CN106350527A

CN106350527A - 一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体

Info

Publication number: CN106350527A
Application number: CN201610959969.0A
Authority: CN
Inventors: 陈薇; 于蕊; 徐俊杰; 候利华; 于长明; 李建民; 付玲; 房婷; 张金龙; 宋小红; 刘树玲; 杨秀旭
Original assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Institute of Bioengineering Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2036-11-03
Also published as: CN106350527B

Abstract

本发明公开了一种核苷酸序列得到优化的白喉毒素突变体CRM197编码序列，合成后的编码序列经双酶切后连接入表达载体pET32a(+)中，并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性高表达的重组CRM197。通过本发明制备的重组CRM197蛋白，与白喉毒素相比，安全无毒性，并可诱导小鼠产生高滴度保护性抗体，在重组CRM197的大规模高效制备中具有广阔的应用前景。

Description

一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体

技术领域

本发明公开了一种可溶性高表达的白喉毒素突变体及其优化了的核苷酸编码序列，属于基因工程技术领域。

背景技术

白喉毒素(Diphtheria Toxin，DT)含有535个氨基酸，分子量约58KD，是由感染β噬菌体基因组的白喉棒状杆菌所产生的外毒素。毒素经胰蛋白酶水解可形成193个氨基酸残基的A片段和342个氨基酸残基的B片段。

CRM197是白喉毒素的一种突变体，CRM197具有完整的白喉毒素功能结构，但由于它的第52位氨基酸由Gly突变为Glu，丧失了白喉毒素酶活性及毒性，但仍保留白喉毒素的免疫原性。CRM197可被应用于多个领域：(1)在多糖疫苗制备过程中，CRM197常被用作免疫蛋白载体，通过交联其它半抗原，从而使两岁以下儿童产生较强的免疫记忆。目前国内以CRM197作为载体的结合疫苗有b型流感嗜血杆菌(Hib)结合疫苗、7价肺炎球菌结合疫苗、C群脑膜炎球菌结合疫苗、A+C群脑膜炎球菌结合疫苗等，这些结合疫苗与多糖疫苗相比具有优势。(2)CRM197毒性低于类毒素，因此可作为疫苗的抗原组份，以CRM197为抗原的重组白喉疫苗也在研制中。(3)CRM197作为肿瘤抑制剂可开发为新型的抗肿瘤药物，比如，近年来研究发现肝素结合表皮生长因子(HB-EGF)是白喉毒素特异的细胞膜受体，在卵巢癌患者等一些肿瘤患者体内表达增高，研究证明，CRM197同样具有结合HB-EGF的功能，因此可以作为HB-EGF的特异抑制剂应用于肿瘤病人。

CRM197现有的制备方法主要有三种：(1)将突变的β噬菌体溶源白喉杆菌形成溶原化的菌株，分泌CRM197，其缺点是产量低，白喉杆菌发酵条件苛刻，发酵成本较高，并且培养基成分复杂、价格昂贵。(2)构建含有CRM197碱基突变序列的重组质粒导入白喉杆菌进行表达，其缺点是产量仍未得到大幅度提高，发酵成本仍较高。(3)构建含有CRM197碱基突变序列的重组质粒导入大肠杆菌进行原核表达。用大肠杆菌表达CRM197具有重要的意义，其工艺简单，重组的蛋白不用担心被毒素所污染，其安全性较高。目前存在的问题是可溶性表达较低，不足以满足工业生产需求。发明专利CN201310219018.6、CN201310163343.5、CN101265288B和CN100519577C均曾公开过CRM197在大肠杆菌中的表达和纯化，但均为包涵体表达，需要变性复性，不能直接得到具有天然构象的CRM197。

为了解决在表达CRM197时存在的技术问题，本发明拟采用序列及载体优化等手段，对CRM197片段序列进行优化，通过在大肠杆菌中的可溶性高表达制备具有天然构象的CRM197，并对其毒性和免疫原性等方面进行研究。

发明内容

基于现有技术存在的诸多问题，本发明的目的是提供一个经优化后可以在大肠杆菌中进行高效可溶性表达且能够激发机体对白喉毒素产生免疫保护作用的白喉毒素突变体CRM197基因及其编码蛋白。

基于上述发明目的，本发明首先提供了一种如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码白喉毒素突变体CRM197。发明人根据GenBankNo.K01722.1公布的白喉毒素序列，对具有535氨基酸残基的CRM197序列进行分析优化，采用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子，并平衡A、T、G、C四种碱基的比例和分布，优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，优化前后的核苷酸序列比对见图1。所述核苷酸序列编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

第二，本发明提供了含有上述核苷酸序列的表达载体。

在一个优选的技术方案中，所述载体为pET32a，所述载体还含有硫氧还蛋白基因Trx，构建的含有CRM197基因和硫氧还蛋白基因Trx的重组原核表达载体为pET32a-CRM197。可按照本领域常规方法进行载体构建。

本发明所提供的表达系统得到的CRM197蛋白可以为无标签蛋白，也可为带有标签的蛋白，所带标签可为His标签、Etag标签、Flag标签、GST标签、MBP标签等。

第三，本发明提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。所述宿主可以为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等。

在一个优选的技术方案中，所述宿主细胞为大肠杆菌。所述大肠杆菌可为E.coliDH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS或E.coli Top10等。

第四，本发明提供了如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在制备白喉毒素突变体CRM197中的应用。白喉毒素突变体CRM197可用做多糖结合疫苗的载体蛋白，也可用于制备重组白喉疫苗以及用于制备抗肿瘤药物。需要的时候，以CRM197基因编码蛋白制备的重组白喉疫苗还可以融入颗粒白细胞-巨噬细胞集落刺激剂因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素2(IL-2)、TGF-β4等一种或多种细胞因子的基因或蛋白质作为分子免疫佐剂。

本发明的疫苗可以制成注射液、干粉针剂或喷雾剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

最后，本发明提供了一种表达如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的白喉毒素突变体CRM197的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接入表达载体；

(2)将步骤(1)获得的表达载体转化入宿主细胞；

(3)诱导步骤(2)获得的宿主细胞表达白喉毒素突变体CRM197；

(4)纯化回收步骤(3)获得的白喉毒素突变体表达产物。

在一个优选的技术方案中，步骤(1)所述表达载体为pET32a。

在另一个优选的技术方案中，步骤(2)所述宿主细胞为大肠杆菌。其中，培养所述重组大肠杆菌时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.1-1.0mM，优选为0.2mM，诱导温度为16-37℃，优选为28℃，诱导时间为4-8h，优选为6h。

在又一个优选的技术方案中，步骤(4)所述的纯化包括经QFF柱、苯基疏水柱和SP柱纯化步骤。

本发明提供了核苷酸序列得到优化的白喉毒素突变体CRM197编码序列，合成后的基因序列经双酶切后连接入表达载体pET32a(+)中，重组CRM197在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性高表达，目的蛋白占碎菌上清总蛋白的约40％，并且能够与白喉毒素抗体发生特异性的结合。经QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步纯化后，目的蛋白纯度可达95％以上，得率在200mg/L以上。通过本发明的方法制备的重组CRM197蛋白，与白喉毒素相比，CRM197剂量增加5×10⁷倍后仍没有毒性；与白喉类毒素相比，CRM197剂量增加1.6×10⁴倍后仍没有毒性。因此本发明所表达CRM197具备安全无毒性，而且2μg即可诱导小鼠产生高滴度保护性抗体，预示本发明在重组CRM197的大规模高效制备中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1.白喉毒素突变体CRM197编码序列优化前后对比示意图；

图2.表达载体pET32a-CRM197构建示意图；

图3.CRM197蛋白可溶性表达SDS-PAGE蛋白电泳图谱及Western-blot鉴定图谱；

图4.经QFF柱、苯基疏水柱和SP柱三步纯化后得到的CRM197SDS-PAGE蛋白电泳图谱；

图5.CRM197蛋白、白喉类毒素、白喉毒素对Vero细胞的攻毒结果对照图；

图6.CRM197蛋白免疫BALB/c小鼠后检测血清中的抗体滴度时间曲线图

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

实施例1白喉毒素突变体CRM197的制备

1.CRM197的序列优化

根据GenBankNo.K01722.1公布的白喉毒素序列，对535Aa的CRM197序列进行分析优化，采用大肠杆菌常用密码子替换稀有密码子，并平衡A、T、G、C四种碱基的比例和分布，在CRM197序列的两端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点，并在起始密码子前加入TAA终止密码子以终止载体pET32a(+)上Trx蛋白的表达。优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，优化前后的核苷酸序列比对见图1A和图1B，在优化后的行中，具有下划线的碱基为优化碱基。将优化后的核苷酸序列进行全基因合成。

2.CRM197表达载体构建

将优化合成后的CRM197基因用EcoRI和XhoI双酶切后，连接入同样用EcoRI和XhoI双酶切后的表达载体pET32a(+)上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，37℃培养过夜。次日挑取单克隆于5mL LB(Amp+)培养基中，37℃，220rpm培养12h，提取质粒，EcoRI和XhoI双酶切鉴定目的基因的插入，并送测序。测序正确的质粒命名为pET32a-CRM197(载体构建示意图见图2)。所述操作均采用常规的分子生物学操作即可。

3.CRM197的大肠杆菌表达及Western-blot鉴定

正确连接入CRM197基因的pET32a(+)载体，转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取单克隆于5mL LB(Amp+)液体培养基中，37℃，220rpm培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃，220rpm继续培养6h。5,000g，4℃离心收集菌体，用PBS重悬后超声碎菌。12,000g，4℃离心取上清，行SDS-PAGE电泳，以空载体表达产物为对照，鉴定大小为58KD的CRM197蛋白的表达。表达产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

Western-blot分析CRM197与鼠抗白喉类毒素抗体的特异性结合

将含有CRM197蛋白的超声碎菌上清及空载体碎菌上清行SDS-PAGE蛋白电泳后，蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含3％BSA的PBS室温封闭1h后，加入1：1000稀释的小鼠抗白喉类毒素多克隆抗体，37℃反应1h。将膜用PBST洗涤4遍后，加入1：5000稀释的辣根酶标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应1h后PBST洗涤4遍，采用化学发光法显色、压片、曝光。

从图3的实验结果可以看到，与空载体对照相比，转化有pET32a-CRM197质粒的菌株在58KD左右有明显的条带，Western-bolt结果证实该蛋白可与鼠抗白喉类毒素多克隆抗体发生特异性的结合，说明该条带即为CRM197目的条带。经薄层扫描分析目的蛋白约占碎菌上清总蛋白的40％，说明CRM197蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达。

4.CRM197的大肠杆菌发酵及纯化

表达CRM197蛋白的种子液1L，转接入30L发酵罐中，培养至OD600nm≌0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃，300rpm继续培养6h。10,000g，4℃离心收集菌体，用20mMTris–HCl缓冲液(pH 8.5)重悬后匀浆碎菌。20,000g，4℃离心收集上清。用20mM Tris–HCl缓冲液(pH 8.5)平衡QFF柱，上清液过QFF柱后，收集流穿液。含有目的蛋白的QFF柱流穿液液加入终浓度为0.5M的(NH₄)₂SO₄后，过苯基疏水柱进行下一步纯化。目的蛋白用含浓度0.5-0M的(NH₄)₂SO₄的Tris–HCl缓冲液进行梯度洗脱。含有目的蛋白的洗脱液用脱盐柱置换缓冲液为20mM NaAc(pH4.0)后，过SP柱进行阳离子交换，目的蛋白用含0–0.5M NaCl的20mMNaAc(pH 4.0)缓冲液进行梯度洗脱。经过三步纯化后，无标签的目的蛋白CRM197得到了很好的纯化，纯度可达95％以上(参见图4，第1泳道为蛋白分子量标准，第2-6泳道分别为纯化得到的五批次CRM197蛋白)，得率在200mg/L以上，目的蛋白最终保存在PBS缓冲液中。

实施例2：重组CRM197蛋白的毒性试验(Vero细胞法)

将Vero细胞消化后进行细胞计数，调整细胞浓度为1.25×10⁵个细胞/mL，将细胞悬液加入到96孔培养板中，100μL/孔。白喉毒素从10ng/mL开始倍比稀释，依次加入到含有细胞的培养板中，100μL/孔；白喉类毒素和CRM197蛋白从0.5mg/mL开始倍比稀释，依次加入到含有细胞的培养板中，100μL/孔。加入毒素、类毒素和CRM197蛋白的Vero细胞培养板继续于37℃二氧化碳孵箱中培养6-7天，采用MTT法观察细胞的存活情况。从图5的实验结果可以看到，与白喉毒素相比，CRM197剂量增加5×10⁷倍后仍没有毒性；与白喉类毒素相比，CRM197剂量增加1.6×10⁴倍后仍没有毒性。以上结果说明本发明所表达CRM197是安全无毒性的。

实施例3、CRM197的免疫原性研究

不同剂量的CRM197蛋白2μg和20μg/只，免疫6-8周龄Balb/c小鼠，每两周免疫一次，共免疫三次，均采用氢氧化铝佐剂，每次免疫后两周、下一次免疫前取血检测血清中的抗体滴度；抗体滴度的测定采用ELISA的方法，白喉类毒素2μg/mL，100μL/孔包被96孔酶联板，4℃包被过夜。PBST洗涤4次，5min/次。将抗血清用PBST从1：100依次倍比稀释后，加入酶联板中，37℃反应1h，同时设PBS免疫后的血清为对照。PBST洗涤4次，5min/次。加入HRP-抗小鼠二抗，37℃反应30-40min。加入TMB显色液，50μL/孔，显色后用2M H₂SO₄终止，酶标仪450nm/测定光吸收值。以加入阴性对照血清孔的显色值为对照，以OD450nm大于0.1且高于阴性孔2倍为阳性稀释滴度。从图6的实验结果可以看到，2μg和20μg组的CRM97均可诱导小鼠产生较高的抗体滴度。

序列表

<110> 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所

<120> 一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1605

<212> DNA

<213> Corynebacterium diphtheriae

<400> 1

ggcgctgatg atgttgttga ttcttctaaa tctttcgtga tggaaaactt ctcttcgtac 60

cacggcacta aaccgggtta tgtagattcc attcaaaaag gtatacaaaa gccgaaatct 120

ggtacccaag gcaactatga cgatgattgg aaagagttct atagtaccga caacaaatac 180

gacgctgcgg gctactctgt agataacgaa aacccgctct ctggcaaagc tggcggcgtg 240

gtcaaagtga cgtatccggg cctgacgaag gttctcgcac tgaaagtgga taacgccgaa 300

accattaaga aagagttagg tttaagtctc accgaaccgt tgatggagca agtcggcacg 360

gaagagttca tcaaacgctt cggtgatggt gcttcgcgtg tagtgctcag ccttccgttc 420

gctgagggca gttctagcgt tgaatatatt aacaactggg aacaggcgaa agcgttaagc 480

gtagaacttg agattaactt cgaaacccgc ggcaaacgtg gccaagatgc gatgtatgag 540

tatatggctc aagcctgtgc aggcaaccgt gtccgccgct cagtaggtag ctcattgtca 600

tgcatcaacc ttgattggga tgtcatccgc gataaaacca agaccaagat cgagtctttg 660

aaagagcatg gcccgatcaa aaacaaaatg agcgaaagtc cgaacaaaac cgtatctgag 720

gaaaaagcta aacaatacct ggaagaattt catcaaacgg cattagagca tccggaattg 780

tcagaactta aaaccgttac cggcaccaac ccggtattcg ctggcgctaa ctatgcggcg 840

tgggcagtaa acgttgcgca agttatcgat agcgaaaccg ctgataactt ggaaaagacc 900

accgctgctc tttcgatcct tccgggtatc ggtagcgtaa tgggcattgc agacggtgcc 960

gttcaccaca acaccgaaga gatcgtggca caatcaatcg ctttatcgtc tttaatggtt 1020

gctcaagcta ttccgttggt aggcgagctg gttgatattg gtttcgctgc atataacttc 1080

gtagagagta ttatcaactt attccaagta gttcataact cgtataaccg tccggcgtat 1140

tctccgggcc ataaaacgca accgttcctt catgacggct atgctgtcag ttggaacacc 1200

gttgaagatt cgatcatccg caccggtttc caaggcgaga gtggccacga catcaaaatt 1260

accgctgaaa acaccccgct tccgatcgcg ggtgtcctac tgccgaccat tccgggcaag 1320

ctggacgtta acaagtccaa gacccatatt tccgtaaacg gtcgcaaaat ccgcatgcgt 1380

tgccgcgcta tcgacggtga tgtaaccttc tgtcgcccga aatctccggt ttatgttggt 1440

aacggtgtgc atgcgaacct tcacgtggca ttccaccgca gcagctcgga gaaaattcat 1500

tctaacgaaa tttcgtcgga ttccatcggc gttcttggct accagaaaac cgtagatcac 1560

accaaggtta actctaagct gtcgctgttc ttcgaaatca aaagc 1605

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> Corynebacterium diphtheriae

<400> 2

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val

195 200 205

Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly

210 215 220

Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu

225 230 235 240

Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu

245 250 255

His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val

260 265 270

Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val

275 280 285

Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu

290 295 300

Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala

305 310 315 320

Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser

325 330 335

Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp

340 345 350

Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe

355 360 365

Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His

370 375 380

Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr

385 390 395 400

Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His

405 410 415

Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val

420 425 430

Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr

435 440 445

His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile

450 455 460

Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly

465 470 475 480

Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser

485 490 495

Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu

500 505 510

Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser

515 520 525

Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

530 535

Claims

1.一种如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码白喉毒素突变体CRM197。

2.含有如权利要求1所述核苷酸序列的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述载体为pET32a，所述载体还含有硫氧还蛋白基因Trx。

4.一种含有权利要求2或3所述表达载体的宿主细胞。

5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。

6.如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列在制备白喉毒素突变体CRM197中的应用。

7.一种表达如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码的白喉毒素突变体CRM197的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将含有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列连接入表达载体；

(2)将步骤(1)获得的表达载体转化入宿主细胞；

(3)诱导步骤(2)获得的宿主细胞表达白喉毒素突变体CRM197；

(4)纯化回收步骤(3)获得的白喉毒素突变体表达产物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述表达载体为pET32a。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述宿主细胞为大肠杆菌。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的纯化包括经QFF柱、苯基疏水柱和SP柱纯化步骤。