CN104725515A - 一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术研究领域，具体涉及一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和在重组腺病毒浓缩和纯化中的应用。所述类弹性蛋白多肽(ELP)与柯萨奇腺病毒受体(CAR)融合蛋白(ELP-CAR)，由ELP、间隔区和CAR-D1区组成。其制备方法包括类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合表达载体的构建、融合蛋白的表达与纯化以及重组腺病毒的纯化与洗脱。与其他方法相比，用本发明的类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白浓缩和纯化重组腺病毒具有简单、快速和经济等优点，制备的重组腺病毒可以用于动物实验研究和基因工程疫苗。

Description

一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术研究领域，具体涉及一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白的制备方法及其在重组腺病毒浓缩和纯化中的应用。

技术背景

作为基因转移载体，腺病毒与其他病毒相比具有许多优点，包括容易制备高滴度的重组病毒、能转导多种分裂和静止期细胞、基因导入效率高、外源基因能有效表达和插入宿主基因组引起突变的风险小等，因此重组腺病毒在人和动物基因治疗和基因工程疫苗研究中已得到广泛应用。

重组腺病毒的广泛使用需要快速、经济、大量制备高质量的重组病毒，现有的重组腺病毒浓缩与纯化方法主要有化学沉淀法、超速离心法和层析法。其中，聚乙二醇沉淀法是经典的重组病毒浓缩方法，但需要离心大量的细胞培养液；硫酸铵沉淀法兼有浓缩和纯化重组腺病毒的作用，但通常需与其他纯化方法相结合才能达到纯化目的；氯化铯密度梯度离心法是制备高质量重组腺病毒的经典方法，但因难以规模化而不能满足临床应用需要；虽然许多层析法也可用于重组腺病毒的纯化，但这些方法最初为纯化蛋白而设计，纯化重组腺病毒的效果往往不佳。另外，上述重组腺病毒浓缩与纯化方法都有费力、费时、成本高和需要专门设备等缺点。

腺病毒以受体参与的胞吞机制进入靶细胞。参与不同血清型腺病毒感染的受体有多个，其中柯萨奇腺病毒受体(Coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR)是柯萨奇病毒B以及人腺病毒血清型2和5的高亲和力吸附受体，而目前用于人和动物基因工程疫苗的重组腺病毒多为血清2和5型。CAR是一种46kDa跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞浆内尾部三部分组成。其中，胞外区由D1和D2两个免疫球蛋白样结构域组成，两者之间为间隔序列。现有的研究资料显示，重组大肠杆菌表达的CAR-D1区即可与腺病毒结合，提示可以作为捕捉和浓缩腺病毒的诱饵蛋白。

类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptide,ELP)是根据弹性蛋白相关序列合成的五肽(缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-任何氨基酸-甘氨酸)聚合物，具有温度敏感的可逆相变特性，在低于相变温度溶液中呈溶解状态，在高于相变温度溶液中呈凝聚状态，因此可用简单的离心或过滤法与细胞蛋白分离。已经表达的ELP融合蛋白能保持ELP的可逆相变特性，因此ELP已被用作纯化重组蛋白的标签蛋白，但ELP与腺病毒受体的融合蛋白能否保持可逆相变特性，并进一步用于重组腺病毒的浓缩与纯化，尚有待研究。

本发明将ELP的温度敏感相变特性与腺病毒受体的结合特异性相结合，将重组大肠杆菌表达的ELP与CAR-D1融合蛋白(ELP-CAR)用于重组腺病毒的浓缩与纯化。尽管这种策略是容易想到的，但在具体设计时却面临以下技术问题：天然CAR-D1序列是否适合在大肠杆菌中高水平表达、CAR-D1区与ELP融合后能否正确折叠、在什么条件下ELP-CAR融合蛋白能保持溶解状态、如何洗脱释放与ELP-CAR融合蛋白结合的腺病毒并不被灭活、结合融合蛋白的腺病毒是否能感染敏感细胞。为此，本发明在已知ELP序列能在重组大肠杆菌中有效表达基础上，将CAR-D1区序列优化成大肠杆菌偏爱密码子序列，以便两者融合蛋白能在重组大肠杆菌中高水平表达；利用CAR蛋白两个胞外区之间的间隔序列作为ELP与CAR-D1区的弹性间隔序列，以便CAR-D1区能在融合蛋白表面自由折叠和展示；在测得ELP-CAR融合蛋白相变温度基础上，在低于相变温度下进行融合蛋白表达和与腺病毒结合，以确保其可溶性；通过对腺病毒洗脱条件的系统优化，使腺病毒能从融合蛋白上有效洗脱并不被灭活。与现有的其他方法相比，用本发明的ELP-CAR融合蛋白不仅能从感染细胞中浓缩和纯化重组腺病毒，而且能从水等环境样品中浓缩人和动物腺病毒，纯化的重组腺病毒不仅可用于动物实验研究，还可作为基因工程疫苗。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种类弹性蛋白多肽(ELP)与柯萨奇腺病毒受体(CAR)融合蛋白及其制备方法和应用。

本发明的类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白，由ELP、间隔区和CARD1区组成。经病毒纯化试验证明，利用该融合蛋白能从重组腺病毒感染细胞及其培养上清中有效浓缩与纯化重组腺病毒。

本发明所述融合蛋白用下列方法制备：

(1)依次将ELP、间隔区和CARD1区编码序列插入原核表达载体pET-30a，获得重组载体pET-ELP-CAR；

(2)用重组载体pET-ELP-CAR转化大肠杆菌，在20℃条件下进行ELP-CAR融合蛋白诱导表达；

(3)用1.5M氯化钠和26℃离心沉淀ELP-CAR融合蛋白。

其中步骤(1)是：CARD1编码序列为利用生物信息学软件优化和化学合成的大肠杆菌偏爱密码子序列，以便在重组大肠杆菌中高水平表达；用CAR蛋白两个胞外区之间的间隔序列作为CARD1与ELP之间的弹性间隔序列，以便CARD1在融合蛋白上自由折叠和展示。

本发明还公开了所述的ELP-CAR融合蛋白在重组腺病毒浓缩和纯化中的应用，其具体方法如下：

(1)将120μg/ml ELP-CAR融合蛋白与重组腺病毒感染细胞裂解物或培养上清混合；

(2)用确1.5M氯化钠和26℃离心沉淀重组腺病毒；

(3)用pH9.0缓冲液洗脱重组腺病毒；

(4)用1.5M氯化钠和26℃离心去除ELP-CAR融合蛋白。

进一步地，公开了上述融合蛋白在浓缩与纯化表达绿色荧光蛋白重组腺病毒中的应用。本发明采用了以下方法对融合蛋白进行验证：

(1)用聚合酶链式反应(PCR)扩增绿色荧光蛋白(GFP)编码序列，插入腺病毒载体pShuttle-CMV，获得重组载体pShuttle-GFP；

(2)按照常规方法用AAV-293细胞制备重组腺病毒rAd-GFP；

(3)将120μg/ml ELP-CAR融合蛋白与重组腺病毒感染细胞裂解物或培养上清混合；

(5)用1.5M氯化钠和26℃离心沉淀重组腺病毒；

(6)用pH9.0缓冲液洗脱重组腺病毒；

(7)用1.5M氯化钠和26℃离心去除ELP-CAR融合蛋白。

与现有的其他方法相比，用本发明的类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白浓缩和纯化重组腺病毒具有简单、快速和经济等优点，制备的重组腺病毒可以用于动物实验研究和基因工程疫苗。

附图说明：

图1ELP-CAR融合表达载体的结构示意图。PT7为T7启动子，ELP为类弹性蛋白多肽编码序列，Spacer为CARD1与D2结构域间隔序列，CARD1为CARD1结构域编码序列。

图2ELP-CAR融合蛋白的表达与纯化及电泳分析。1是空载体转化菌裂解液，2为IPTG诱导pET-ELP-CAR重组菌裂解液离心上清，3为IPTG诱导pET-ELP-CAR重组菌裂解液离心沉淀，4为第一轮相变循环后的ELP-CAR，5为第二轮相变循环后的ELP-CAR。

图3ELP-CAR融合蛋白的免疫转印鉴定。1为His-ELP融合蛋白，2为ELP-CAR融合蛋白。

图4ELP-CAR融合蛋白与重组腺病毒的吸附。1为rAd-GFP阳性对照，2为His-ELP融合蛋白与rAd-GFP结合的离心沉淀，3为His-ELP融合蛋白与rAd-GFP结合的离心上清，4为ELP-CAR融合蛋白与rAd-GFP结合的离心沉淀，3为ELP-CAR融合蛋白与rAd-GFP结合的离心上清。

图5重组腺病毒的洗脱。横坐标为洗脱时间，纵坐标为洗脱重组腺病毒的病毒回收率。

图6纯化重组腺病毒感染细胞的荧光显微镜观察。PK-15(CAR⁺)表示CAR表达阳性猪肾PK-15细胞，CHO-K1(CAR^low)表示CAR低水平表达仓鼠卵巢细胞，NIH 3T3(CAR^-)为CAR表达阴性小鼠胚胎成纤维细胞，rAd-GFP表示洗脱重组腺病毒感染细胞，ELP-CAR/rAd-GFP表示未洗脱重组腺病毒感染细胞。

图7纯化重组腺病毒的细胞感染效率。横坐标为用于感染的洗脱和未洗脱重组腺病毒，纵坐标为感染效率，+FBS代表细胞培养液含犊牛血清，-FBS代表细胞培养液不含犊牛血清。

具体实施步骤

生物材料来源：

1.pET-30a载体：从美国Novagen公司引进，本实验室保存。

2.DH5a大肠杆菌：从美国BD Biosciences Clontech公司引进，本实验室保存。

3.BLR(DE3)大肠杆菌：从美国Novagen公司引进，本实验室保存。

4.pShuttle-CMV载体：从美国Stratagene公司引进，本实验室保存。文献：Benihoud K,Yeh P,Perricaudet,M.Adenovirus vectors for gene delivery.Current Opinion in Biotechnology,1999,10(5):440-447.

5.pEGFP-N1载体：从美国BD Biosciences Clontech公司引进。文献：Prasher DC,Eckenrode VK,Ward WW,et al.Primary structure of the aequorea victoria green fluorescentprotein.Gene,1992,111(2):229-233.

6.pET/EI-GFP载体：从美国普林斯顿大学引进，本实验室保存。文献：Fong BA,WoodDW.Expression and purification of ELP-intein-tagged target proteins in high cell density E.coli fermentation.Microbial Cell Factories,2010,9:77.

7.pUC57载体：从美国GeneScript公司引进，本实验室保存。

8.PK-15细胞：从美国ATCC引进(ATCC CCL-33)，本实验室保存。

9.NIH 3T3细胞：从美国ATCC(CRL1658)引进，本实验室保存。

10.CHO-K1细胞：从美国ATCC(CCL-61)引进，本实验室保存。

11.AAV-293细胞：从美国Stratagene公司引进，本实验室保存。

具体操作步骤如下：

1.ELP-CAR融合表达载体构建

(1)利用在线软件JAVACodonAdaption Tool(文献：GroteA,Hiller K,Scheer M,Münch R,B,Hempel DC,Jahn D.JCat:a novel tool to adapt codon usage of a target gene to itspotential expression host.NucleicAcids Res.2005，1：33)，将CAR D1结构域编码序列(GenBankAccession No:NM_001207066)优化成大肠杆菌(K12株)偏爱密码子序列，由南京金斯瑞生物有限公司合成，克隆在pUC57质粒载体中。

(2)设计下列1对引物，正向引物引入EcoRI酶切位点和CAR D1与D2结构域间隔序列(GenBankAccession No:NM_001207066)，反向引物引入XbaI酶切位点：

正向引物：

5-GGTGAATTCCTGGTTAAACCGTCTGGTGCTCGTTGCTACGTTGACGGTTCTGAAGAAATCGGTTCTGACTTCTCTATCACCACCCCG-3(SEQ ID NO.1)；

反向引物：5-GGTTCTAGATTAACCAGACGGTTTAACCAGAA-3(SEQ ID NO.2)。

以含CARD1结构域序列的pUC57质粒为模板，按照Ex Taq^TMpolymerase(KaTaRa公司)说明书，用PCR扩增带有间隔序列的CARD1结构域序列，用限制酶EcoRI和XbaI消化后备用。

(3)用限制酶EcoRI和XbaI消化pET/EI-GFP载体,电泳分离后胶回收切除GFP序列的载体片段，与上述CARD1结构域序列连接，获得重组载体pET-ELP-CAR(图1)。

(4)用限制酶EcoRI和XbaI对重组载体pET-ELP-CAR进行酶切鉴定，结果能释放出预期大小的插入片段；将重组质粒送南京金斯瑞生物有限公司进行序列测定，结果显示插入序列无突变。

2.ELP-CAR融合蛋白的诱导表达与纯化

(1)将重组质粒pET-ELP-CAR转化BLR(DE3)大肠杆菌，在氨苄青霉素(100μg/mL)LB平板培养过夜；挑取单菌落接种5mL氨苄青霉素LB，37℃摇床培养过夜，4℃、8000g离心10min；沉淀菌体以等体积LB重悬，以1:100比例接种500mL氨苄青霉素2×YT培养液(Tryptone 16g，Yeast Extract 10g，Nacl 5g)，37℃、230rpm培养至OD₆₀₀＝0.8；加入0.5mmol/LIPTG，20℃、150rpm诱导表达24h；4℃、4000g离心10min，沉淀菌体用PBS(pH7.4)离心洗涤3次；将少量重组菌体用PBS悬浮，用超声波仪裂解后离心，分别收集上清和沉淀进行电泳分析，结果显示重组菌能表达预期的62kDa ELP-CAR融合蛋白，表达产物存在于裂解菌体的离心上清中(图2)。

(2)用50mL PBS(pH7.4)重悬其余菌体，按照细胞破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)在4℃裂解2次(1300bar)；4℃、16000g离心20min，收集上清液；用Super-Bradford蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)测定菌体裂解液蛋白浓度，用PBS调整蛋白浓度为5mg/mL。

(3)ELP-CAR融合蛋白的相变温度测定参考文献(Kang HJ,Kim JH,Chang WJ.Heterologous expression and optimized one-step separation of levansucrase via elastin-likepolypeptides tagging system.Microbiology and Biotechnology,2007,17(11):1751-1757)进行,所用氯化钠浓度为1.5mol/L，测得的ELP-CAR融合蛋白的相变温度为26℃。

(4)纯化ELP-CAR融合蛋白的温度敏感相变循环参考文献(Shen Y,Ai HX,Song R,et al.Expression and purification of moricin CM4and human beta-defensins 4in Escherichia coli usinga new technology.Microbiological Research,2010,101:229-240)进行，所用氯化钠终浓度为1.5mol/L，孵育条件为26℃、10min，离心条件为室温、14000g、5min，收集的沉淀即为初步纯化的ELP-CAR融合蛋白；在相同条件下重复相变循环1次，取部分纯化产物进行12％SDS-PAGE分析，结果显示纯化的ELP-CAR融合蛋白为单一条带(图2)。

(5)按照与纯化ELP-CAR融合蛋白同样的方法，从pET-ELP重组大肠杆菌纯化His-ELP融合蛋白；取His-ELP和ELP-CAR融合蛋白各10μL(0.5mg/mL)进行SDS-PAGE分离，按照蛋白转印系统(Bio-Rad公司)说明书转印(80V，2h)硝酸纤维素膜，用常规Western-blotting对ELP-CAR融合蛋白进行鉴定，一抗为1：500CAR特异抗体(上海圣克鲁斯生物技术有限公司产品)，二抗为1：10000稀释Dylight^TM800 labeled Goat anti-Mouse IgG(KPL公司),杂交信号用Odyssey红外荧光扫描成像系统(美国LI-COR公司)扫描成像。结果显示：CAR特异抗体与ELP-CAR融合反应阳性，与His-ELP融合蛋白反应阴性(图3)。

3.重组腺病毒的构建

(1)根据pEGFP-N1载体中GFP基因序列设计下列引物：

正向引物：5-ATCTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3(引入XhoI位点)(SEQ IDNO.3)；

反向引物：5-CGAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTCC-3(引入HindIII位点)(SEQ IDNO.4)。

以pEGFP-N1载体为模板，按照Ex Taq^TMpolymerase(KaTaRa公司)说明书进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示扩增产物为预期的736bp；将PCR产物插入pShuttle-CMV的XhoI/HindIII位点，获得重组载体pShuttle-GFP。

(2)按照AdEasy^TMAdenoviral Vector System(Agilent Technologies)说明书和文献(Benihoud K,Yeh P,Perricaudet,M.Adenovirus vectors for gene delivery.Current Opinion inBiotechnology,1999,10(5):440-447)制备重组腺病毒rAd-GFP；参考同样文献用AAV-293细胞扩增重组腺病毒，在AAV-293细胞上进行病毒滴定，根据GFP阳性细胞数计算重组腺病毒的滴度(荧光形成单位)为10⁸FFU/mL。

4.ELP-CAR融合蛋白结合重组腺病毒的测定

(1)取30μL rAd-GFP与100μL(0.1mg/mL)ELP-CAR或His-ELP混匀，4℃孵育1h；加入等体积3mol/LNaCl，26℃孵育10min；26℃、14000g离心5min，收集上清；沉淀用PBS离心洗涤3次，然后用等体积PBS重悬。

(2)分别以上述离心上清和沉淀为模板，以GFP基因特异引物进行PCR扩增，结果显示：在ELP-CAR与重组腺病毒的离心沉淀中可以扩增出GFP基因，而在His-ELP与重组腺病毒的离心沉淀中不能扩增出相应的条带(图4)，表明ELP-CAR可与重组腺病毒特异结合。

5.ELP-CAR融合蛋白纯化重组腺病毒的条件优化

(1)在T75细胞培养瓶中培养AAV-293细胞，在细胞密度为90％时进行rAd-GFP感染(感染指数为2)，感染后48h收集细胞培养液；向瓶中加入同体积PBS，反复冻融细胞3次；将细胞培养液和细胞裂解液在1000rpm离心5min，分别收集上清液，按照上述方法进行病毒滴定，结果显示细胞培养液中的重组病毒滴度为4.2×10⁷FFU/mL，裂解细胞中的重组病毒滴度为1.5×10⁸FFU/mL。

(2)用pH7.0PBS将ELP-CAR融合蛋白稀释为5、20、60、120、180μg/mL，各取30μL与同体积病毒液混合，加PBS至300μL，4℃孵育2h；加入300μL(3mol/L)氯化钠，26℃孵育10min；室温14000g离心5min；沉淀用PBS离心洗涤3次，用30μL PBS(pH7.0)溶解，在AAV-293细胞上进行病毒滴定，设3孔重复，感染后48h观察结果。结果显示ELP-CAR融合蛋白与重组腺病毒结合具有剂量依赖关系，120μg/mL融合蛋白结合和沉淀的重组腺病毒为81％。

(3)将30μL(1.2mg/mL)ELP-CAR融合蛋白与同体积病毒液混合，分别加pH4.0、pH6.0、pH7.0、pH8.0、pH10的PBS至300μL，4℃孵育2h；如前加入氯化钠离心沉淀重组腺病毒，结果显示ELP-CAR与重组腺病毒结合的最适pH为7.0。

(4)将30μL(1.2mg/mL)ELP-CAR与同体积病毒液混合，加pH7.0的PBS至300μL，分别在0、4、18、26、37℃孵育2h；如前加入氯化钠离心沉淀重组腺病毒，结果显示ELP-CAR与重组腺病毒结合的最适温度为18℃。

(5)将30μL(1.2mg/mL)ELP-CAR与同体积病毒液混合，加pH7.0的PBS至300μL，在18℃孵育5、15、30、60、120min；如前加入氯化钠离心沉淀重组腺病毒，结果显示ELP-CAR与重组腺病毒结合的最适时间为30min(图5)。

(6)将30μL(1.2mg/mL)ELP-CAR分别与同体积重组病毒感染细胞培养液和细胞裂解液混合，加pH7.0的PBS至300μL，在18℃孵育30min；如前加入氯化钠离心沉淀重组腺病毒，结果显示用ELP-CAR融合蛋白从重组病毒感染细胞培养液沉淀重组腺病毒的回收率为76.2％，从细胞裂解液沉淀重组腺病毒的回收率为73.3％。

6.重组腺病毒的洗脱

(1)分别用pH3、pH5、pH7、pH8、pH9、pH10、pH11的PBS溶解上述沉淀的重组腺病毒，室温孵育30min；如前加入氯化钠离心沉淀重组腺病毒和进行病毒滴定，结果显示从ELP-CAR融合蛋白洗脱重组腺病毒的最适pH为9.0。

(2)用pH9.0的PBS溶解上述沉淀的重组腺病毒，分别在4、16、20、37℃孵育30min；如前加入氯化钠离心沉淀融合蛋白，取离心上清进行重组腺病毒滴定，结果显示从ELP-CAR融合蛋白洗脱重组腺病毒的最适温度为20℃。

(3)用pH9.0的PBS溶解上述沉淀的重组腺病毒，在20℃孵育5、10、30、60、90min；如前加入氯化钠离心沉淀融合蛋白，取离心上清进行重组腺病毒滴定，结果显示从ELP-CAR融合蛋白洗脱重组腺病毒的最适时间为10min。

(4)用pH9.0的PBS分别溶解从细胞培养液和细胞裂解液沉淀的重组腺病毒，在20℃孵育10min；如前加入氯化钠离心沉淀融合蛋白，取离心上清进行重组腺病毒滴定，结果显示洗脱重组腺病毒的回收率分别为30.6％和34.5％。

7.纯化重组腺病毒的感染性检测

(1)在24孔板培养CAR表达阳性PK-15细胞、低水平表达CHO-K1细胞和表达阴性NIH 3T3细胞，分别用上述洗脱和未洗脱重组腺病毒感染，感染指数为20，感染后48h进行荧光显微镜观察，结果显示：洗脱和未洗脱的重组腺病毒均能感染PK-15和CHO-K1细胞，但不能感染NIH 3T3细胞(图6)，表明重组腺病毒表面结合一定数量的ELP-CAR融合蛋白不影响其细胞感染谱。

(2)用含或不含10％犊牛血清DMEM细胞培养液稀释洗脱和未洗脱的重组腺病毒，分别感染PK-15和CHO-K1细胞，感染后36h用流式细胞仪计数GFP阳性细胞数，结果显示：在无犊牛血清存在时，洗脱和未洗脱重组腺病毒对PK-15细胞的转导效率分别为63.5％和44.8％，对CHO-K1细胞的转导效率分别为38.8％和25.6％；在有10％犊牛血清存在时，洗脱和未洗脱重组腺病毒对PK-15细胞的转导效率分别为57.3％和38.5％，对CHO-K1细胞的转导效率分别为14.9％和13.4％(图7)，表明对于CAR阳性PK-15细胞而言，洗脱和未洗脱的重组腺病毒均能有效转导，而且受犊牛血清的影响较小；对于CAR表达水平低的CHO-K1细胞而言，洗脱组腺病毒的转导效率显著高于未洗脱重组腺病毒，而且受犊牛血清的影响较大。

Claims (6)

1.一种类弹性蛋白多肽(ELP)与柯萨奇腺病毒受体(CAR)融合蛋白(ELP-CAR)，由ELP、间隔区和CAR-D1区组成。

2.权利要求1所述的类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白的制备方法，其步骤如下：

(1)依次将ELP、间隔区和CAR-D1区编码序列插入原核表达载体pET-30a，获得重组载体pET-ELP-CAR；

(2)将重组载体pET-ELP-CAR转化大肠杆菌，在低温条件下进行ELP-CAR融合蛋白诱导表达；

(3)用1.5M氯化钠和26℃离心沉淀ELP-CAR融合蛋白。

3.根据权利2所述的方法，其特征在于：步骤(1)是：CAR-D1编码序列为人工优化的大肠杆菌偏爱密码子序列；用CAR蛋白两个胞外区之间的间隔序列作为CARD1与ELP之间的间隔区序列。

4.权利要求1所述的类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白在重组腺病毒浓缩和纯化中的应用。

5.权利要求4所述的ELP-CAR融合蛋白在重组腺病毒浓缩和纯化中的应用，其具体方法如下：

(1)将120μg/ml ELP-CAR融合蛋白重组腺病毒感染细胞裂解物或培养上清与混合；

(2)用1.5M氯化钠和26℃离心沉淀重组腺病毒；

(3)用pH9.0缓冲液洗脱重组腺病毒；

(4)用1.5M氯化钠和26℃离心去除ELP-CAR融合蛋白。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：步骤(2)是：沉淀的重组腺病毒直接用于动物体内外试验；步骤(3)和(4)是：纯化的重组腺病毒纯度及内毒素含量符合动物生物制品的相关标准。