40분에 걸쳐 10-20 % B, 여기에서 A = H₂O/0.1 % TFA 및 B = ACN/0.1 % TFA, 유량: 10 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 5μ C18 (2) 250 x 21.20 mm, 검출: UV 214 nm)에 의해 정제하여 1.1 mg (28 %)의 순수한 화합물 1을 수득하였다. 정제된 물질을 분석 HPLC(구배: 5분에 걸쳐 10-40 % B, 여기에서 A = H₂O/0.1 % TFA 및 B = ACN/0.1 % TFA, 유량: 0.6 mL/분, 컬럼: 페노메넥스 루나 3μ C18 (2) 20 x 2 mm, 검출: UV 214 nm, t_R: 3.04분)로 분석하였다. 전기분무 질량 분광법을 사용하여 추가의 생성물 특징결정을 수행하였다(실측치: m/z: 1611.2, 예상치 MH₂ ² ⁺: 1611.2).

실시예 7: 화합물 1의 ⁹⁹ ^m Tc - 방사성표지화 .

단계 (i): 동결건조된 바이알 .

화합물 1 (45 nmol)을 제1 바이알(바이알 1)에서 동결건조시켰다. 하기 제제를 함유하는 동결건조된 키트(바이알 2)를 하기와 같이 별도로 제조하였다:

단계 ( ii ): 방사성표지화 .

바이알 1을 물:에탄올 용액 (50:50 혼합물 0.1 mL)으로 재구성하였고, 상기 바이알을 10분 동안 혼합하거나, 초음파처리하였다. 이어서, 생성된 화합물 1의 용액(0.1 mL)을 바이알 2에 첨가하였다. 이어서, 드라이텍(Drytec)^TM 생성기로부터의 ⁹⁹ ^mTc-과테크니튬산 용출액(지이 헬스케어(GE Healthcare); 0.9 ml, 0.25 내지 2.18 GBq)을 상기 바이알에 첨가하고, 용액을 HPLC 분석하기 전에 20분 동안 실온에서 정치시켰다. RCP는 93 내지 94%이었다.

실시예 8: 종양-보유 누드 마우스에서의 ⁹⁹ ^m Tc -화합물 1의 생체분포.

CD-1 수컷 누드 마우스(약 20 g)들을 음식물 및 물에 무제한으로 접근하게 하면서 각각의 통풍되는 우리에 살게 하였다. HT-29 세포(ATCC, 목록 번호 HTB-38)를 10% 태아 소 혈청 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 맥코이(McCoy) 5a 배지(시그마 # M8403)에서 생육시켰다. 0.25% 트립신을 사용하여 70 내지 80% 융합에서 세포를 1:3으로 1주 2회 분할하고, 5% CO₂ 중에서 37℃에서 배양하였다. 경미한 기체 마취(이소플루란) 하에, 미세한 구멍 바늘(25 G)을 사용하여 100 ㎕의 부피로 주사 당 10⁶ 세포의 공칭 용량을 가진 HT-29 세포 현탁액을 하나의 부위(목덜미)에서 마우스에 피하 주사하였다. 이어서, 종양을 20일 동안 또는 적어도 200 mm³ 부피까지(연구에 포함시키기 위해) 발달시켰다.

20일의 성장 시간 후에, 꼬리 정맥을 통해 정맥내 볼루스(bolus)로서 ⁹⁹ ^mTc-화합물 1 (0.1 ml, 1 내지 5 MBq/동물)을 동물에 주사하였다. 다양한 시간에, 주사후 동물을 안락사시키고, 해부한 후, 기관 및 조직을 제거하였다. 120분 p.i.에서의 결과는 하기와 같았다:

120분 p.i.에서 신체 내에 보유된 활성의 44%가 종양 내에 존재하였다.

SEQUENCE LISTING <110> GE Healthcare Limited GE Healthcare Limited <120> Technetium Labelled Peptides <130> PZ1114 WO <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> DISULFID <222> (1)..(13) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> metabolism inhibiting group or chelator attached <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> N, H or Y <220> <221> DISULFID <222> (3)..(11) <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (15)..(15) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> metabolism inhibiting group or chelator attached <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> D or E <400> 1 Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys Tyr Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 2 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> metabolism inhibiting group or chelator attached <220> <221> DISULFID <222> (2)..(14) <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> N, H OR Y <220> <221> DISULFID <222> (4)..(12) <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (16)..(16) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (17)..(17) <223> S or T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> metabolism inhibiting group or chelator attached <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> D or E <400> 2 Ser Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys Tyr Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> metabolism inhibiting group or chelator attached <220> <221> DISULFID <222> (4)..(16) <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> N, H or Y <220> <221> DISULFID <222> (6)..(14) <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> G, S, T or N <220> <221> VARIANT <222> (11)..(11) <223> T or R <220> <221> VARIANT <222> (18)..(18) <223> A, D, E, G or S <220> <221> VARIANT <222> (19)..(19) <223> S or T <220> <221> VARIANT <222> (20)..(20) <223> D or E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> metabolism inhibiting group or chelator attached <400> 3 Ala Gly Ser Cys Xaa Cys Xaa Gly Pro Pro Xaa Phe Glu Cys Trp Cys 1 5 10 15 Tyr Xaa Xaa Xaa Gly Thr 20 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Gly Gly Gly Lys 1 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Gly Ser Gly Lys 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> metabolism inhibiting group or chelator attached <220> <221> DISULFID <222> (4)..(16) <220> <221> DISULFID <222> (6)..(14) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (26)..(26) <223> metabolism inhibiting group or chelator attached <400> 7 Ala Gly Ser Cys Tyr Cys Ser Gly Pro Pro Arg Phe Glu Cys Trp Cys 1 5 10 15 Tyr Glu Thr Glu Gly Thr Gly Gly Gly Lys 20 25

Claims

c-Met 결합 펩티드의 킬레이터 접합체의 방사능 ^xTc 복합체를 포함하고, 상기 킬레이터 접합체가 하기 화학식 I인 영상화제.
<화학식 I>
Z¹-[cMBP]-Z²
[상기 식에서,
^xTc는 방사성동위원소 ⁹⁴ ^mTc 또는 ⁹⁹ ^mTc이고;
cMBP는 하기 화학식 II의 18량체 내지 30량체 c-Met 결합 시클릭 펩티드이고:
<화학식 II>
-(A)_x-Q-(A')_y-
{상기 식에서, Q는 하기 아미노산 서열(SEQ-1)이고:
-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶-
(상기 식에서, X¹은 Asn, His 또는 Tyr이고;
X²는 Gly, Ser, Thr 또는 Asn이고;
X³은 Thr 또는 Arg이고;
X⁴는 Ala, Asp, Glu, Gly 또는 Ser이고;
X⁵는 Ser 또는 Thr이고;
X⁶은 Asp 또는 Glu이고;
Cys^a-d는 각각 잔기 a와 b 뿐만 아니라 c와 d가 고리화하여 2개의 별개의 디술피드 결합이 형성되도록 하는 시스테인 잔기이다);
A 및 A'는 독립적으로 Cys 이외의 임의의 아미노산이거나, 또는 A 및 A' 중 하나는 Lys(ε-Z³)이고;
x 및 y는 독립적으로 0 내지 13의 정수이고, [x + y] = 1 내지 13이 되도록 선택된다};
Z¹은 cMBP의 N-말단에 부착되고, M^IG 또는 Z³이고;
Z²는 cMBP의 C-말단에 부착되고, M^IG 또는 Z³이되:
{여기에서, 각각의 M^IG은 독립적으로 cMBP 펩티드의 생체내 물질대사를 억제하거나 저지하는 생체적합성 기인 물질대사 억제기이고;
Z³은 하기 화학식 III의 킬레이터이고:
<화학식 III>

(상기 식에서, E¹ 내지 E⁶은 각각 독립적으로 R' 기이고;
각각의 R'은 독립적으로 H 또는 C₁ _-4 알킬, C₃ _-7 알킬아릴, C₂ _-7 알콕시알킬, C_1-4 히드록시알킬, C₁ _-4 플루오로알킬, C₂ _-7 카르복시알킬 또는 C₁ _-4 아미노알킬이거나, 또는 2개 이상의 R' 기는 이들이 부착된 원자와 함께 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 포화 또는 불포화 고리를 형성하고;
L은 화학식 -(A)_m-의 합성 링커기이고, 각각의 A는 독립적으로 -CR₂-, -CR=CR-, -C≡C-, -CR₂CO₂-, -CO₂CR₂-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO₂NR-, -NRSO₂-, -CR₂OCR₂-, -CR₂SCR₂-, -CR₂NRCR₂-, C₄ _-8 시클로헤테로알킬렌 기, C_4-8 시클로알킬렌 기, C₅ _-12 아릴렌 기, 또는 C₃ _-12 헤테로아릴렌 기, 또는 단분산성 폴리에틸렌글리콜(PEG) 빌딩 블록이고;
각각의 R은 독립적으로 H, C_1-4 알킬, C_2-4 알케닐, C_2-4 알키닐, C_1-4 알콕시알킬 또는 C₁ _-4 히드록시알킬로부터 선택되고;
m은 1 내지 10의 정수이다)};
단 화학식 I의 접합체는 하나의 Z³ 기를 포함하고, 상기 Z³ 기는 ^xTc와 금속 복합체를 형성한다]
제1항에 있어서, Q가 하기 아미노산 서열 SEQ-2 또는 SEQ-3을 포함하는, 영상화제.
Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-X⁴-X⁵-X⁶
(SEQ-2);
Ala-Gly-Ser-Cys^a-X¹-Cys^c-X²-Gly-Pro-Pro-X³-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-
X⁴-X⁵-X⁶-Gly-Thr (SEQ-3).
제1항 또는 제2항에 있어서, X³이 Arg인 영상화제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, A 및 A' 중 하나가 Lys(ε-Z³)이고, cMBP가 단지 하나의 Lys 잔기를 포함하는, 영상화제.
제4항에 있어서, cMBP가 하기 화학식 IIA인 영상화제.
<화학식 IIA>
-(A)_x-Q-(A')_z-Lys(ε-Z³)-
[상기 식에서,
z는 0 내지 12의 정수이고, [x + z] = 0 내지 12이다]
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, -(A)_x- 또는 -(A')_y- 기 중 하나가 하기:
-Gly-Gly-Gly-Lys- (SEQ-4),
-Gly-Ser-Gly-Lys- (SEQ-5) 또는
-Gly-Ser-Gly-Ser-Lys- (SEQ-6)
로부터 선택된 링커 펩티드를 포함하고, Z³ 기가 상기 링커 펩티드의 Lys 잔기의 엡실론 아민 기에 부착되는, 영상화제.
제6항에 있어서, cMBP가 하기 아미노산 서열(SEQ-7)을 갖는, 영상화제.
Ala-Gly-Ser-Cys^a-Tyr-Cys^c-Ser-Gly-Pro-Pro-Arg-Phe-Glu-Cys^d-Trp-Cys^b-Tyr-Glu-Thr-Glu-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 킬레이터가 하기 화학식 IIIA인 영상화제.
<화학식 IIIA>

[상기 식에서, q는 1 내지 6의 정수이다]
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ^xTc가 ⁹⁹ ^mTc인 영상화제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은, 화학식 I의 킬레이터 접합체.
제10항의 킬레이터 접합체를 적합한 용매 중에서 제1항 또는 제9항에서 정의된 바와 같은 ^xTc의 공급원과 반응시키는 것을 포함하는, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 영상화제의 제조 방법.
포유동물 투여에 적합한 형태의, 생체적합성 담체와 함께 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 영상화제를 포함하는 방사성 의약품 조성물.
생체적합성 담체 중의 방사능 ^xTc의 멸균 공급원에 의한 재구성시에 분해가 일어나 원하는 방사성 의약품 조성물을 제공하도록, 멸균성 고체 형태의 제10항의 킬레이터 접합체를 포함하고, ^xTc가 제1항 또는 제9항에서 정의된 바와 같은, 제12항의 방사성 의약품 조성물의 제조용 키트.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 영상화제 또는 제12항의 방사성 의약품 조성물이 분포된 인간 또는 동물 신체의 적어도 일부의 영상을 PET 또는 SPECT를 사용하여 생성하는 것을 포함하고, 상기 영상화제 또는 조성물이 상기 인간 또는 동물 신체에 미리 투여되는, 인간 또는 동물 신체의 영상화 방법.
제14항에 있어서, 영상이 c-Met 과다발현 또는 국소화 부위의 것인 영상화 방법.
제15항에 있어서, c-Met 과다발현 또는 국소화 부위가 암 또는 전구암성 병변인 영상화 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 약물 또는 방사선에 의한 인간 또는 동물 신체의 처리 효과를 반복적으로 모니터하기 위해 수행되고, 상기 영상화가 상기 처리 전 및 처리 후, 및 임의로 상기 처리 도중에도 영향을 받는, 영상화 방법.
인간 또는 동물 신체의 진단 방법에서의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 영상화제, 제12항의 조성물, 또는 제13항 또는 제14항의 키트의 용도.