CN102660550A - 基因重组人胸腺素β4的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种基因重组人胸腺素β4的制备方法，包括基因的获得、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白和毕赤酵母电转化人胸腺素β4的连接、多拷贝插入重组子的筛选、基因重组人胸腺素β4融合蛋白毕赤酵母发酵、基因重组人胸腺素β4的纯化步骤。本发明利用人I型人胶原蛋白在毕赤酵母的高表达特性引导人胸腺素β4在毕赤酵母中稳定高效表达。在融合蛋白的I型人胶原蛋白前导肽与人胸腺素β4之间引入肠激酶切位点，避免了人胸腺素β4因为分子量较小，表达、纯化过程中所遇到的难题，增加了表达量，简化了纯化程序，提高了产品的提取纯化效率，可用于制备基因重组人胸腺素β4。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用毕赤酵母表达的基因重组人胸腺素β4的制备方法。
背景技术
胸腺素（Thymosins）是由胸腺产生的一种淋巴生长因子，由Goldstein和White于1966年首次从胎牛胸腺蛋白提取液中发现，是一组小分子多肽，含有40多种组分。根据这些多肽在等电聚焦电泳分析图谱上的位置，可以划分为α、β、γ三型：PI（α）<5，5<PI（β）<7，PI（γ）>7。目前已经有20多种β胸腺肽异构体被鉴定出来，而人体内主要存在三种胸腺素β4、胸腺素β10和胸腺素β15，其中胸腺素β4含量最高。胸腺素β4是由43个氨基酸组成，结构高度保守的水溶性多肽，N末端具有乙酰化修饰，平均分子量为4964Da，等电点为5.1。
胸腺素β4被认为是主要的球形肌动蛋白结合肽，能与球形肌动蛋白单体结合从而阻断其聚合，具有免疫调节的功能，是一种在多种组织均有表达的蛋白多肽，在液体，血液中均存在。大量的研究表明胸腺素β4能够诱导内皮细胞分化，促进血管生成，并能促进创伤愈合和心肌梗塞时心肌细胞的存活和血管生成。胸腺素β4在治疗皮肤、角膜创伤，治疗心肌梗塞，抗肿瘤治疗，抗炎等方面有着广阔的应用前景，目前胸腺素β4在治疗创伤、心肌梗塞等方面已经进入临床试验。
目前临床和研究中使用的胸腺素β4的来源主要有两种，一是从小牛胸腺提取，二是化学合成。从小牛胸腺中提取胸腺素β4不仅成本高，且受材料来源和提取技术的限制，其纯度不高，含量较低；而杂质多也带来许多问题，尤其是目前牛的病毒越来越多，给动物提取也带来麻烦。随着基因工程的发展，利用基因工程手段来生产胸腺素β4将成为一个新的方向。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述胸腺素β4生产成本高、纯度底的缺点，提供一种所得产品纯度高、生产成本低、简单有效的基因重组人胸腺素β4的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是：以I型人胶原蛋白作为前导肽引导人胸腺素β4表达的基因重组人胸腺素β4融合蛋白，I型人胶原蛋白的氨基酸序列为：
1 GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA
61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ
121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVPGDLGA PGPSGARGER
181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP
241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP
301 GDRGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP
361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP
421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS
481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET
541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKSGDRGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET
基因重组人胸腺素β4融合蛋白的氨基酸序列为：
1 GVAGPKGPAG ERGSPGPAGP KGSPGEAGRP GEAGLPGAKG LTGSPGSPGP DGKTGPPGPA
61 GQDGRPGPPG PPGARGQAGV MGFPGPKGAA GEPGKAGERG VPGPPGAVGP AGKDGEAGAQ
121 GPPGPAGPAG ERGEQGPAGS PGFQGLPGPA GPPGEAGKPG EQGVPGDLGA PGPSGARGER
181 GFPGERGVQG PPGPAGPRGA NGAPGNDGAK GDAGAPGAPG SQGAPGLQGM PGERGAAGLP
241 GPKGDRGDAG PKGADGSPGK DGVRGLTGPI GPPGPAGAPG DKGESGPSGP AGPTGARGAP
301 GDRGEPGPPG PAGFAGPPGA DGQPGAKGEP GDAGAKGDAG PPGPAGPAGP PGPIGNVGAP
361 GAKGARGSAG PPGATGFPGA AGRVGPPGPS GNAGPPGPPG PAGKEGGKGP RGETGPAGRP
421 GEVGPPGPPG PAGEKGSPGA DGPAGAPGTP GPQGIAGQRG VVGLPGQRGE RGFPGLPGPS
481 GEPGKQGPSG ASGERGPPGP MGPPGLAGPP GESGREGAPG AEGSPGRDGS PGAKGDRGET
541 GPAGPPGAPG APGAPGPVGP AGKSGDRGET GPAGPAGPVG PVGARGPAGP QGPRGDKGET
601 EFDDDDKSDK PDMAEIEKFD KSKLKKTETQ EKNPLPSKET IEQEKQAGES
基因重组人胸腺素β4融合蛋白的氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸组成的前导肽，碳端为人胸腺素β4的43个氨基酸，两段氨基酸序列之间添加肠激酶切割位点、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表达后，在体外经肠激酶切割获得基因重组人胸腺素β4。基因重组人胸腺素β4的氨基酸序列如下：
1 SDKPDMAEIE KFDKSKLKKT ETQEKNPLPS KETIEQEKQA GES
上述基因重组人胸腺素β4的制备方法包括下述步骤：
1、基因的获得
从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I、EcoR I，I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物的序列为：
F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGT
R:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG
采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因，I型人胶原蛋白基因的核苷酸序列为:
1 CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT
61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC
121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT
181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT
241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG
301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT
421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA
481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA
601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT
661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT
721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT
781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC
841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT
901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT
1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT
1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT
1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT
1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA
1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT
1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG
1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC
1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT
1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT
1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT
1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT
1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT
1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT
1801 GAGACAGAAT TC
设计并全基因合成人胸腺素β4的核苷酸序列，氨基酸序列不变，同时添加限制性内切酶酶切位点EcoR I、Not I、肠激酶切割位点GATGACGATGACAAG，人胸腺素β4的核苷酸序列如下：
1 GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT
61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC
121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C
2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、人胸腺素β4的连接
对pPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL1；对pPIC9K-COL1质粒与人胸腺素β4分别进行EcoR I、Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL1-Tβ4；该重组DNA序列如下：
1 CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT
61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC
121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT
181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT
241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG
301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT
421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA
481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA
601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT
661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT
721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT
781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC
841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT
901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT
1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT
1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT
1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT
1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA
1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT
1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG
1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC
1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT
1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT
1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT
1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT
1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT
1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT
1801 GAGACAGAAT TCGATGACGA TGACAAGTCT GACAAACCCG ATATGGCTGA GATTGAGAAG
1861 TTCGATAAGT CTAAGTTGAA GAAGACTGAG ACTCAAGAGA AGAATCCATT GCCTTCCAAG
1921 GAGACCATTG AGCAGGAGAA GCAGGCCGGT GAATCTTAAG CGGCCGC
3、毕赤酵母电转化
将10μg经Sal I内切酶线性化的pPIC9K-COL1-Tβ4质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，GS115感受态细胞购于西安依科生物技术有限公司，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇水溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落。
4、多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子，G418购于西安依科生物技术有限公司。
5、基因重组人胸腺素β4融合蛋白毕赤酵母发酵
将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃、诱导温度29℃、pH值为4.5、溶氧控制在20%～30%，流加入质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液的体积比为1∶0.25，诱导发酵36～42小时。
6、基因重组人胸腺素β4的纯化
发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为0.1μm的中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，用分子量为10000D或30000D或40000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β4粗蛋白用装有DEAESepharose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β4。
在本发明的基因重组人胸腺素β4的纯化步骤6中，发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为0.1μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，用分子量为30000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β4粗蛋白用装有DEAE Sepharose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β4。
本发明的肠激酶切割方法为：用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为6.0～8.0，16℃切割18小时。
本发明的肠激酶切方法为：用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH最佳为8.0，16℃切割18小时。
本发明利用人I型人胶原蛋白在毕赤酵母的高表达特性引导人胸腺素β4在毕赤酵母中稳定高效表达。在融合蛋白的I型人胶原蛋白前导肽与人胸腺素β4之间引入肠激酶切位点，避免了人胸腺素β4因为分子量较小，表达、纯化过程中所遇到的难题，增加了表达量，简化了纯化程序，提高了产品的提取纯化效率，可用于制备基因重组人胸腺素β4。
附图说明
图1是实施例1中载体pPIC9K-COL1-Tβ4的质粒图谱。
图2是实施例1中I型人胶原蛋白基因的PCR产物电泳图。
图3是实施例1中pPIC9K-COL1-Tβ4质粒双酶切鉴定电泳图。
图4是实施例1中人胸腺素β4的Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图5是实施例1中人胸腺素β4的Western Blot鉴定图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
实施例1
以I型人胶原蛋白作为前导肽引导人胸腺素β4表达的基因重组人胸腺素β4融合蛋白，氮端为I型人胶原蛋白的600个氨基酸组成的前导肽，碳端为人胸腺素β4的43个氨基酸，两段氨基酸序列之间添加肠激酶切割位点、用于连接的谷氨酸和苯丙氨酸，分泌表达后，在体外经肠激酶切割获得基因重组人胸腺素β4，基因重组人胸腺素β4的氨基酸序列如前所述。
上述基因重组人胸腺素β4的制备方法包括下述步骤：
1、基因的获得
从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，采用GeneCopoeia First-Strand cDNA synthesis Kit试剂盒按说明书的使用方法进行反转录，获得cDNA，GeneCopoeia First-Strand cDNA synthesisKit试剂盒由西安依科生物技术有限公司销售。根据GeneBank已发表的I型人胶原蛋白基因序列，按照引物设计原则，设计I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，同时引入限制性酶切位点Xho I、EcoR I，I型人胶原蛋白基因（COL1）PCR扩增引物的序列为：
F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGT
R:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG
25μL反应体系中含有：13.3μL灭菌的二次蒸馏水、2.5μL 10×PCR buffer，3.5μL 2mmol/L dNTP Mix，2.5μL MgCl2，1μL 10μmol/L Primer F，1μL 10μmol/L Primer R，0.2μL0.5U/μL Taq酶，1μL cDNA模板。反应条件为：95℃5分钟，94℃30秒，56℃30秒，72℃60秒，30个循环，72℃10分钟，4℃10分钟，用PCR仪进行扩增。I型人胶原蛋白的PCR扩增结果见图2，由图可见，在1800bp处出现特异性条带，与I型人胶原蛋白设计的预期结果一致。
重新设计并全基因合成人胸腺素β4（Tβ4）的核苷酸序列，氨基酸序列不变，同时添加限制性内切酶酶切位点EcoR I、Not I及肠激酶切割位点GATGACGATGACAAG，其核苷酸序列如下：
1 GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT
61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC
121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C
2、载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、人胸腺素β4的连接
（1）载体pPIC9K和I型人胶原蛋白的双酶切
对载体pPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，pPIC9K载体购于美国Invitrogen公司。双酶切体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2小时，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书，从质量浓度为1.5%琼脂糖凝胶上回收特异性条带。
（2）载体pPIC9K与I型人胶原蛋白的连接
用T4 DNA连接酶对上述的双酶切回收产物pPIC9K与COL1进行连接，反应体系如下：
上述连接体系充分混匀后，于16℃连接12小时。
（3）载体pPIC9K与I型人胶原蛋白连接产物的转化
取冷冻的DH5α感受态细胞一管100μL，放于冰上解冻，加入上述连接产物，手指轻弹使其混合，在冰中放置30分钟，42℃水浴热激90秒，将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3分钟，加入800μL无抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃温育50分钟，吸取100～200μL，涂于含浓度为50μg/mL卡那霉素的固体LB平板上，将固体LB平板倒置于37℃培养箱中，培养12～18小时，挑选单菌落接种于含浓度为50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，摇床37℃过夜培养，用质粒提取试剂盒按操作说明提取质粒，质粒命名为pPIC9K-COL1。
（4）pPIC9K-COL1和人胸腺素β4双酶切
对上述提取的pPIC9K-COL1质粒和合成的人胸腺素β4用EcoR I和Not I进行双酶切。双酶切体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴消化2小时，用DNA纯化试剂盒，按产品说明书从质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶上回收特异性条带。
（5）pPIC9K-COL1与人胸腺素β4的连接
用T4 DNA连接酶对上述的pPIC9K-COL1与人胸腺素β4双酶切回收产物进行连接，反应体系如下：
连接体系充分混匀后，于16℃连接12小时。
（6）pPIC9K-COL1与人胸腺素β4连接产物的转化
按载体pPIC9K与I型人胶原蛋白前导肽连接产物的转化（3）方法进行转化，提取质粒命名为pPIC9K-COL1-Tβ4。
构建的基因重组人胸腺素β4融合蛋白表达载体的质粒图谱见图1，基因重组人胸腺素β4融合蛋白重组DNA序列如下：
1 CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT
61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC
121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT
181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT
241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG
301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT
421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA
481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA
601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT
661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT
721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT
781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC
841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT
901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT
1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT
1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT
1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT
1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA
1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT
1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG
1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC
1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT
1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT
1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT
1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT
1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT
1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT
1801 GAGACAGAAT TCGATGACGA TGACAAGTCT GACAAACCCG ATATGGCTGA GATTGAGAAG
1861 TTCGATAAGT CTAAGTTGAA GAAGACTGAG ACTCAAGAGA AGAATCCATT GCCTTCCAAG
1921 GAGACCATTG AGCAGGAGAA GCAGGCCGGT GAATCTTAAG CGGCCGC
（7）pPIC9K-COL1-Tβ4的酶切鉴定
根据pPIC9K-COL1-Tβ4重组质粒的酶切位点分析，选用Xho I与Not I、EcoR I与Not I两组酶切体系进行酶切鉴定，酶切体系如下：
以上两组酶切体系在37℃水浴中反应2小时后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果见图3,从图3可见，经Xho I与Not I双酶切，可切出2000bp大小的条带，EcoR I与Not I双酶切，可切出150bp大小的条带，均与预期目标一致。
3、毕赤酵母电转化
对pPIC9K-COL1-Tβ4质粒进行Sal I线性化，反应体系如下：
上述试剂加好后，混匀，37℃水浴反应5小时，终止反应前先取出5μL以质量百分浓度为1.0%琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全，用DNA纯化试剂盒对线性化质粒进行回收。
取10μg上述Sal I内切酶线性化的pPIC9K-COL1-Tβ4质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电压1.5kV、电容25μF、电阻200Ω、电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落。
4、多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得高拷贝转化子。
5、基因重组人胸腺素β4融合蛋白的发酵
将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基（1L FBS含甘油40g、K2SO4 18.2g、H3PO4 26.7ml、CaSO4.2H2O 0.93g、MgSO414.9g、KOH 4.13g）的5L发酵罐中，温度设定为30℃，pH值为5.0，培养16～20小时，作为二级种子转接入装有80L FBS培养基的150L大罐。发酵过程中，生长温度30℃，诱导温度29℃，pH值为4.5，溶氧控制在20%～30%，当溶氧陡然上升时，预示基础盐培养基中的甘油已耗尽，开始流加18.15mL/h/L质量百分浓度为50%的甘油，在质量百分浓度为50％甘油中含12mL/L PTM1微量元素（1L PTM1含CuSO4.5H2O 6g、NaI 0.08g、MnSO4.H2O 3g、Na2MoO4.H2O 0.2g、H3BO3 0.02g、H2SO4 5ml、CoCl2.6H2O 0.5g、ZnCl2 20g、FeSO4.7H2O 75g、生物素0.2g），维持溶氧在20%～30%。发酵液的湿菌重达到300mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗尽，流加20L质量百分浓度为75%甲醇诱导发酵，在质量百分浓度为75%甲醇中含12mL/L PTM1微量元素，以速率为7.5ml/L/h流加2～3小时，然后提高速率至10.9ml/L/h流加进行发酵。通过调节转速、罐压和通气量使溶氧大于20%，诱导发酵36～42小时。
6、基因重组人胸腺素β4的纯化
（1）发酵液的固液分离及脱色
发酵结束后，发酵液通过离心进行固液分离，取上清液80L，用孔径为0.1μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，通过上述两步超滤法即可去除毕赤酵母发酵产生的大量黄绿色物质、小分子杂蛋白，同时达到脱盐浓缩的目的。
（2）肠激酶酶切
用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为8.0，16℃切割18小时，用分子量为30000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐浓缩，得人胸腺素β4粗蛋白液。
（3）离子交换层析
将人胸腺素β4粗蛋白进行阴离子交换层析，填料选用DEAE Sepharose FF，DEAE SepharoseFF购于美国GE公司，用3倍柱体积的pH为8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液平衡，上样，用10倍柱体积的含0.5mol/L NaCl的pH值为8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱，收集目标蛋白液，利用分子量为1000D的卷式超滤膜超滤脱盐浓缩，冻干机冻干，得基因重组人胸腺素β4，发酵上清液中基因重组人胸腺素β4表达量达440mg/L。
7、基因重组人胸腺素β4的检测及鉴定
（1）重组人胸腺素β4的Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
1.1配制试剂
低双丙烯酰胺母液:9.6g丙烯酰胺、0.3g甲叉双丙烯酰胺，溶于20ml水；
高双丙烯酰胺母液:9.3g丙烯酰胺、0.6g甲叉双丙烯酰胺，溶于20ml水；
凝胶缓冲液:2.422g三羟甲基氨基甲烷、0.02g十二烷基硫酸钠（SDS），溶于20ml水，盐酸调节pH至8.45；
阴极缓冲液:6.06g三羟甲基氨基甲烷+8.89g三(羟甲基)甲基甘氨酸（Tricine）、0.5g十二烷基硫酸钠（SDS），加水至500ml；
阳极缓冲液:12.11g三羟甲基氨基甲烷加水溶解，定容至500ml,用盐酸调pH至8.9；
固定液:30ml乙醇，0.5ml戊二醛，加水定容至100ml；
染色液:0.125g考马斯亮蓝R250、1ml冰醋酸、25ml甲醇，加水定容至100ml；
1.2配胶
①按如下体积配制质量百分浓度为16%的分离胶
向玻璃板间灌制约5.5mL分离胶，立即覆一层二次蒸馏水，聚合30分钟。
②按如下体积配制质量百分浓度为10%的间隔胶
将分离胶上层二次蒸馏水倾去，滤纸吸干，灌制1ml间隔胶，聚合30分钟。
③按如下体积配制质量百分浓度为4%的浓缩胶
间隔胶聚合后，灌制3ml浓缩胶，插入样品梳，30分钟后胶即可聚合。
1.3电泳
将40μL蛋白质样品与10μL上样缓冲液混合，放入水浴锅100℃加热5分钟。准备电泳时，在电泳槽底部加入阳极缓冲液，将制好的胶连同其装置放入电泳槽，在两块胶之间注入阴极缓冲液，用30V的电压预电泳10分钟，然后上样。当染料从间隔胶进入分离胶后，加大电压至90V，继续电泳直至染料到达胶底部，断开电源停止电泳，使用固定液固定20分钟，再染色2小时，脱色。电泳结果见图4，图4中所示为纯化后的人胸腺素β4电泳，与预期结果一致，经灰度值扫描，纯度为90%以上。
（2）基因重组人胸腺素β4的Western Blot蛋白免疫印迹鉴定
对纯化后的基因重组人胸腺素β4进行Tricine-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，放入电转移缓冲液中浸泡20分钟，同时浸泡6张滤纸，聚偏氟乙烯膜，从负极到正极:三层滤纸-凝胶-聚偏氟乙烯膜-三层滤纸，恒流300mA，电转移1小时。电转结束后，将聚偏氟乙烯膜用去离子水漂洗干净，将聚偏氟乙烯膜浸泡于含质量百分浓度为5%的牛血清白蛋白的TBS(1.21g三羟甲基氨基甲烷、8.8g氯化钠，加800ml水溶解后用盐酸调pH至7.5，再加水定容至1L)缓冲液中，室温封闭1小时，加入来源于兔的多克隆抗体(一抗，1∶500)，4℃过夜，以TBST（1L TBS中加入0.5ml吐温20）洗膜4次(10分钟/次)，加入辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(二抗，1∶1000)，37℃孵育1小时，以TBST洗膜4次，底物二氨基联苯胺（DAB）显色。Western Blot鉴定结果见图5，在5KD处有显色反应，出现特异性条带，与人胸腺素β4的分子量一致，由此表明，通过上述的制备方法所制备的基因重组人胸腺素β4，能与人胸腺素β4抗体产生免疫反应性，说明获得的是正确人胸腺素β4。
实施例2
在实施例1的基因重组人胸腺素β4的纯化步骤6中，用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，肠激酶切割法为：用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为6.0，16℃切割18小时。
用分子量为10000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白，该步骤中的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与实施例1相同，制备成基因重组人胸腺素β4。
实施例3
在实施例1的基因重组人胸腺素β4的纯化步骤6中，用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，肠激酶切割法为：用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为7.0，16℃切割18小时。
用分子量为40000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白，该步骤中的其他步骤与实施例1相同。其他步骤与实施例1相同，制备成基因重组人胸腺素β4。
Claims (4)
1.一种基因重组人胸腺素β4的制备方法，其特征在于它包括下述步骤：
（1）基因的获得
从离体新生儿胎盘组织中提取总RNA，反转录获得cDNA，设计I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物，引入限制性酶切位点Xho I、EcoR I，I型人胶原蛋白基因PCR扩增引物的序列为：
F:CGCTCGAGGGTGTTGCTGGTCCCAAGGGT
R:CGGAATTCTGTCTCACCCTTGTCACCACG
采用PCR方法扩增获得I型人胶原蛋白基因，I型人胶原蛋白基因的核苷酸序列为:
1 CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT
61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC
121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT
181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT
241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG
301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT
421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA
481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA
601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT
661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT
721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT
781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC
841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT
901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT
1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT
1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT
1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT
1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA
1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT
1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG
1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC
1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT
1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT
1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT
1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT
1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT
1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT
1801 GAGACAGAAT TC
设计并全基因合成人胸腺素β4的核苷酸序列，氨基酸序列不变，同时添加限制性内切酶酶切位点EcoR I、Not I、肠激酶切割位点GATGACGATGACAAG，人胸腺素β4的核苷酸序列如下：
1 GAATTCGATG ACGATGACAA GTCTGACAAA CCCGATATGG CTGAGATTGA GAAGTTCGAT
61 AAGTCTAAGT TGAAGAAGAC TGAGACTCAA GAGAAGAATC CATTGCCTTC CAAGGAGACC
121 ATTGAGCAGG AGAAGCAGGC CGGTGAATCT TAAGCGGCCG C
（2）载体pPIC9K与I型人胶原蛋白、人胸腺素β4的连接
对pPIC9K、I型人胶原蛋白进行Xho I和EcoR I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL1；对pPIC9K-COL1质粒与人胸腺素β4分别进行EcoR I、Not I双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接，转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-COL1-Tβ4；该重组DNA序列如下：
1 CTCGAGGGTG TTGCTGGTCC CAAGGGTCCC GCTGGTGAAC GTGGTTCTCC TGGCCCTGCT
61 GGCCCCAAAG GATCTCCTGG TGAAGCTGGT CGTCCCGGTG AAGCTGGTCT GCCTGGTGCC
121 AAGGGTCTGA CTGGAAGCCC TGGCAGCCCT GGTCCTGATG GCAAAACTGG CCCCCCTGGT
181 CCCGCCGGTC AAGATGGTCG CCCCGGACCC CCAGGCCCAC CTGGTGCCCG TGGTCAGGCT
241 GGTGTGATGG GATTCCCTGG ACCTAAAGGT GCTGCTGGAG AGCCCGGCAA GGCTGGAGAG
301 CGAGGTGTTC CCGGACCCCC TGGCGCTGTC GGTCCTGCTG GCAAAGATGG AGAGGCTGGA
361 GCTCAGGGAC CCCCTGGCCC TGCTGGTCCC GCTGGCGAGA GAGGTGAACA AGGCCCTGCT
421 GGCTCCCCCG GATTCCAGGG TCTCCCTGGT CCTGCTGGTC CTCCAGGTGA AGCAGGCAAA
481 CCTGGTGAAC AGGGTGTTCC TGGAGACCTT GGCGCCCCTG GCCCCTCTGG AGCAAGAGGC
541 GAGAGAGGTT TCCCTGGCGA GCGTGGTGTG CAAGGTCCCC CTGGTCCTGC TGGTCCCCGA
601 GGGGCCAACG GTGCTCCCGG CAACGATGGT GCTAAGGGTG ATGCTGGTGC CCCTGGAGCT
661 CCCGGTAGCC AGGGCGCCCC TGGCCTTCAG GGAATGCCTG GTGAACGTGG TGCAGCTGGT
721 CTTCCAGGGC CTAAGGGTGA CAGAGGTGAT GCTGGTCCCA AAGGTGCTGA TGGCTCTCCT
781 GGCAAAGATG GCGTCCGTGG TCTGACTGGC CCCATTGGTC CTCCTGGCCC TGCTGGTGCC
841 CCTGGTGACA AGGGTGAAAG TGGTCCCAGC GGCCCTGCTG GTCCCACTGG AGCTCGTGGT
901 GCCCCCGGAG ACCGTGGTGA GCCTGGTCCC CCCGGCCCTG CTGGCTTTGC TGGCCCCCCT
961 GGTGCTGACG GCCAACCTGG TGCTAAAGGC GAACCTGGTG ATGCTGGTGC TAAAGGCGAT
1021 GCTGGTCCCC CTGGCCCTGC CGGACCCGCT GGACCCCCTG GCCCCATTGG TAATGTTGGT
1081 GCTCCTGGAG CCAAAGGTGC TCGCGGCAGC GCTGGTCCCC CTGGTGCTAC TGGTTTCCCT
1141 GGTGCTGCTG GCCGAGTCGG TCCTCCTGGC CCCTCTGGAA ATGCTGGACC CCCTGGCCCT
1201 CCTGGTCCTG CTGGCAAAGA AGGCGGCAAA GGTCCCCGTG GTGAGACTGG CCCTGCTGGA
1261 CGTCCTGGTG AAGTTGGTCC CCCTGGTCCC CCTGGCCCTG CTGGCGAGAA AGGATCCCCT
1321 GGTGCTGATG GTCCTGCTGG TGCTCCTGGT ACTCCCGGGC CTCAAGGTAT TGCTGGACAG
1381 CGTGGTGTGG TCGGCCTGCC TGGTCAGAGA GGAGAGAGAG GCTTCCCTGG TCTTCCTGGC
1441 CCCTCTGGTG AACCTGGCAA ACAAGGTCCC TCTGGAGCAA GTGGTGAACG TGGTCCCCCT
1501 GGTCCCATGG GCCCCCCTGG ATTGGCTGGA CCCCCTGGTG AATCTGGACG TGAGGGGGCT
1561 CCTGGTGCCG AAGGTTCCCC TGGACGAGAC GGTTCTCCTG GCGCCAAGGG TGACCGTGGT
1621 GAGACCGGCC CCGCTGGACC CCCTGGTGCT CCTGGTGCTC CTGGTGCCCC TGGCCCCGTT
1681 GGCCCTGCTG GCAAGAGTGG TGATCGTGGT GAGACTGGTC CTGCTGGTCC CGCCGGTCCT
1741 GTCGGCCCTG TTGGCGCCCG TGGCCCCGCC GGACCCCAAG GCCCCCGTGG TGACAAGGGT
1801 GAGACAGAAT TCGATGACGA TGACAAGTCT GACAAACCCG ATATGGCTGA GATTGAGAAG
1861 TTCGATAAGT CTAAGTTGAA GAAGACTGAG ACTCAAGAGA AGAATCCATT GCCTTCCAAG
1921 GAGACCATTG AGCAGGAGAA GCAGGCCGGT GAATCTTAAG CGGCCGC
（3）毕赤酵母电转化
将10μg经Sal I内切酶线性化的pPIC9K-COL1-Tβ4质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇水溶液将菌体混匀，涂布MD培养基平板，30℃倒置培养2～3天，在MD培养基平板上长出菌落；
（4）多拷贝插入重组子的筛选
将MD培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到G418浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的YPD平板上，30℃培养，筛选获得转化子；
（5）基因重组人胸腺素β4融合蛋白毕赤酵母发酵
将筛选到的转化子接种于400ml BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L FBS培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有FBS培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃、诱导温度29℃、pH值为4.5、溶氧控制在20%～30%，流加入质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液，FBS培养基与质量浓度为75%的含12mL/L PTM1微量元素的甲醇水溶液的体积比为1∶0.25，诱导发酵36～42小时；
（6）基因重组人胸腺素β4的纯化
发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为0.1μm的中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，用分子量为10000D或30000D或40000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β4粗蛋白用装有DEAESepharose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β4，人胸腺素β4氨基酸序列如下：
1 SDKPDMAEIE KFDKSKLKKT ETQEKNPLPS KETIEQEKQA GES
2.根据权利要求1所述的基因重组人胸腺素β4的制备方法，其特征在于：在基因重组人胸腺素β4的纯化步骤（6）中，发酵结束后，发酵液离心分离，取上清液，用孔径为0.1μm中空纤维微滤系统进行微滤，收集滤过液，用分子量为10000D的卷式超滤膜超滤，收集浓缩液，得融合蛋白；用肠激酶切割法对融合蛋白进行切割，用分子量为30000D的超滤膜超滤，收集滤过液，再用分子量为1000D的超滤膜超滤除盐，得人胸腺素β4粗蛋白；对人胸腺素β4粗蛋白用装有DEAESepharose FF填料的层析柱进行层析分离，得基因重组人胸腺素β4。
3.根据权利要求1或2所述的基因重组人胸腺素β4的制备方法，其特征在于所述的肠激酶切割方法为：用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为6.0～8.0，16℃切割18小时。
4.根据权利要求3所述的基因重组人胸腺素β4的制备方法，其特征在于所述的肠激酶切方法为：用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，稀释至5mg/ml，加入重组肠激酶，每单位重组肠激酶切割5mg的融合蛋白，pH为8.0，16℃切割18小时。
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