CN109100517A - 一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备用于检测白喉抗体的抗原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将携带CRM197蛋白表达框的杆状病毒表达载体感染昆虫细胞中，得到感染的昆虫细胞；S2：将感染后的昆虫细胞培养进行培养增殖；S3：将增殖后的昆虫细胞进行破碎，提取其中的抗原蛋白；还涉及该方法制备的抗原蛋白，还涉及包括该抗原蛋白的试剂盒。表达的CRM197蛋白安全无毒性、产量高、易于分离纯化，同时与白喉抗体有很高的亲和力、特异性好。

Description

一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法

技术领域

本发明白喉防治领域，更特别地，涉及一种制备用于检测白喉抗体的抗原蛋白的方法，该方法制备的抗原蛋白，以及包括该抗原蛋白的试剂盒。

背景技术

白喉(Diphtheria)是一种急性上呼吸道传染病，由革兰氏阳性白喉棒状杆菌经空气飞沫传播引起。白喉外毒素是主要致病因素。其临床特征为咽、喉、鼻等处粘膜充血、肿胀并有灰白色假膜形成，以及由细菌外毒素引起的全身中毒症状，严重者可有中毒性心肌炎和周围神经麻痹。引入白喉疫苗前，白喉是引起儿童死亡的一个主要原因。现在许多发展中国家白喉仍然流行。白喉对人类带来极大危害，尤其对儿童健康造成巨大威胁，在百白破疫苗问世之前病死率居高不下，可达到10％。WHO六大区域2010～2014年，平均有158个国家或地区有白喉报告。

白喉病后有较强的免疫力，主要是机体能产生中和白喉杆菌的抗体(IgG)。1～5岁易感性最高，5岁以上易感性逐渐下降，成人绝大多数由于隐性感染或预防接种，已获得免疫力。临床上对白喉的感染、实验室诊断及其流行特征极为重视。随着科学技术的发展和人民生活水平的提高，人们对优生优育的认识逐步提高，检测白喉感染越来越受到重视。

免疫规划工作一直以来都是政府工作的重点之一，儿童的预防免疫关乎其一生的健康，疫苗接种、疾病预防远比疫病的治疗更为重要。由于个体免疫水平的差异、疫苗质量、接种程序的规范与否以及随时间推移抗体水平的逐渐下降等原因，疫苗接种后，大部分人群获得了免疫保护，但仍有部分人群由于以上原因导致抗体水平低下，无法抵御相关传染病的侵袭。开展抗体检测，对抗体水平不足的人群进行有针对性的补种，对有效形成免疫屏障、预防传染病的发生、保护相关人群的健康有着十分重要的意义。

目前检测白喉抗体的方法主要有5种，包括锡克氏试验、动物体内中和试验、体外微孔培养物中和试验、间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。其中前两项为体内试验,后三项为体外实验。用ELISA方法检测白喉抗体有特异性强、重复性好、操作简便、灵敏度高、耗时短并可同时测定大量样品等特点，在有标准品并能够绘制标准曲线时还可用于定量检测白喉抗体。从实用、经济以及人道角度考虑，可定量的ELISA技术越来越受到青睐。定量检测由于能获得准确的抗体水平，通过抗体定量就能准确了解机体的免疫水平，而且可连续检测血清中抗体水平，以便对不同时间和地点的检测结果进行比较。疫苗接种效果监测是检测保护性抗体IgG，定性分析无法确定这种保护性抗体的强弱，同时定量检测还可以对保护性抗体水平衰减情况进行监测。

已有的白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)，用于制备抗原包被板的抗原基本都是通过用人工方法培养白喉杆菌，将其产生的外毒素经福尔马林脱毒变成类毒素，使其失去毒性，然后去掉无效蛋白杂质，使用化学方法提纯，以期获得纯度较高的精制类毒素，作为疫苗或者诊断试剂所需的抗原。但是，将类毒素作为抗原存在一定的局限性和安全性问题，除经脱毒处理的类毒素除了有残留毒性的可能外，在脱毒过程中本身蛋白结构也可能发生改变，并且白喉杆菌的培养条件也相对较为苛刻。使之较难获得安全、稳定、有效的类毒素。有文献报道用基因工程技术，构建大肠杆菌表达体系表达CRM197蛋白，CRM197蛋白(Cross Reaction Material，CRM)是白喉毒素的无毒变异体，除了保证其具有与用传统方法制备的白喉类毒素一样的免疫原性以外，其自身的安全性和易操作性也大为提高。但是该方法得到的表达产物重组蛋白CRM197蛋白主要以包涵体形式表达，需经过变性、复性、阴离子柱和分子筛等多部纯化操作，不利于大规模工业生产。而且大肠杆菌表达系统属于原核表达系统，缺乏一些必要的蛋白质翻译后修饰，往往不能形成天然构象的可溶性蛋白，而用于检测抗体的抗原表位、特异性、亲和力这些都会直接影响到检测结果的准确性。

因此，需要一种新的白喉抗体检测试剂盒。

发明内容

为解决上述获取白喉类毒素各种方法的局限性，能够给白喉抗体检测提供特异性强、亲和力高、更接近天然构象、可批量生产、制备工艺简单的白喉类毒素。我们利用昆虫细胞杆状病毒表达系统，将白喉毒素的无毒突变体CRM197基因克隆至杆状病毒表达载体中，将重组杆状病毒颗粒感染悬浮培养的昆虫细胞Sf9，经培养后收获病变细胞及细胞培养液，经浓缩亲和层析纯化后，我们获得了重组的CRM197目的蛋白，通过包被验证，表达的CRM197蛋白安全无毒性、产量高、易于分离纯化，同时与白喉抗体有很高的亲和力、特异性好。用作白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)中抗原包被板的包被抗原，经对该试剂盒进行性能验证，在检测范围0～1.6IU/mL内，线性相关系数R²高于0.99。定量限为0.0682mIU/mL，回收率为95.5％，批内CV≤2.99％，批间CV≤7.19％。与进口试剂盒检测结果进行相关性分析，两组数据成直线相关，相关系数R²＝0.9904。

基于此，本发明提供了一种制备用于检测白喉抗体的抗原蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将携带CRM197蛋白表达框的杆状病毒表达载体感染昆虫细胞中，得到感染的昆虫细胞；

S2：将感染后的昆虫细胞培养进行培养增殖；

S3：将增殖后的昆虫细胞进行破碎，提取其中的抗原蛋白，即得。

其中，所述CRM197蛋白的DNA编码序列如SEQ ID NO:1所示。

在一个优选实施方案中，S1中，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

在一个优选实施方案中，，S1包括以下步骤：

S11：将Sf9细胞经克氏瓶静置培养复苏；

S12：对复苏后的Sf9细胞进行传代培养，传代后初始密度不低于2.5×10⁵个/mL的接种量逐步放大；

S13：当细胞生长密度达到2.0×10⁶个/mL以上时，用所述携带CRM197蛋白表达框的杆状病毒表达载体感染所述Sf9细胞。

在一个优选实施方案中，S2中，所述感染后的Sf9细胞培养96-108h，至80％以上的细胞出现明显病变。

本发明还提供了上述方法制备的抗原蛋白。

本发明还提供了上述抗原蛋白在制备检测白喉抗体的试剂中的应用。

本发明还提供了一种用于检测白喉抗体的试剂盒，所述试剂盒包括上述抗原蛋白。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒包括以下试剂：

含有所述抗原蛋白的溶液；ELISA板；系列校准品；样品稀释液；浓缩洗涤液；显色试剂。

在一个优选实施方案中，所述试剂盒包括以下试剂：

用所述抗原蛋白包被的抗原包被板；系列校准品；样品稀释液；浓缩洗涤液；显色试剂。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明所述的包被抗原CRM197为白喉毒素的无毒变异体，其具有白喉类毒素一样的免疫原性。用CRM197白喉毒素的无毒变异体替代白喉类毒素，首先它解决了用传统方法制备类毒素作为抗原，在脱毒处理仍会残留毒性的可能，避免了安全风险。

2.本发明利用基因工程方法制备CRM197蛋白，是利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达CRM197蛋白，较之原核表达系统，该系统表达的CRM197蛋白为更接近天然构象的可溶性蛋白，产量高、易于分离纯化，与白喉抗体有更高的亲和力、特异性更好。

3.本发明所述的昆虫细胞悬浮培养工艺，细胞培养密度高，较传统的贴壁静置培养方法，显著获得更高水平的外源蛋白表达。从破碎后的细胞上清和培养液上清均能中纯化出目的蛋白CRM197，蛋白浓度高达5mg/L以上。

本发明试剂盒可规模化生产，检测其它传染病阳性血清，无交叉反应，特异性强，灵敏度高，重复性好，线性范围更宽，在线性范围0～1.6IU/mL内，线性相关系数R²高于0.99。定量限为0.0682mIU/mL，回收率为95.5％。批内CV≤2.99％，批间CV≤7.19％。与进口试剂盒检测结果进行相关性分析，两组数据成直线相关，相关系数R²＝0.9904。

附图说明

图1为四参数拟合标准曲线；

图2为本发明试剂盒与进口试剂盒的相关曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.CRM197蛋白的表达和纯化

将编码白喉毒素的无毒突变体CRM197的DNA片段(SEQ ID NO:1)进行PCR扩增，并经Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切PCR扩增产物，克隆至昆虫细胞杆状病毒表达系统Bac to Bac的供体载体pFastBacHTB(Invitrogen公司产品)，转化筛选，经测序鉴定正确后，将构建的载体命名为pFastBacHTB-CRM197。将构建好的载体pFastBacHTB-CRM197转化至大肠杆菌DH10Bac(Invitrogen公司产品)，与菌体中的基因组发生同源重组后，经测序正确后，提取重组Bacmid-CRM197，转染Sf9细胞(武汉生命科技股份有限公司保存)，收获重组杆状病毒颗粒再经两轮感染Sf9细胞，获得高滴度的含CRM197表达框的病毒表达载体。

将Sf9细胞经克氏瓶静置培养复苏后，以传代后初始密度不低于2.5×10⁵个/mL的接种量逐步放大到1000mL摇瓶，摇瓶装液体积为500mL，培养基为Sf900Ⅱ无血清培养基，培养温度27℃，摇床转速为(90-110)r/min。当细胞生长密度达到2.0×10⁶个/mL时，用感染复数(MOI)5～10的已构建完成的CRM197病毒表达载体，对细胞进行感染。

培养96～108h，当80％的细胞出现明显病变后，800g离心5min沉淀收集细胞。使用100mL含20mmol咪唑的磷酸盐缓冲液(pH7.4)重悬细胞，高压匀浆破碎细胞，12000g离心20min，弃沉淀，细胞破碎离心后的上清和细胞培养物上清经0.45μm滤膜过滤，在10mL层析柱中加入4mL Ni²⁺-NTAResin，用20mmol咪唑的磷酸盐缓冲液(pH7.4)平衡层析柱，将过滤好的细胞裂解液上清和培养物上清过柱，再次平衡层析柱，用含200mmol咪唑的磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗脱，在仪器显示UV值的波峰处收集蛋白，Bradford法测定洗脱液蛋白浓度。加入终浓度为10％(体积分数)的甘油，调整蛋白浓度为1mg/mL，-80℃贮存备用。

2.试剂盒组成

本实施例中的白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒试剂盒包括以下组成部分：

1)上述CRM197蛋白抗原；

2)ELISA板；

3)酶标记物；

4)系列校准品；

5)样品稀释液；

6)浓缩洗涤液；

6)显色液A；

7)显色液B；

8)终止液。

其中，

酶标记物为标记了辣根过氧化物酶的鼠抗人IgG，制备方法如下：称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1mL双蒸水中，加500μL新配置的0.06mol/L的NaIO₄，4℃放置30分钟，勿超过此时间，此时溶液呈早绿色，加入0.5mL乙二醇(0.16mol/L)室温避光反应30分钟。再加入5mg/mL的鼠抗人IgG 1mL，在0.05mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜。吸出后加5mg/mL新配置的NaBH₄ 0.2mL，4℃放置2小时，再加等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃放置30分钟，7000rpm离心10分钟，弃上清，用生理盐水重悬，再在0.15mol/L pH7.4的PBS中透析过夜。收集透析袋中标记的抗人IgG进行工作浓度标定，然后分装于20mL瓶中，4℃保存备用。

系列校准品按如下方法制备：为控制不同批次试剂盒准确性的差异，我们在制备试剂盒系列校准品之前，已经建立好企业校准品作为每批试剂盒校准品配制的参照物，以减少批间差。首先，采用德国维润赛润白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)测定武汉生命科技股份有限公司收集的血清样本(经过60℃灭活1小时)。样本皆为完成白喉疫苗基础免疫后采集的人血清。选取其中10份经德国维润赛润白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)测定阳性值较高的血清，并将其混合，作为标定试剂盒系列校准品之用。根据WHO白喉人源抗体国际标准品(2IU/mL)标定的1.6IU/mL的试剂盒校准品，用样品稀释液倍比稀释至0.05IU/mL，制备出试剂盒系列校准品(Q1-Q7)：0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6IU/mL(0IU/mL校准品为空白样品稀释液)，使用企业校准品与试剂盒校准品同时测定，计算试剂盒校准品与企业校准品的效价比，要求效价比在0.90～1.10之间。分装成1ml/管后，4℃保存备用。

样品稀释液的制备方法：称取牛血清白蛋白(BSA)5g、吐温20(Tween-20)0.5ml、氯化钠(NaCl)8.0g、氯化钾(KCl)0.2g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)1.8g加注射用水溶解并定容至1000ml。

浓缩洗涤液(20×)的制备方法：是称取氯化钠(NaCl)160g、氯化钾(KCl)4g、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)4.8g、磷酸氢二钾(K₂HPO₄)36g、吐温20(Tween-20)10ml，加注射用水溶解并定容至1000ml。

显色液A为含有50mg/ml过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B为含有0.2mg/mlTMB pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。

终止液为2M的H₂SO₄溶液。

上述试剂盒组成中，也可包含已经用CRM197蛋白包被好的ELISA板作为即用的抗原包被板。抗原包被板的制备方法：将纯化好的CRM197蛋白用pH9.6的碳酸氢钠溶液稀释为0.5μg/mL，按100μL/孔加入ELISA板中，4℃放置过夜，弃包被液，每孔加入稀释好的洗涤缓冲液300μL，重复洗3遍，最后一次在吸水纸上拍干，每孔加入120μL含5mg/mL BSA的磷酸盐缓冲液(pH7.4)进行封闭，4℃静置封闭过夜，弃封闭液并在吸水纸上拍干，置于温度25-28℃，湿度低于30％的干燥条件下，静置干燥5小时。干燥完成后，将包被完成的ELISA板装入含干燥剂的铝箔袋中并封口，2-8℃贮存备用。

3.白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)使用方法

1)从试剂盒中取出已包被有CRM197蛋白的抗原包被板，将待检样本用样品稀释液按1:100稀释，每孔100μL加入到抗原包被板中，同时设校准品7孔(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6IU/mL)，每孔100μL；

2)轻轻振匀孔中样品，贴上封口膜，置37℃温育60分钟，揭掉封口膜，甩掉孔中的溶液，用稀释好的洗涤液洗板5次，300μL每孔，最后一次在吸水纸上拍干；

3)每孔加酶标记物100μL，贴上封口膜，置37℃30分钟，揭掉封口膜，洗涤5次，方法同步骤(2)；

4)每孔加显色液A、显色液B各50μL，混匀，贴上封口膜，置37℃避光显色15分钟，揭掉封口膜，每孔加终止液50μL，混匀。30分钟内用酶标仪双波长450/630nm测定各孔OD值；

5)建立吸光度值与抗体浓度的标准曲线，将待测样品吸光度代入标准曲线方程，求得相应样品中抗体含量。

白喉抗体(IgG)含量＜0.1IU/mL，未达到完全保护滴度。

白喉抗体(IgG)含量≥0.1IU/mL，达到完全保护滴度。

4.试剂盒检测结果的验证

以系列校准品(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6IU/mL)的抗体含量及其对应的吸光度A值，根据4参数逻辑对数模型(4PL)做出4参数拟合曲线，得到标准曲线方程。如表1和图1所示。

1)线性

对已建立的白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)检测白喉抗体ELISA方法的标准曲线进行线性范围确认。以白喉抗体标准品8个不同稀释度(1：200～1:25600)为横坐标(X)，其相应的A值为纵坐标(Y)，应用酶标仪Softmax Pro软件对本发明试剂盒ELISA方法进行四参数拟合，重复6次建立标准曲线，得到标准曲线和标准曲线Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D中四个相关参数及相关系数R²，结果见图1和表1。得到的标准曲线的R²值均符合规定，这些结果证实了本发明白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)在检测范围内(0～1.6IU/mL)，有良好的线性关系。表明已建立的ELISA检测方法的可靠性。

表1标准曲线Y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D中四个相关参数及相关系数

2)定量限

应用建立的ELISA方法，测定不同稀释度的白喉抗体企业标准品。根据检测结果与理论值偏差≤20％的最大稀释倍数来确定方法的定量限。结果如表2所示，当白喉抗体企业校准品稀释至1：51200时，检测偏差为3.89％，稀释至1：102400时检测偏差＞20％，因此检测白喉抗体的定量限为0.0682mIU/mL。

表2白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)的定量限验证结果

3.准确度

选取低浓度的白喉临床血清样本，添加已知高浓度的白喉抗体阳性血清样本，再进行ELISA检测，所加已知高浓度样本与低浓度血清样本之间的体积比为1:9，根据公式：回收率(％)＝[C×(V₀+V)-C₀×V₀]/(V×Cs)×100％(V:已知高浓度血清样本体积；V₀：已知低浓度血清样本体积；C₀：低浓度血清样本的检测浓度；Cs：检测样本的浓度)进行计算。重复检测10次，最后得出平均回收率为95.5％。

4.精密度

选取高浓度和低浓度的白喉抗体阳性血清样本，各检测10份，重复试验3次，计算测定浓度结果的平均值和标准差，得出批内和批间变异系数(CV)，评价该试剂盒方法的精密度。结果得出批内CV≤2.99％，批间CV≤7.19％。

5.与进口试剂盒检测结果的相关性分析

将德国维润赛润公司白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)作为参比试剂盒。将两种试剂盒的检测结果进行线性回归分析，得出直线回归方程为Y＝0.9056x-0.0153，两组数据成直线相关，相关系数R²＝0.9904。相关曲线见图2。由结果可知，本发明试剂盒与德国维润赛润公司白喉抗体(IgG)定量检测试剂盒(酶联免疫法)对于测定白喉抗体(IgG)具有很好的相关性，从而进一步验证了本试剂盒在应有于定量检测白喉抗体(IgG)中的准确性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉生命科技股份有限公司

<120> 一种用于检测白喉抗体的抗原蛋白、试剂盒及制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg 60

taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa 120

tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa 180

tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc 240

gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc 300

gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga 360

acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc 420

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agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat 540

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tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct 660

ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct 720

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gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg 1020

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cattctaatg aaatttcgtc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa aacagtagat 1560

cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagcta a 1611

Claims (9)

1.一种制备用于检测白喉抗体的抗原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将携带CRM197蛋白表达框的杆状病毒表达载体感染昆虫细胞中，得到感染的昆虫细胞；

S2：将感染后的昆虫细胞培养进行培养增殖；

S3：将增殖后的昆虫细胞进行破碎，提取其中的抗原蛋白，即得。

其中，所述CRM197蛋白的DNA编码序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：

S11：将Sf9细胞经克氏瓶静置培养复苏；

S12：对复苏后的Sf9细胞进行传代培养，传代后初始密度不低于2.5×10⁵个/mL的接种量逐步放大；

S13：当细胞生长密度达到2.0×10⁶个/mL以上时，用所述携带CRM197蛋白表达框的杆状病毒表达载体感染所述Sf9细胞。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S2中，所述感染后的Sf9细胞培养96-108h，至80％以上的细胞出现明显病变。

5.权利要求1-4中任一项所述的方法制备的抗原蛋白。

6.权利要求5所述的抗原蛋白在制备检测白喉抗体的试剂中的应用。

7.一种用于检测白喉抗体的试剂盒，其特征在于，包括权利要求5所述的抗原蛋白。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

含有所述抗原蛋白的溶液；ELISA板；系列校准品；样品稀释液；浓缩洗涤液；显色试剂。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

用所述抗原蛋白包被的抗原包被板；系列校准品；样品稀释液；浓缩洗涤液；显色试剂。