CN101979505A - N-末端乙酰化蛋白或多肽的制备方法及其专用工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能产生N-末端乙酰化的蛋白质或多肽的方法及其专用工程菌。该重组工程菌，是将表达来自古细菌的乙酰化酶的表达盒整合到宿主菌染色体上，得到在染色体上表达古细菌乙酰化酶的重组菌；所述表达古细菌乙酰化酶的表达盒包括启动子和连接于启动子下游的古细菌乙酰化酶基因；所述古细菌乙酰化酶基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。用本发明工程菌可以直接获得完全N-末端乙酰化的蛋白或者多肽，如胸腺素α1和胸腺素β4，克服了传统基因工程技术中不能乙酰化或仅部分乙酰化的缺点，彻底实现了通过基因工程技术获得N-末端乙酰化胸腺素，具有很强的实际用途。

Description

N-末端乙酰化蛋白或多肽的制备方法及其专用工程菌

技术领域

本发明涉及一种制备N-末端乙酰化的多肽，尤其是胸腺素的方法及其专用工程菌。

背景技术

乙酰化是一种广泛存在的蛋白质修饰方式，存在于原核生物、古细菌和真核生物中，大约80～90％的哺乳动物细胞质蛋白、50％的酵母蛋白、少量的原核或古细菌蛋白质会发生乙酰化(Polevoda B，Sherman F.The diversity of acetylated proteins.Genome Biology，2002，3：1-6)。

乙酰化修饰对一些蛋白质的活性和稳定性有影响，如酶活性、酶稳定性、DNA结合、蛋白质-蛋白质相互作用、受体识别等等。在有些情况下，缺少乙酰化会导致蛋白质热稳定性的下降或其它动力参数的改变，或者复合体组装效率下降。酵母细胞中蛋白质的乙酰化修饰与细胞的生长、非发酵碳源的利用、芽胞生成等有关。在哺乳动物细胞中，乙酰化修饰与组织发育、细胞增殖和肿瘤发生等有关。N-末端乙酰化修饰对原肌球蛋白(tropomyosin)功能极其重要，无乙酰化修饰的原肌球蛋白不能与肌动蛋白(actin)结合，不能形成多聚体(Urbancikova M，and Hitchcock-DeGregori SE.Requirement of amino-terminal modification for striated musclealpha-tropomyosin function.J.Biol.Chem.，1994，269：24310-24315.)。对肽类药物而言，乙酰化修饰可以提高多肽在体内的半衰期，如乙酰化修饰的促黑素细胞激素的半衰期是非乙酰化修饰的3倍(Rudman D，Hollins BM，Kutner MB，Moffitt SD，Lynn MJ：Three types of α-melanocyte-stimulating hormone：bioactivity andhalf-lives.Am J Physiol 1983，245：E47-E54.)。

一些天然多肽类药物，如胸腺素α1(Tα1)和胸腺素β4(Tβ4)都含有N-末端乙酰化修饰。尽管体外研究表明非乙酰化修饰形式的胸腺素也具有生物活性，但是乙酰化修饰会增加多肽的体内稳定性。

胸腺素α1(Tα1)由28个氨基酸组成，具有N-末端乙酰化修饰，分子量3108kD，等电点4.2，结构保守，在各哺乳动物中结构一致，分布广泛，存在于哺乳动物各组织器官中，尤以胸腺中含量最高。Tα1是一种生物反应调节因子，主要是T淋巴系统的免疫增强剂，对NK细胞也有协同作用。Tα1联用干扰素治疗乙型肝炎与丙型肝炎、联用化学疗法或放射疗法或白介素-2(IL-2)治疗非小细胞肺癌和恶性黑色素瘤、联用叠氮胸苷和干扰素治疗免疫缺陷综合征等等临床试验都显示其有良好的治疗效果(刘玉英.胸腺素α1的研究进展.上海医药，2003，24(5)：211-216)。化学合成的Tα1已在中国、美国、日本等在内的多个国家批准临床应用，以治疗乙型肝炎、丙型肝炎和肺癌等发病率较高且严重危害人类健康的疾病。如美国SciClone制药公司生产的Tα1(商品名ZADAXIN)，在2006年销售额达到3243万美元(约合人民币2.5亿元)，其中90％来自中国市场，比2005年增加16％。在中国售价每支(1.6mg)近800元。如果能进一步降低生产成本，作为抗病毒、肿瘤治疗的辅助药物，Tα1在国内外的市场将会进一步扩大。

胸腺素β4(Tβ4)是一个具有N-末端乙酰化修饰的43肽。Tβ4是主要的肌动蛋白螯合肽，是真核细胞中肌动蛋白聚合的调节因子。肌动蛋白有许多重要功能，如细胞运动，细胞骨架的构建，微管形成等。这些功能受肌动蛋白丝的聚集和解聚调节，而肌动蛋白亚单位的聚合和解聚又受Tβ4调节(Allan L.Goldstein，Ewald Hannappe，and Hynda K.Kleinman.Thymosin β4：actin-sequestering protein moonlights torepair injured tissues.TRENDS in Molecular Medicine，2005，11(9)：421-429)。Tβ4存在于多数组织和各种类型细胞中，但不存在于红细胞中。在血小板、嗜中性粒细胞、巨噬细胞及其他淋巴细胞中浓度很高。在血小板中浓度最高，是首先进入伤口的细胞。Tβ4具有愈合伤口和抗炎作用。在皮肤(真皮)伤口，Tβ4通过促进角化细胞和内皮细胞迁移，促进胶原蛋白沉积，刺激血管生成等，引导伤口收缩和闭合。在小鼠角膜碱损伤模型中，Tβ4不仅促进表皮再植，而且减少了基质水肿，很少的炎性细胞侵染。炎性细胞侵染减少与炎性因子(IL-1β、MIP-2、MIP-1、MCP-1、KC)基因转录水平降低直接相关。近来还发现，Tβ4还能抑制转录因子NF-κB的激活和核迁移，NF-κB是炎性反应的主要调节因子。这可能是Tβ4的抗炎活性的机制。雷根内克斯(RegeneRx)制药有限公司正在进行Tβ₄的临床研究。2005年雷根内克斯公司被FDA批准开展一项皮肤II期临床试验，在此之前他们已经在成功完成了I期临床试验，结果显示出较好的人体耐受性且没有毒性。2007年他们又被FDA批准进行另外两项临床试验：手术后糖尿病人角膜修复II期临床试验和急性心肌梗塞I期A临床试验。目前该公司还有多项临床试验正在开展中，如：压力溃疡II期临床试验，大疱性表皮松解症II期临床试验，静脉阻滞溃疡II期临床试验，糖尿病患者角膜上皮细胞损伤II期临床试验，静脉给药的单次剂量和多次剂量的I期临床试验(David Crockford，Nabila Turjman，Christian Allan，and Janet Angel.Thymosin β4：structure，function，and biological properties supporting current and future clinicalapplications.Ann N Y Acad Sci，2010，1194：179-189)。

由于胸腺素的分子量小，并具有N-末端乙酰化修饰，难以用基因工程技术生产.目前国内外均采用化学合成方法生产N-末端乙酰化的Tα1和Tβ4。但由于化学合成成本高，用基因工程方法制备Tα1和Tβ4更具吸引力。曾有多人尝试利用基因工程技术表达Tα1，无论采用融合表达或者串联表达都不能获得N-末端乙酰化的Tα1和Tβ4(Esipov RS，Gurevich AI，Stepanenko VN，Chupova LA，Chuvikovsky DV，andMiroshnikov AI.Recombinant Thymosin α1.Russian Journal of BioorganicChemistry，2004，30：431-435.Xiankui Li，Lishu Zheng，Fuwang Peng，ChengyuQi，Xiaoguang Zhang，Anguang Zhou，Zhewei Liu，Shuhua Wu.Recombinant thymosinbeta 4 can promote full-thickness cutaneous wound healing.Protein Expressionand Purification，2007，56：229-236.)。非乙酰化重组产物可以通过化学方法进行乙酰化修饰，但无疑会增加生产成本(Roman S.Esipov，Vasily N.Stepanenko，Ksenia A.Beyrakhova，Tatjana I.Muravjeva and Anatoly I.Miroshnikov.Production of thymosin α1 via non-enzymatic acetylation of the recombinantprecursor.Biotechnol Appl Biochem，2010，56：17-25)。

蛋白质的N-末端乙酰化修饰是由N-末端乙酰转移酶(N-terminalacetyltransferases，NATs)将乙酰辅酶A的乙酰基团转移到蛋白质氨基末端的α-氨基上。

细胞内存在多种N-末端乙酰转移酶，分别负责不同类型氨基酸序列多肽的乙酰化修饰。迄今酵母细胞的N-末端乙酰转移酶研究较多。酵母有三类不同的N-末端乙酰转移酶：NatA、NatB、NatC，分别催化不同的底物群体(Polevoda B and Sherman F.N-terminal Acetyltransferases and Sequence Requirements for N-terminalAcetylation of Eukaryotic Proteins.J Mol Biol，2003，325：595-622.)。NatA催化Ser、Ala、Gly和Thr残基为末端的蛋白质乙酰化修饰，NatB催化Met-Glu、Met-Asp以及部分Met-Asn、Met-Met为末端残基的蛋白质乙酰化修饰，NatC催化Met-Ile、Met-Leu、Met-Trp和Met-Phe为末端残基的乙酰化修饰。真核生物的NATs都由二个或以上不同亚基组成。NatA至少有两个亚基Ard1p(27kDa)、Nat1p(99kDa)，NatB也有两个亚基Nat3p(23kDa)和Mdm20p(92kDa)，NatC由三个亚基组成：Mak3p(20kDa)、Mak10p(84kDa)和Mak31p(10kDa)。高等真核生物中也存在上述三种酶的催化亚基Ard1p、Nat3p和Mak3p的同源序列，但单个亚基没有催化乙酰转移的活性。

大肠杆菌中已知的N-末端乙酰转移酶有RimI、RimJ和RimL，分别与核糖体蛋白S18(N-Ala)、S5(N-Ala)和L12(N-Ser)的N-末端的Ala或Ser残基乙酰化有关(Yoshikawa A，Isono S，Sheback A，Isono K.Cloning and nucleotide sequencingof the genes rimI and rimJ which encode enzymes acetylating ribosomal proteinsS18 and S5 of Escherichia coli K12.Mol Gen Genet，1987，209：481-488.TanakaS，Matsushita Y，Yoshikawa A，Isono K.Cloning and molecular characterizationof the gene rimL which encodes an enzyme acetylating ribosomal protein L12 ofEscherichia coli K12.Mol Gen Genet，1989，217，289-293.)。此外，根据生物信息学分析，大肠杆菌基因组中一些未知功能基因可能也具有乙酰转移酶活性。现有的研究表明，与真核细胞的NATs不同，原核细胞的NATs可能只需要一种亚基蛋白组成。2005年Vetting等报道鼠伤寒沙门氏菌的RimL具有二聚体结构，并可在体外对其底物进行乙酰化修饰反应(Vetting MW，de Carvalho LPS，Roderick SL，andBlanchard JS.A Novel Dimeric Structure of the RimL N^α-acetyltransferase fromSalmonella typhimurium.J Biol Chem，2005，280(23)：22108-22114)。根据晶体结构及计算机模拟结果，显示原核生物的NATs不同于真核生物NATs，推测只能催化一种蛋白底物。最近文献报道来自嗜盐古细菌的乙酰化酶具有多种底物(Dale T.Mackay，Catherine H.Botting，Garry L.Taylor and Malcolm F.White.An acetylasewith relaxed specificity catalyses protein N-terminal acetylation inSulfolobus solfataricus.Molecular Microbiology，2007，64：1540-1548)。我们最新研究结果发现，RimJ可以催化Tα1的乙酰化，但不能使Tβ4乙酰化(Fang，H.，Zhang，X.，Shen，L.，Si，X.，Ren，Y.，Dai，H.，Li，S.，Zhou，C.，Chen，H.，2009.RimJ is responsible for N^α-acetylation of thymosin α1 in Escherichia coli.Appl.Microbiol.Biotechnol.84，99-104)。从进化关系看，古细菌更接近于真核生物(图1)，我们推测该细菌的乙酰化酶可以催化来自真核生物的多肽的N-末端乙酰化修饰。将该酶基因与胸腺素基因共表达，结果显示Tα1和Tβ4在工程菌体内获得了乙酰化修饰。

发明内容

本发明的目的是提供一种能产生N-末端乙酰化的蛋白质或多肽的方法及其专用工程菌。

本发明所提供的产生N-末端乙酰化的蛋白质或多肽的专用重组工程菌，是将表达来自古生菌的乙酰化酶的表达盒整合到宿主菌染色体上，得到在染色体上表达古生菌乙酰化酶的重组菌。

所述古生菌的乙酰化酶可来自Sulfolobus solfataricus，Sulfolobus tokodaii，Sulfolobus acidocaldarius，Metallosphaera sedula，Hyperthermus butylicus，Pyrobaculum arsenaticum，Pyrobaculum islandicum，Pyrobaculum calidifontis，Caldivirga maquilingensis等微生物。优选来自Sulfolobus solfataricus，Sulfolobustokodaii，Sulfolobus acidocaldarius。更优选来自Sulfolobus solfataricus。

所述乙酰化酶氨基酸序列如序列表中序列2所示或与它具有80％以上的同源性，并不影响其活性。

所述表达乙酰化酶的表达盒包括启动子和连接于启动子下游的编码古生菌乙酰化酶的结构基因以及终止子序列，其中编码古生菌乙酰化酶的结构基因的序列为与序列表中序列1自5′端第4-501位核苷酸序列具有80％以上的同源性的核苷酸序列，优选为序列表中序列1自5′端第4-501位核苷酸序列所示的核苷酸序列。

所述宿主菌为大肠杆菌，优选为大肠杆菌BL21(DE3)。

所述表达乙酰化酶的表达盒中，所述启动子可以采用组成型启动子、热诱导型启动子、或化学诱导型启动子，优选采用T7启动子；T7启动子可进行高效可控表达。

所述表达乙酰化酶的表达盒中还可以包括筛选标记基因，如卡那霉素抗性基因，便于筛选。

本发明所提供的制备N-末端乙酰化多肽或蛋白的方法，是将表达目的多肽或蛋白的载体转入所述的重组工程菌中诱导表达，得到N-末端乙酰化多肽或蛋白。

所述方法中，所述表达目的多肽或蛋白的载体中含有表达所述多肽或蛋白的表达盒，所述表达盒中含有启动子和所述多肽或蛋白的编码基因，所述启动子可以采用组成型启动子、热诱导型启动子、或化学诱导型启动子，优选采用T7启动子。

上述方法适用于制备多种N-末端乙酰化多肽或蛋白，如制备N-末端乙酰化胸腺素，是构建胸腺素的表达载体。可以将胸腺素与内含肽融合表达，即是将表达胸腺素融合蛋白的载体转入上述的重组工程菌中诱导表达，得到N-末端乙酰化胸腺素融合蛋白。N-末端乙酰化胸腺素融合蛋白可以通过温度诱导切割、DTT或巯基乙醇诱导切割、Cys诱导切割。温度诱导切割可以避免添加一些试剂增加成本。DTT或巯基乙醇诱导效率高，可以获得具有完整结构的N-末端乙酰化胸腺素(Tα1和Tβ4，氨基酸序列为自序列表中序列7的氨基端第2-44位氨基酸残基序列或者自序列表中序列5的氨基端第2-29位氨基酸残基序列)。用Cys诱导切割，可以在Tα1和Tβ4的C端增加一个Cys残基，便于进行化学修饰，改善Tα1和Tβ4的性质，如延长体内半衰期等。

融合蛋白及胸腺素的纯化可以通过亲和层析、离子交换、疏水层析、反相层析等方法。

本发明构建可以乙酰化修饰多种多肽的大肠杆菌宿主。人工合成了来自嗜盐古细菌Sulfolobus solfataricus的乙酰化酶基因，并通过质粒转入大肠杆菌细胞内，或利用重组技术将该基因整合到大肠杆菌的染色体上获得了本发明的工程菌。该酶基因可以通过诱导表达，或组成性表达，从而使目的多肽获得乙酰化修饰。

用本发明工程菌可以直接获得完全N-末端乙酰化的蛋白或者多肽，如胸腺素α1和胸腺素β4，克服了传统基因工程技术中不能乙酰化或仅部分乙酰化的缺点，彻底实现了通过基因工程技术获得N-末端乙酰化胸腺素，具有很强的实际用途。

实验证明，用本发明工程菌制备得到的Tα1和Tβ4，全部是N-末端乙酰化的，克服了传统技术中不能N-末端乙酰化、部分N-末端乙酰化、乙酰化效率不高的缺点，彻底的实现了通过基因工程技术获得N-末端乙酰化胸腺素。因此，本发明工程菌及方法在制备N-末端乙酰化胸腺素领域具有广阔的应用前景，并有可能用于其他需要进行乙酰化修饰多肽的表达和制备。

附图说明

图1 生命系统的三界

图2 辅助质粒pKDS

图3 含有Spl Intein基因的质粒

图4 Ard1在质粒上的表达

图5 一步法染色体整合过程示意图

图6 染色体整合打靶质粒

图7 Ard1染色体整合PCR鉴定

图8 Ard1在染色体上整合表达

图9 融合蛋白AS的表达

图10 重组Tα1的纯化

图11 重组Tα1的分子量测定

图12 化学合成Tα1(日达仙)的分子量测定

图13 重组Tα1的一级序列测定结果

图14 融合蛋白BS的表达

图15 重组Tβ4的纯化

图16 重组Tβ4的分子量测定

图17 重组Tβ4的N端序列测定

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的酶试剂均购自TaKaRa公司。

实施例1、表达嗜盐古细菌的乙酰化酶的大肠杆菌宿主构建

1、嗜盐古细菌的乙酰化酶ssArd1基因设计与合成

根据文献报道的氨基酸序列(Dale T.Mackay，Catherine H.Botting，Garry L.Taylor and Malcolm F.White.An acetylase with relaxed specificity catalysesprotein N-terminal acetylation in Sulfolobus solfataricus.MolecularMicrobiology，2007，64：1540-1548)及大肠杆菌基因密码子的偏嗜性，设计了如下基因序列并送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成的ssArd1基因序列，在两侧分别增加了NdeI和HindIII酶切位点，具体序列如序列1所示(序列表中序列1的5′端第4-501位核苷酸序列为编码序列)，其编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示。该合成基因克隆在质粒pGH-X047G(上海生工生物工程技术服务有限公司)上(图3)。

2、表达载体构建及表达

用NdeI和HindIII(购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切将上述基因从载体pGH-X047G上切下，然后连接到pET22b载体(购自Novagen公司，目录号69337-3)的NdeI和HindIII酶切位点之间，转化大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性克隆，再进行测序鉴定，得到表达ssArd1的载体pET-ssArd1。

为了今后与目的多肽基因共表达，用NdeI和XhoI双酶切(购自宝生物工程(大连)有限公司)pET-ssArd1回收ssArd1片段，用NdeI和XhoI双酶切载体pACYCDuet-1(购自Novagen公司，目录号71147-3)，连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性克隆，再进行测序鉴定，获得表达ssArd1的载体pACYC-ssArd1(该质粒与pET系列载体可共存于细胞内)，在此载体上ssArd1基因的表达也是由T7启动子控制。

将载体pACYC-ssArd1转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，筛选，得到表达ssArd1的工程菌。首先挑取单菌落接入含有25mg/L氯霉素的2ml LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH 7.0)中，30℃培养12小时(未诱导)。然后转接到50ml的含有25mg/L氯霉素的FML培养基中(酵母粉12g/L，蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·2H₂O3g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7g/L，NaCl 2.5g/L，0.2％葡萄糖，2mM乳糖，0.05％MgSO₄·7H₂O)于37℃振荡培养10小时(诱导)，取样进行SDS-PAGE分析，有目的蛋白表达(图4)。图4中，M为分子量Marker，LB为未诱导全菌蛋白电泳，FML为诱导表达后的全菌蛋白电泳。

3、整合载体pBRSS-LPLR-Kan-Ard1的构建

3.1构建pBRS

(1)以pBR322(宝生物工程(大连)有限公司)为模板，PBR5/PBR3为引物，PCR扩增包含Tet基因和复制子的pBR322骨架，得PBR。

(2)EcoRI/XhoI双酶切PBR回收3000bp左右片段I，

(3)合成的下列片段(上海生工生物工程有限公司合成)：

5’-gGAATTCATATGCCCTTTAGGGATAACAGGGTAATGCGGCCGCATGCAGGAGCGATCCTCCTGCATAC-3’

5’-ccgCTCGAGGATTGCCTTATTACCCTGTTATCCCTAACGCGTATGCAGGAGGATCG-3’

将两片段等摩尔混合，变性退火延伸，条件：94℃，30s；50℃，30s；72℃，延伸10s。反应30循环；胶回收约100bp处条带。用EcoRI/XhoI双酶切并回收100bp片段II。

(4)将(2)得到的片段I和(3)得到的片段II连接，转化，挑选转化子，直接通过测序得到阳性克隆，命名为pBRS。

3.2构建pBRSS

(1)以枯草芽孢杆菌基因组(1.1391，中国普通微生物菌种保藏管理中心)为模板，SP5/SP3为引物，PCR扩增sacB基因。

SP5和SP3引物序列为：

SP5：5’-CCGGAATTCTAGTTCTTTAGGCCCGTA-3’

SP3：5’-TGCTCTAGATATGGGATTCACCTTTATG-3’

PCR反应体系为：10×TransHiFi Buffer 5μl，dNTP 4μl，SP51μl，SP3 1μl，枯草芽孢杆菌基因组0.5μl，TransHiFi DNA polymerase 0.5μl，ddH₂O 38μl。

PCR反应条件：94℃，30s；60℃→55℃，30s。72℃，延伸2min，反应10个循环每个循环退火温度降0.5℃，94℃，30s；55℃，30s。72℃，延伸2min，反应20循环；72℃延伸300s，4℃，10h。胶回收2000bp处条带。

(2)使用EcoRI/XbaI双酶切载体pBRS和sacB基因，两者连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

(3)以SP5/SP3为引物，PCR鉴定阳性重组；PCR鉴定正确后，使用含有5％蔗糖的固体LB平板验证sacB功能。在含有蔗糖固体LB平板上不长的菌落为所需菌落。成功构建质粒pBRSS。

3.3构建pBRSS-LPLR

(1)以大肠杆菌BL21(DE3)基因组为模板，以PL-1/PL-2为引物扩增L，以PL-3/PL-4为引物扩增R；以L，R为模板，以PL-1/PL-4为引物扩增得LR片段。

引物序列如下：

PL-1：5’-GGCCATGATTGGCGTAGATTACCTG-3’

PL-2：5’-TACGAGAGCGGCCGCGTGTCTAGAAATCCAGCCGTATAAGCG-3’

PL-3：5’-TAGACACGCGGCCGCTCTCGTAGCTTTTCCAGTTTCGGATAAGG-3’

PL-4：5’-CGCGACACCTGGGAAGTGTCTCG-3’

(2)用T4DNA聚合酶和dTTP处理LR片段，然后电泳回收。

T4DNA聚合酶反应体系：LR片段10μl，10×T4 DNA polymerase buffer 2μl，BSA 2μl，T4DNA polymerase 1μl，100mMdATP 0.5μl，ddH₂O 4.5μl，总体积20μl。

以上反应体系37℃反应30min后，直接纯化回收DNA片段。

(3)用NotI/MluI双酶切载体pBRSS，然后电泳回收。

(4)连接pBRSS与LR并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。用PBR+/PBR-为引物，菌液PCR筛选阳性重组子，测序正确后得到pBRSS-LPLR。

引物序列如下：

PBR+：5’-GTGGAACGAAAACTCACGT-3’

PBR-：5’-GTTAGATTTCATACACGGTG-3’

3.4构建pBRSS-LPLR-Kan-Ard1

(1)以pET-ssArd1为模板，以P5/P6为引物扩增得ssArd1表达盒片段。

引物序列如下：

P5：5’-AGACACGCGGCCTCCCGCGAAATTAATACGAC-3’

AR3：5’-CGGATATAGTTCCTCCTTTC-3’

PCR反应体系如下：10×TransHiFi Buffer 5μl，dNTP 4μl，P5 1μl，AR3 1μl，SSARD1 0.5μl，TransHiFi DNA polymerase 0.5μl，ddH₂O 38μl。

PCR反应条件：94℃，30s；60℃→55℃，30s。72℃，延伸1min，反应10个循环每个循环退火温度降0.5℃，94℃，30s；55℃，30s。72℃，延伸1min，反应20循环；72℃延伸300s，4℃，10h。胶回收800bp处条带。

(2)以pET-28a(购自北京欣经科生物技术有限公司)为模板，KN5/KN3为引物，PCR扩增Kan基因表达盒。

PCR反应体系如下：10×TransHiFi Buffer 5μl，dNTP 4μl，KN5 1μl，KN3 1μl，PET-28a 0.5μl，TransHiFi DNA polymerase 0.5μl，ddH₂O 38μl。

PCR反应条件：94℃，30s；60℃→55℃，30s。72℃，延伸1min，反应10个循环每个循环退火温度降0.5℃，94℃，30s；55℃，30s。72℃，延伸1min，反应20循环；72℃延伸300s，4℃，10h。胶回收1000bp处条带。

引物序列如下：

KN5：5’-GAAAGGAGGAACTATATCCGCAGCAGATTACGCGCAG-3’

KN3：5’-ACGAGAGCGGCCTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAG-3’

(3)以(1)和(2)得到的片段为模板，P5/KN3为引物，PCR扩增得到融合片段Kan-Ard1。

PCR反应体系：10×TransHiFi Buffer 5μl，dNTP 4μl，P51μl，KN3 1μl，Kan 0.5μl，ssArd1 0.5μl，TransHiFi DNA polymerase 0.5μl，ddH₂O 37.5μl。

PCR反应条件：94℃，30s；60℃→55℃，30s。72℃，延伸2min，反应10个循环每个循环退火温度降0.5℃，94℃，30s；55℃，30s。72℃，延伸2min，反应20循环；72℃延伸300s，4℃，10h。胶回收2000bp处条带。

(4)用T4DNA聚合酶和dATP处理融合片段Kan-Ard1。

T4DNA聚合酶反应体系：Kan-Ard1 10μl，10×T4 DNA polymerase buffer 2μl，BSA 2μl，T4 DNA polymerase 1μl，100mMdATP 0.5μl，ddH₂O 4.5μl，总体积20μl。

以上反应体系37℃反应30min后，直接纯化回收DNA片段。

(5)使用NotI单酶切pBRSS-LPLR胶回收后，再用T4DNA聚合酶和dTTP处理；

酶切反应体系：pBRSS-LPLR 8μl，10×H buffer 2μl，BSA 2μl，NotI 1μl，ddH₂O 7μl。以上体系在37℃下反应过夜，1％琼脂糖凝胶电泳回收5000bp酶切片段。

T4DNA聚合酶反应体系：pBRSS-LPLR(NotI切)8μl，10×T4 DNA polymerasebuffer 2μl，BSA 2μl，T4 DNA polymerase 1μl，100mMdTTP 0.5μl，ddH₂O 6.5μl，总体积20μl。以上反应体系37℃反应30min后，直接纯化回收。

(6)将步骤(4)和(5)得到的片段连接，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。直接在含有25mg/L的卡那霉素固体LB平板上筛选阳性克隆，并以P5/KN3为引物进行PCR验证，然后用通用引物T7和T7t引物对阳性克隆进行测序，表明ssArd1基因序列及其表达控制序列完全正确。至此，完成载体pBRSS-LPLR-Kan-Ard1(图6)构建。

4、ssArd1在染色体上整合表达

应用本实验室建立的一步法(图5)将ssArd1基因及其表达调控元件整合到大肠杆菌染色体上(周军智等.大肠杆菌ptsHIcrr操纵子的快速敲除及敲除菌生长性能测定，微生物学通报，2010，37：1146-1152)。具体方法如下所述：

首先，应用常规酶切连接方法按步骤3构建如图6所示的染色体整合打靶质粒pBRSS-LPLR-KanArd1(图6)。

低拷贝pKDS质粒(图2)含有exo、bet、gam以及归巢内切酶I-Sce I基因，均受阿拉伯糖启动子控制(见周军智等.大肠杆菌ptsHIcrr操纵子的快速敲除及敲除菌生长性能测定，微生物学通报，2010，37：1146-1152)(中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所)。

然后将打靶质粒pBRSS-LPLR-KanArd1和辅助质粒pKDS共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化子在25mg/L氯霉素和卡那霉素双抗平板上培养，挑取单菌落，接种到5ml氯霉素和卡那霉素双抗液体LB培养基中，过夜培养。次日，取500μl共转菌菌液接种到50ml含有25mg/L氯霉素的LB中，200rpm 30℃培养到OD₆₀₀≈0.4。加入终浓度0.2％L-阿拉伯糖诱导，诱导5h后，取菌液200μl，涂布Kan/蔗糖平板(含有25mg/L卡那霉素和5％蔗糖的固体LB平板)。37℃过夜培养。在Kan/蔗糖平板只长出1个单菌落。

菌液PCR鉴定：从Kan/蔗糖平板上挑取单菌落到LB无抗培养基中，培养4-5h后，以菌液为模板，PL-7/PLlpxmR为引物，PCR鉴定。阳性重组菌应为4000bp，非重组菌为3000bp。PCR验证正确后(图7，图7中样品是阳性重组菌，阳性对照是打靶质粒pBRSS-LPLR-KanArd1，阴性对照是未重组的大肠杆菌BL21(DE3))，进行测序，得到含有辅助质粒的BL21(DE3)lpxM::Kan-Ard1。将该菌株涂布四环素抗性平板，不能生长，说明打靶质粒已不存在。

引物PL-7：5’AGACATTAAGACTGCGGCGT 3’

引物PLlpxmR：5’ACTCTCCTGGACATTAACCG 3’

辅助质粒剔除：取50μl含有辅助质粒的BL21(DE3)lpxM::Kan-Ard1菌液接种到5ml含有25mg/L卡那霉素液体LB培养基中，42℃过夜培养。次日将过夜菌稀释到10^-6，涂布含有25mg/L卡那霉素的固体LB平板，37℃温孵过夜。次日，挑取卡那霉素平板生长的单菌落到卡那霉素液体LB培养基中，培养4-5h后，将菌液编号，对应点到含有25mg/L氯霉素的固体LB平板，不能在氯霉素平板生长的菌株为辅助质粒pKDS丢失株，保存该菌种，得到去除辅助质粒的菌株BL21(DE3)lpxM::Kan-Ard1。

诱导表达ssArd1：将去除辅助质粒的BL21(DE3)lpxM::Kan-Ard1在卡那霉素平板上划线，37℃温孵12h，次日挑取单菌落到5ml液体LB培养基中，37℃震荡培养过夜。取50μl过夜培养菌液分别接种到2只试管中，每管含有5ml液体LB培养基。37℃震荡培养到OD₆₀₀≈0.4，一支试管加入终浓度0.5mmol IPTG诱导，另一支作为对照。诱导6h后，以诱导前样品为对照，进行SDS-PAGE分析，结果表明有ssArd1表达(图8)。

至此，我们获得了在染色体上表达ssArd1的大肠杆菌BL21(DE3)lpxM::Kan-Ard1，简称BDArd。

实施例2、重组N-末端乙酰化Tα1的制备

Tα1分子量较小，难以在细胞内直接表达，需要与其它蛋白基因融合表达。为获得完整结构的Tα1，需要对融合蛋白进行切割。切割方法可采用酶裂解法、化学裂解法，以及内含肽介导的切割方法。本实施例介绍利用内含肽切割获得N-末端乙酰化修饰的胸腺素Tα1。

1、表达Tα1与内含肽的融合蛋白工程菌I的构建

编码Spl DnaX内含肽的基因序列如序列表中序列3所示，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切上述编码Spl DnaX内含肽的基因，再用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切pET22b载体(购自Novagen公司，目录号69337-3)回收载体片段，与切上述编码Spl DnaX内含肽连接，获得重组载体，将鉴定正确的含有Spl DnaX内含肽的编码基因的重组载体命名为pET-S。

设计两条寡核苷酸片段TA和TAS，如下所示：

TA：5’-GAA TTC CAT ATG TCA GAT GCA GCA GTA GAT ACT AGC TCT GAA ATC ACTACC AAA GAC CTG AAG GAG AAG AAG-3’

TAS：5’-GCT GCT ACT TAA GCA GTT CTC AGC CTC TTC GAC AAC TTC CTT CTT CTCCTT CAG GTC-3’

将两条片段通过自身退火延伸得到约100bp的产物，将其用NdeI和Afl II双酶切后插入到pET-S的酶切位点之间，从而获得表达Tα1与Spl内含肽融合蛋白AS(AS氨基酸序列如序列表中序列5所示，编码AS的基因序列如序列表中序列4所示)的载体，将鉴定正确的载体命名为pET-AS。

TA和TAS的自身退火延伸反应条件如下：

反应体系(总体积50μL)：10×Pyrobest Buffer 5μL；dNTP 4μL；PrimerTA 1μL；Primer TAS 1μL；Pyrobest DNA Polymerase 0.3μL；ddH₂O 38.7μL。

PCR反应条件：先95℃预变性5min；再94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸10sec，反应30个循环，最后72℃延伸10min。

构建工程菌I：将表达载体pET-AS转化到大肠杆菌BDArd中，在添加终浓度100mg/L氨苄青霉素LB平板上筛选，并经过PCR检测和测序鉴定，得到含有pET-AS的工程菌I，即BDArd/pET-AS。这样，在工程菌I内AS(位于质粒上)和ssArd1(位于染色体上)的表达都由T7启动子控制，可以用IPTG诱导同时表达。

2、工程菌I发酵培养及重组Tα1的纯化与鉴定

摇瓶发酵：将工程菌BDArd/pET-AS接入添加终浓度100mg/L氨苄青霉素的2mlLB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH 7.0)中，30℃培养12小时。然后转接到50ml的相同培养基中，30℃振荡培养10小时，作为种子。将种子接入1升FML培养基中(酵母粉12g/L，蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 3g/L，KH₂PO₄·3H₂O7g/L，NaCl 2.5g/L，葡萄糖2g/L，2mM乳糖，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，100mg/L氨苄青霉素)，37℃振荡诱导培养10小时(振荡速度为250rpm/min)，离心，收集菌体。对全菌蛋白进行SDS-PAGE分析，以未诱导培养的菌体为对照，结果表明，诱导培养后AS有表达(图9中箭头示)。

分离纯化：

1)镍柱亲和层析

取1L诱导培养发酵液所得的BDArd/pET-AS菌体(湿重约10g)，加入200ml镍柱亲和层析A缓冲液(50mM磷酸盐、0.5M NaCl、100mM咪唑、pH7.0)，混匀后超声破菌30min，离心(12000r/min，4℃，30min)，收集上清，在上清中加入终浓度为1％的曲拉通-100，将上清液首先用0.8μm的滤膜过滤，再用0.45μm的滤膜过滤后上样镍柱(已经用A液平衡)，上样后，用镍柱亲和层析B缓冲液(50mM磷酸盐、0.5M NaCl、20mM咪唑、10％甘油、pH7.0)漂洗，最终用镍柱亲和层析的C缓冲液(50mM磷酸盐、0.5M NaCl、400mM咪唑、pH7.0)直接洗脱，收集洗脱峰。

2)切割

在经镍柱亲和层析后所得到的AS融合蛋白溶液中添加终浓度为300mM的β-巯基乙醇，放置在42℃水浴中温育切割24h。

3)疏水层析

在经过诱导切割的蛋白溶液中加入等量的初浓度为2M的(NH₄)₂SO₄溶液，使溶液中所含的(NH₄)₂SO₄浓度为1M，用0.22μm的滤膜过滤后上样Phenyl Sepharose 6FastFlow column(high sub)(GE Healthcare)柱进行疏水层析，该柱子已经用疏水层析平衡液D(50mM磷酸盐，1M(NH₄)₂SO₄，pH7.0)平衡，进行疏水层析，根据先前预实验结果，目的蛋白在穿过峰中，收集穿过液。

4)反相层析

经过疏水层析的蛋白溶液再进行反相层析，上样反相柱SORCE30 RPC column(GEHealthcare)后用E液平衡(0.1％磷酸)，再用F液(0.1％磷酸，25％乙腈)进行梯度洗脱，洗脱条件为4ml/min，0～100％F，100ml，分管收集，每管10ml，将收集到的目的蛋白管混合。

5)离子交换层析

将反相层析所得到的含有目的蛋白的样品管混合后，调节pH至7.0，上样QSepharose Fast Flow column(GE Healthcare)柱，进行阴离子交换层析，平衡液G(50mM磷酸酸盐，pH7.0)，洗脱液为H(G+1M NaCl，pH7.0)，洗脱条件为：4ml/min，0～100％G，100ml，分管收集。每管10ml，将收集到的目的蛋白管混合。

各步骤样品SDS-PAGE分析结果如图10所示，表明通过上述步骤后可以获得比较纯的重组Tα1。

6)反相-高效液相色谱(RP-HPLC)分析目的蛋白Tα1得率与纯度

反相-高效液相系统：大连依利特分析仪器有限公司

柱填料：Hypersil

C18 5μm

在分析了系统适应性及重复性的基础上利用该系统及柱填料对本研究所得到的Tα1进行得率及纯度分析

洗脱程序为：

标准曲线的绘制：

标准品Tα1：购买于中国药品生物制品检定所，规格：2mg/支 批号：140655～200802。

将Tα1标准品配制成不同浓度梯度，0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml；每个浓度项下上样20μl。以每个浓度时色谱峰积分面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线并计算R²值。

取经过离子交换层析后得到的目的蛋白溶液20μl上样，进行RP-HPLC分析，记录色谱峰积分面积。重复3次，求积分面积平均值。利用标准曲线法求得Tα1目的蛋白溶液浓度，根据浓度及蛋白溶液体积可以计算出每升的发酵液中的T α1得率，并且可以同时分析该方法制备所得的Tα1纯度。

目的蛋白Tα1得率＝目的蛋白溶液浓度*体积

标准曲线的绘制：将Tα1标准品配制成不同浓度梯度，0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml、1.0mg/ml；每个浓度项下上样20μl。进行RP-HPLC分析，以每个浓度时色谱峰积分面积为纵坐标，浓度为横坐标做标准曲线并计算R²值。

表1 标准品RP-HPLC分析数据表

利用标准曲线求得目的蛋白Tα1得率为32.56mg/L发酵液。利用面积归一化法分析，该方法制备所得的Tα1纯度大于98％。

将该方法制备所得的Tα1与化学合成的Tα1对照品(日达仙)混合后，上样20μl进行RP-HPLC分析，在色谱图中只有一个峰，表明该方法制备所得的Tα1与化学合成的Tα1对照品保留时间一致。

7)分子量及氨基酸序列一致性

该方法制备所得的Tα1样品用C18反相柱脱盐后，冷冻真空干燥进行Q-TOF MS/MS分析分子量和氨基酸序列。将化学合成的Tα1对照品(日达仙)用同样过程处理后进行Q-TOF MS分析分子量。结果表明制备的Tα1分子量为3107.44(图11)与化学合成的Tα1对照品分子量(3107.42)相一致(图12)，在质谱图中无分子量少42Da的峰存在，说明得到了充分乙酰化。利用串联质谱的方法测定了重组Tα1的一级序列，表明该方法制备所得的Tα1的N-端Ser残基得到了乙酰化修饰，并且利用Intein介导的N端蛋白切割技术制备所得的Tα1具有天然的一级氨基酸序列(图13)。

实施例3、重组N-末端乙酰化Tβ4的制备

Tβ4分子量较小，难以在细胞内直接表达，需要与其它蛋白基因融合表达。为获得完整结构的Tβ4，需要对融合蛋白进行切割。切割方法可采用酶裂解法、化学裂解法，以及内含肽介导的切割方法。本实施例介绍利用内含肽切割获得N-末端乙酰化修饰的胸腺素Tβ4。

1、表达Tβ4与内含肽的融合蛋白工程菌II的构建

以含有Tβ4基因的质粒pET-B2(司信喜，戴红梅，方宏清，陈惠鹏.化学切割重组融合蛋白制备人胸腺肽β4.生物技术通讯，2009，20(5)，677-679)(中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所)为模板，用引物Tb5和Tb3(序列详见下文)PCR扩增Tβ₄基因。

Tb5：5’GAA TTC CAT ATG TCT GAT AAA CCT GAT ATG 3’

Tb3：5’GCT GCT ACT TAA GCA AGA TTC GCC TGC TGC 3’

PCR体系：10×Pyrobest Buffer 5μl，dNTP 4μl，模板1μl，上、下游引物各1μl，Pyrobest DNA Polymeras  0.25μl，补灭菌水至50μl。

PCR扩增条件：95℃变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸12s，72℃延伸10min，4℃保存，反应30个循环。

通过Nde I和AflII酶切，连接同样双酶切载体pET-S连接得到表达载体pET-BS，从而获得表达Tβ4与Spl内含肽融合蛋白BS的质粒。质粒中编码BS的基因序列如序列表中序列6所示，BS的氨基酸序列为序列表中序列7。

构建工程菌II：将表达载体pET-BS转化到大肠杆菌BDArd中，在含有100mg/L氨苄青霉素LB平板上筛选，得到含有pET-BS的工程菌II，即BDArd/pET-AS。这样，在工程菌II内BS(位于质粒上)和ssArd1(位于染色体上)的表达都由T7启动子控制，可以用IPTG诱导同时表达。

2、工程菌II发酵培养及重组Tβ4的纯化与鉴定

摇瓶发酵：将工程菌II，即BDArd/pET-BS接入含有100mg/L氨苄青霉素的2mlLB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH 7.0)中，30℃培养12小时。然后转接到50ml的相同培养基中，30℃振荡培养10小时，作为种子。将种子接入1升FML培养基中(酵母粉12g/L，蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 3g/L，KH₂PO₄·3H₂O7g/L，NaCl 2.5g/L，葡萄糖2g/L，2mM乳糖，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，100mg/L氨苄青霉素)，30℃振荡培养10小时(振荡速度为250rpm/min)，离心，收集菌体。进行SDS-PAGE分析，结果BS有表达(图14)。

分离纯化：

1)镍柱亲和层析

取1L发酵液所得的菌体(湿重约10g)，加入200ml镍柱亲和层析A缓冲液(50mM磷酸盐、0.5M NaCl、100mM咪唑、pH7.0)，混匀后超声破菌30min，离心(12000r/min，4℃，30min)，收集上清，在上清中加入终浓度为1％的曲拉通-100，将上清液首先用0.8μm的滤膜过滤，再用0.45μm的滤膜过滤后上样镍柱(已经用A液平衡)，上样后，用镍柱亲和层析B缓冲液(50mM磷酸盐、0.5M NaCl、20mM咪唑、10％甘油、pH7.0)漂洗，最终用镍柱亲和层析的C缓冲液(50mM磷酸盐、0.5M NaCl、400mM咪唑、pH7.0)直接洗脱，收集洗脱峰。

2)切割

在经镍柱亲和层析后所得到的AS融合蛋白溶液中添加终浓度为200mM的DTT，放置在42℃水浴中温育切割24h。

3)疏水层析

在经过诱导切割的蛋白溶液中加入等量的初浓度为2M的(NH₄)₂SO₄溶液，使溶液中所含的(NH₄)₂SO₄浓度为1M，用0.22μm的滤膜过滤后上样Phenyl Sepharose 6 FastFlow column(high sub)(GE Healthcare)柱进行疏水层析，该柱子已经用疏水层析平衡液D(50mM磷酸盐，1M(NH₄)₂SO₄，pH7.0)平衡，进行疏水层析，根据先前预实验结果，目的蛋白在穿过峰中，收集穿过液。

4)反相层析

经过疏水层析的蛋白溶液再进行反相层析，上样反相柱SORCE30 RPC column(GEHealthcare)后用E液平衡(0.1％磷酸)，再用F液(0.1％磷酸，30％乙腈)进行梯度洗脱，洗脱条件为4ml/min，0～100％F，200ml，分管收集，每管10ml，将收集到的目的蛋白管混合。

5)离子交换层析

将反相层析所得到的含有目的蛋白的样品管混合后，调节pH至7.0，上样QSepharose Fast Flow column(GE Healthcare)柱，进行阴离子交换层析，平衡液G(10mM碳酸铵，pH8.0)，洗脱液为H(200mM碳酸铵，pH8.0)，洗脱条件为：4ml/min，0～100％G，200ml，分管收集。每管10ml，将收集到的目的蛋白管混合。

各步纯化样品的SDS-PAGE结果如图15所示，表明通过上述步骤后可以获得比较纯的重组Tβ4。电泳条带位置与Tβ4分子量有一定差异。进一步质谱鉴定(图16)，测定分子量为4962.30，与预测分子量4962.43在许可误差范围内。

6)反相-高效液相色谱(RP-HPLC)分析重组Tβ4纯度

反相-高效液相系统：大连依利特分析仪器有限公司。

柱填料：Hypersil 

C18 5μm。

流动相A液：0.01％TFA；B液：0.01％TFA，60％乙腈。

分析方法：0％B 0～5min，0％-10％B 5～10min，10％-60％B 10～40min，60％-100％B40min～45min，100％B 45～50min，100％-0％B 50～60min。

RP-HPLC分析纯度96.7％。

7)分子量及氨基酸序列一致性

该方法制备所得的Tβ4样品用C18反相柱脱盐后，冷冻真空干燥委托国家医学分析测试中心进行Q-TOF MS/MS分析分子量和N端氨基酸序列。测定分子量为4962.30(图16)，与预测分子量4962.43在许可误差范围内。N-末端丝氨酸残基被乙酰化修饰(图17)，确定产物Tβ₄与天然Tβ₄一致。

Claims (10)

1.重组工程菌，是将表达古生菌的乙酰化酶的表达盒整合到宿主菌染色体上，得到在染色体上表达古生菌的乙酰化酶的重组菌。

2.根据权利要求1所述的重组工程菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。

3.根据权利要求1或2所述的重组工程菌，其特征在于：所述古生菌为Sulfolobussolfataricus，Sulfolobus tokodaii，Sulfolobus acidocaldarius，Metallosphaerasedula，Hyperthermus butylicus，Pyrobaculum arsenaticum，Pyrobaculum islandicum，Pyrobaculum calidifontis，或aldivirga maquilingensis；优选为Sulfolobussolfataricus，Sulfolobus tokodaii或Sulfolobus acidocaldarius，最优选为Sulfolobussolfataricus。

4.根据权利要求3所述的重组工程菌，其特征在于：所述古生菌的乙酰化酶的氨基酸序列为与序列表中序列2具有80％以上的同源性的氨基酸序列；优选为序列表中序列2所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求

所述的重组工程菌，其特征在于：所述编码古生菌乙酰化酶的结构基因的序列为与序列表中序列1的5′端第4-501位核苷酸序列具有80％以上的同源性的核苷酸序列，优选为序列表中序列1的5′端第4-501位核苷酸序列所示的核苷酸序列。

6.一种制备N-末端乙酰化多肽或蛋白的方法，是将表达目的多肽或蛋白的载体转入权利要求1-5中任意一项所述的重组工程菌中诱导表达，得到N-末端乙酰化多肽或蛋白。

7.一种制备N-末端乙酰化胸腺素的方法，是将表达胸腺素融合蛋白的载体转入权利要求1-5中任意一项所述的重组工程菌中诱导表达，得到N-末端乙酰化胸腺素融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述胸腺素融合蛋白的氨基酸序列为序列表中序列5或者序列表中序列7。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述胸腺素融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4或者序列表中序列6。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中还包括将诱导表达获得的N-末端乙酰化胸腺素融合蛋白进行切割获得N-末端乙酰化胸腺素；所述N-末端乙酰化胸腺素的氨基酸序列为自序列表中序列7的氨基端第2-44位氨基酸残基序列或者自序列表中序列5的氨基端第2-29位氨基酸残基序列。

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