CN100999548A - 白喉毒素突变体crm197及其制备方法 - Google Patents

Abstract

白喉毒素突变体CRM197及其制备方法，属于免疫蛋白载体技术领域。白喉毒素突变体CRM197在大肠杆菌中以包涵体形式表达，目标产物序列为长度536个氨基酸，具有白喉毒素的免疫原性而不具有白喉毒素的毒性。本发明克隆了编码CRM197的基因，构建表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。本发明的目的蛋白在蛋白总含量中占24％以上，CRM197更易于纯化，纯度易于达到95％以上，目的蛋白回收率高。本发明的制备方法工艺简单，操作性强，制备成本低，适宜于大规模的工业化生产。

Description

白喉毒素突变体CRM197及其制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种免疫蛋白载体的制备，具体涉及一种白喉毒素突变体CRM197及其制备方法。

(二)背景技术

CRM197(cross-reacting materials 197)是白喉毒素丧失了毒性的一种突变体，参见乌其达等人白喉毒素和相关蛋白I.分离并描述白喉毒素血清型相关突变体菌株，生物化学，1973.248：3838-3844.(Uchida，T.，A.M.Pappenheimer，Jr.and R.Gregory.al.，Diphtheria toxin and related proteins I.Isolation and properties of mutantproteins serologically related to diphtheria toxin.J.Biol.Chem.1973.248：3838-3844.)，它是由野生型白喉毒素的碱基序列中由一个碱基G突变为A，从而导致了第52位氨基酸GLY突变为GLU，参见简尼尼等人，两种白喉毒素无毒性突变体CRM45和CRM197的氨基酸序列，核酸研究，1984.Vol.12 No.10，P4063-4070(G.Giannini，R.Rappuoli and G.Ratti al.，The amino-acid sequence of two non-toxic mutants ofdiphtheria toixn：CRM45 and CRM197..Nucleic Acids Research.1984.Vol.12 No.10.P4063-4070)。从结构上看，CRM197具有完整的白喉毒素功能结构，但实验表明，白喉毒素的A片断能与NAD结合而CRM197不能，这表明NAD结合位点的变化影响了白喉毒素的酶活性及毒性。后来研究证明CRM197与白喉毒素的差异在于52位的GLY突变为GLU，这就证明了52位的GLY在白喉毒素NAD结合位点起着重要作用，这就导致白喉毒素酶活性位点--同NAD：EF2 ADP核糖转移酶结合区发生改变，导致CRM197片断A不能EF2结合，不能对细胞起到毒性作用，参见：摩依那，克丽思天森.采用凝胶过滤和饱和硫酸氨沉淀法纯化白喉毒素和白喉类毒素方法的比较.病原微生物及免疫治疗年会.1984，92：17-23(K.Moyner，G.Christiansen，Comparison of gel filtration and ammonium sulphate precipitationin the purification of diphtheria toxin and toxoid，Acta path microbiol immunolscand sect C，1984，92：17-23)。CRM197不具有酶活性以及毒性，但具有白喉毒素的免疫原性，因此CRM197也常被用作一种免疫蛋白载体交联其它半抗原一起作为疫苗。早在1985年美国科学家就利用CRM197的免疫原性，将嗜血流感菌表面的多糖交联到白喉类毒素及CRM197的蛋白载体上制作疫苗防治呼吸道感染，从防治效果上看，两种交联疫苗在效果上没有显著差异，但都能使小孩产生较强的免疫记忆，参见：彼得.安德森，米切而，皮其切罗，瑞卡德.采用白喉类毒素或白喉毒素蛋白CRM197交联嗜血流感菌b亚型表面的多糖制备流感免疫原.临床调研杂志.1985：52-59(Porter Anderson，Micheal E.Pichichero，andRichard A.Insel.Immunogens Consisting of Oligosaccharides from the Capsule ofHaemophilus influenzae Type b Coupled to Diphtheria Toxiod or the Toxin proteinCRM197.J.Clin.Invest.1985：52-59)。美国科学家针对小儿在2岁前对于肺炎球菌疫苗(球菌表面多糖，PnPs)不能产生免疫记忆，因此将球菌表面七价多糖交联于多种蛋白载体以便在小儿2岁前能对肺炎球菌产生抗体，经过多种蛋白载体交联后的动物及临床效果比较，发现PnPs-CRM197能产生较好的免疫效果，而且安全无毒负作用，参见：布莱克，谢里蜚德，伐而曼，路易斯，瑞，汉森，艾而纹，恩塞而，哈克而，斯博而，曼李罗斯克，马夺，常仪，科白格，沃克，奥斯廷，爱德沃德.2000，交联七价肺炎球菌表面多糖疫苗在儿童体内的有效性、安全性和免疫原性.传染病学报.9：187-195(Black，S.，H.Shinefield，B.Fireman，E.Lewis，P.Ray，J.R.Hansen，L.Elvin，K.M.Ensor，J.Hackell，G.Siber，F.Malinoski，D.Madore，I.Chang，R.Kohberger，W.Watson，R.Austrian，K.Edwards，et al. 2000.Efficacy，safety and immunogenicity ofheptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children.Pediatr.Infect.Dis.J.9：187-195)。目前该产品也通过美国FDA批准上市，商品名为Prevnar[BIOPHARMA：Biopharmaceutical Products in the U.S.Market]。意大利科学家Francesco针对流行性脑膜炎也采用了利用其病菌表面多糖交联CRM197制作疫苗，他们从CRM197的结构上分析了交联的可行性，其中CRM197带有39个Lysin氨基酸残基和16个Arg残基，能提供较多的交联用的游离氨基。从实验结果来看，虽然化学交联率较高，但都没有达到理论交联率，而且，不同的糖其交联率也存在差异，这说明交联率也与交联物相关，参见：弗朗西斯科.贝体，保罗.克斯坛替，麦克.弗莱该，克罗的奥.鲁奇拉滋.多糖-蛋白交联疫苗的水溶性、沉积性和动力学特点。(Francesco Berti，Paolo Costantino，Marco Fragai，y andClaudio Luchinatz。Water Accessibility，Aggregation，and Motional Features ofPolysaccharide-Protein Conjugate Vaccines.Biophysical Journal Volume 86 January2004 3-9)。

基于CRM197的作用，关于CRM197的制备也是药物研究的热点。到目前为止，CRM197的制备有以下三种方法：

1.突变的β噬菌体溶源白喉杆菌形成溶原化的菌株，如专利号US4925792；该方法仿照天然产生CRM197的方法，将突变的β噬菌体设计较小的同源序列导入白喉杆菌，使其在菌内发生同源重组，筛选双溶原菌株进行表达，提取CRM197。这种方法较为简单，产生机制同天然菌株相似，但制备CRM197的产量较低，在白喉杆菌发酵过程中发酵成本较高，不利于工业化制备CRM197。

2.构建含有CRM197碱基突变序列的重组质粒导入白喉杆菌进行表达，如专利号EP0616034；该方法构建了含CRM197基因序列的重组表达质粒，通过电击转化的方式将质粒导入白喉杆菌，质粒进入菌体后独立于染色体以外，通过离子调节进行表达。这种方法与β噬菌体溶源白喉杆菌形成溶原化的菌株方法相比，它不用进行双溶原菌株筛选，大大的降低了工作难度，而且CRM197的表达量也有所提高。但该方法仍然是以白喉杆菌为表达宿主，这对于菌种的发酵培养成本较高，产生的CRM197的量也未能得到大幅度的提高，工业化生产CRM197也不是最佳方法。

3.构建含有CRM197碱基突变序列的重组质粒导入大肠杆菌进行原核表达。1987年，Bishai等对CRM197及部分片段在大肠杆菌中进行表达，是以分泌形式表达，在CRM197的可溶性表达中，CRM197的表达量占总蛋白的7.7％。该方法大肠杆菌具有遗传背景简单，生长速度快，生长条件要求简单，外源DNA易于导入，外源蛋白表达简单、容易，能很快的产生大量的目的蛋白等优点，因而原核表达体系从发明至今一直是表达重组蛋白的首选。但Bishai等所做的CRM197可溶性表达中，CRM197的表达量只占总蛋白的7.7％，这还远远不足用于工业化制备。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种白喉毒素突变体CRM197及其制备方法。使得目的蛋白在蛋白总含量中占24％以上。

基于CRM197的优点及原核表达的特性，本发明克隆了编码CRM197的基因，构建表达CRM197的重组表达质粒并转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。经检测，本发明的目的蛋白在蛋白总含量中占24％以上，对于原核表达重组蛋白这一表达量足以用于该蛋白的工业化生产。

本发明以包涵体形式表达的CRM197的氨基酸和碱基序列如下：

1.白喉毒素突变体，其特征在于，具有如下序列：

(a)序列特征

^*长度：536氨基酸

^*类型：氨基酸

(b)分子类型：蛋白质

(b)序列描述

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser

1               5                   10                  15                  20

Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

21              25                  30                  35                  40

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys

41              45                  50                  55                  60

Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

61              65                  70                  75                  80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala

81              85                  90                  95                  100

Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

101             105                 110                 115                 120

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro

121             125                 130                 135                 140

Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

141             145                 150                 155                 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr

161             165                 170                 175                 180

Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

181             185                 190                 195                 200

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser

201             205                 210                 215                 220

Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser

221             225                 230                 235                 240

Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu

241             245                 250                 255                 260

Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

261             265                 270                 275                 280

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys

281             285                 290                 295                 300

Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly

301             305                 310                 315                 320

Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met

321             325                 330                 335                 340

Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

341             345                 350                 355                 360

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala

361             365                 370                 375                 380

Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn

381             385                 390                 395                 400

Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys

401             405                 410                 415                 420

Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

421             425                 430                 435                 440

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met

441             445                 450                 455                 460

Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val

461             465                 470                 475                 480

Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile

481             485                 490                 495                 500

His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

501             505                 510                 515                 520

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

521             525                 530                 535

2.白喉毒素突变体CRM197转录因子cDNA，其特征在于，具有如下序列：

(a)分子类型：cDNA

(b)最初来源：白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)

(c)序列描述：

atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg    60

taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa    120

tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa    180

tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc    240

gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc    300

gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga    360

acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc    420

ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta    480

agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat    540

gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg    600

tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct    660

ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct    720

gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa    780

ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg    840

gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag    900

acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagaeggt    960

gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc atctttaatg    1020

gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat    1080

tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tegtcccgcg    1140

tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt cagttggaac    1200

actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca cgacataaaa    1260

attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac tattcctgga    1320

aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa aataaggatg    1380

cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc tgtttatgtt    1440

ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc ggagaaaatt    1500

cattctaatg aaatttcatc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa aacagtagat    1560

cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagctg a             1611

本发明的白喉毒素突变体CRM197制备方法，具体步骤如下：

(1)克隆编码CRM197的基因

设计CRM197的DNA序列及引物序列，合成两条重组质粒鉴定引物；

(2)构建表达CRM197的重组表达质粒

将CRM197的DNA序列与载体DNA进行酶切、纯化及连接、转化；筛选并鉴定含目的基因的阳性重组子，具体包括重组子质粒DNA的抽提、PCR筛选、酶切筛选；

(3)转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达

将鉴定正确的重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主中表达，进行筛选、鉴定及表达具体包括目的蛋白的诱导表达、目的蛋白聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳分析；将表达的菌株进行测序鉴定重组质粒的正确性；

(4)CRM197纯化

包括包涵体的提取、洗涤、变复性、上阴离子柱纯化以及分子筛纯化，目的蛋白的分析鉴定，包括纯化蛋白的聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳。

上述步骤(2)中所述的适用大肠杆菌表达的载体是PET系列载体、PACYC载体或PMBPC载体。

上述步骤(3)中所述的大肠杆菌表达宿主是BL21(DE3)、JM109(DE3)、OrigmaB(DE3)或Resseta(DE3)。

上述步骤(4)中所述的阴离子柱纯化，包括DEAE柱或Q柱。分子筛可选用G25分子筛。

(5)CRM197免疫原性的检测

包括将纯化的CRM197重组蛋白免疫新西兰大白兔、血清的采集、酶联免疫实验检测。

(6)CRM197急性毒性实验

包括实验动物的选择，实验动物的药物处理及处理后动物的观察，结果分析。

上述步骤(1)中CRM197的DNA序列设计如下：

ggaattccat atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa    60

cttttcttcg taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca    120

aaagccaaaa tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac    180

cgacaataaa tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa    240

agctggaggc gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt    300

ggataatgcc gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga    360

gcaagtcgga acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct    420

cagccttccc ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc    480

gaaagcgtta agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga    540

tgcgatgtat gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg    600

tagctcattg tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa    660

gatagagtct ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa    720

aacagtatct gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga    780

gcatcctgaa ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc    840

taactatgcg gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa    900

tttggaaaag acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat    960

tgcagacggt gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc    1020

gtctttaatg gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc    1080

tgcatataat tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa    1140

tcgtcccgcg tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt    1200

cagttggaac actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca    1260

cgacataaaa attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac    1320

tattcctgga aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa    1380

aataaggatg cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc    1440

tgtttatgtt ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc    1500

ggagaaaatt cattctaatg aaatttcgtc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa    1560

aacagtagat cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagcta    1620

aaagcttgcg gccgc                                                     1635

上述步骤(1)中CRM197检测引物序列设计如下：

正向引物：5’-catatgggcgctgatgatgtt-3’

反向引物：5’-gcggccgcaagcttttagctt-3’

本发明设计包涵体方式表达目的蛋白CRM197，按上述设计序列经过两端的酶切割后插入PET32a、PET25b、PET43.1a载体中进行表达。

与现有技术相比，本发明的优良效果如下：

1.本发明所表达的CRM197的基因序列不同于现有技术；

2.本发明构建表达CRM197的重组表达质粒转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达。

3.本发明CRM197表达量高，在全菌蛋白中占24％以上。

4.本发明包涵体表达的CRM197更易于纯化，纯度易于达到95％以上，目的蛋白回收率高。

5.本发明制备的CRM197具有白喉毒素的免疫原性而不具有有白喉毒素的毒性。

6.本发明制备的CRM197简单，工艺简单，操作性强，制备成本低，适宜于大规模的工业化制备。

(四)附图说明

图1是实施例1中2.1的电泳分析图，其中泳道从左到右为：质粒1，质粒2，M分子量标记物。

图2是CRM197诱导表达全菌蛋白图，从左到右前三个泳道为样品，泳道4为分子量标记物(Marker)，目的蛋白在全菌蛋白中含量为24％

图3是纯化后电泳分析纯化结果，纯度为98％，分子量为道尔顿。

图4是利用纯化后的CRM197制备抗体后与白喉类毒素之间的酶联免疫检测反应图。

图5是皮下注射CRM197后豚鼠体重变化图。

(五)具体实施方式

下面结合实施例详细说明本发明白喉毒素突变体CRM197的制备方法。

实施例1：

1.所用材料

1.1质粒与菌种：质粒pUC18-CRM197，载体pET25b、pET32a、pET43.1a。大肠杆菌JM109、DH5α、BL21菌种。

1.2工具酶：NdeI、HindIII、T4DNA连接酶、Pfu酶：Promega公司产品。

1.3DNA分子量标志：大连宝生物工程公司产品。DL-2000由DNA片段2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp构成；DL-15000由DNA片段15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、1000bp、250bp构成。

1.4蛋白质分子量标记：大连宝生物工程公司产品。分子量大小：97400D、66200D、43000D、31000D、20100D、14400D。

1.5试剂：

细菌液体培养基(LB)：精解蛋白胨10g；酵母提取物5g；氯化钠10g；加蒸馏水至1000ml，溶解后用氢氧化钠调pH至7.5，高压灭菌。

细菌液体培养基(LA)：在上述LB培养基中加氨苄青霉素使终浓度为50μg/ml。

LB、LA固体培养基：在LB、LA培养基中加入1.5％琼脂。

缓冲溶液：50mmol/l葡萄糖；10mmol/lEDTA；25mmol/LTris·CL(pH8.0)，溶解后高压灭菌。

碱溶液(pH12.6)：0.2mol/lNaOH；1％SDS。

酸溶液(pH4.8)：3mol/lNaAc；2mol/lNaAC。

饱和酚(pH8.0)；氯仿/异戊醇(24∶1)；3mol/lNaAC。

RNA酶使用液(TER)：含有无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(PH8.0缓冲液)。

含13％(W/V)聚乙二醇(PEG8000)的1.6mol/L的氯化钠溶液。

缓冲液(TE)：10mmol/L Tris·Cl(pH7.6)；1mmol/L EDTA)(pH8.0)，高压灭菌。

电泳缓冲液(TBE)(5×)：Tris碱54g；硼酸27.5g；0.5mol EDTA(pH8.0)20ml，加双蒸水至1000ml。

上样缓冲液(6×)：0.25％溴酚蓝；40％(W/V)蔗糖，溶于双蒸水中，4℃保存。

磷酸盐缓冲液(PBS)：137mmol/l NaCl；2.7mmol/l KCl；4.3mmol/l Na2HPO4；1.4mmol/lKH2PO4，用双蒸水配制，高压灭菌。

1.6试剂盒：

质粒DNA小量抽提试剂盒Plasmid Wizard miniprep：美国普咯麦格Promega公司产品；

质粒DNA中量抽提试剂盒Qiafilter Plasmid Midi Kit：德国强生Qiagen公司产品；

胶回收试剂盒Gel Extraction Kit：德国强生Qiagen公司产品；

1.7主要仪器设备及其它：

TGL-16型高速台式离心机：上海医疗器械六厂产品。

核酸定量分析仪(Eppendorf Biophotometer)、微量移液器：德国爱本道夫Eppendof公司产品。

PCR仪：AB(applied biosystems)公司产品。

XK26/20离子交换柱：Amersham公司产品。

XK16/100凝胶层析柱：Amersham公司产品。

HD95-1蛋白检测仪及3057型记录仪：(上海康华生化仪器制造厂)。蠕动泵：兰格泵，YZ1515，保定兰格恒流泵有限公司。

BHW-IV电热恒温水温箱：北京市医疗设备厂。

J2-MC高速低温离心机：Beckman公司产品。

制冰机(GRANT)、1-15离心机(Sigma)，Spectrumlad54紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)、FR-200凝胶呈像系统(上海复日科技有限公司)、DK-8D型电热恒温水槽(上海森信实验仪器有限公司)、DYY-12型电脑三恒多用电泳仪(北京市六一仪器厂)、MS2迷你振荡器(IKA，广州公司)、PHS-3C型精密PH计(上海精密科学仪器有限公司)、MILLEXTMGP0.22um微孔滤器(Millipore)、超净工作台、电子天平。

1.8抗体及二抗、佐剂

辣根过氧化物酶标羊抗兔二抗(北京华美生物工程公司)，白喉类毒素抗体(Sigma公司)，弗氏佐剂(BBI公司)。

2.白喉毒素突变体CRM197制备方法

2.1克隆编码CRM197的基因

序列及引物的设计如发明内容中所述。

上述序列合成均由上海生工生物工程技术公司合成。

2.2构建含有CRM197基因片断的重组质粒

选用NdeI、HindIII酶切合成的序列和PET32a、PET25b、PET43.1a载体，电泳鉴定后电泳切胶回收目的条带。将回收的目的条带再次电泳鉴定，确定回收效率。测量回收的DNA片断的浓度，按照CRM197酶切DNA片断和酶切载体DNA片断3∶1的比例加入，加入连接酶于16℃连接12小时，然后转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中，涂于含有100ug/m青霉素的LB平板，37℃培养箱中培养过夜，挑选不同表型的单菌落进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定是否含有插入的目的片断(1647bp)。反应条件如下：94℃预变性5min后，进行30轮循环(94℃变性2min，60℃退火2min，72℃延伸4min)，最后72℃延伸5min。电泳分析是否含有重组质粒。经鉴定含有重组质粒的单菌落于含有100ug/ml青霉素的2ml液体LB中，37℃、220rpm培养过夜，按照分子克隆描述的方法提取质粒DNA，测量DNA浓度和纯度后再次按上述程序进行进一步的PCR鉴定，鉴定含有目的片断的质粒选用NdeI、HindIII酶切鉴定，筛选出正确的重组质粒。如图1所示。

2.3将重组质粒转化至表达宿主中诱导表达

将鉴定含有目的片段的重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)、JM109(DE3)、OrigmaB(DE3)或Resseta(DE3)感受态细胞中，涂于含有100ug/m青霉素的LB平板，37℃培养箱中培养过夜，挑选不同表型的单菌落进行聚合酶链式反应(PCR)鉴定是否含有插入的目的片断(1647bp)。反应条件如下：94℃预变性5min后，进行30轮循环(94℃变性2min，60℃退火2min，72℃延伸4min)，最后72℃延伸5min。电泳分析是否含有重组质粒。经鉴定含有重组质粒的单菌落于含有100ug/ml青霉素的2ml液体LB中，37℃、220rpm培养过夜，按照分子克隆描述的方法提取质粒DNA，测量DNA浓度和纯度后再次按上述程序进行进一步的PCR鉴定，鉴定含有目的片断的质粒选用NdeI、HindIII酶切鉴定。将鉴定正确的单菌落于含有100ug/ml青霉素的2ml液体LB中37℃、220rpm培养过夜，加入不含有青霉素的LB稀释培养液至OD600为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG诱导表达5小时。收集诱导液于10000rpm离心，收集菌体，加入上样缓冲液悬浮细胞，99℃加热处理5分钟。将处理的样品聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分析，分析目的蛋白的表达量，如图2所示。将由目的蛋白表达的菌株送至大连宝生物测序鉴定重组质粒的正确性，经测序表明，菌种质粒中含有的CRM197序列与设计序列一致。

2.4目的蛋白的提取及纯化

采用超声破碎的方法提取包涵体蛋白，经诱导表达后的菌液以5000g离心10min，然后用缓冲液(50mMTris-cl、5Mm EDTA)重悬，用超声破碎仪按1.25A脉冲破碎10min，然后离心收集沉淀，用缓冲液(50mMTris-cl、5Mm EDTA)洗包涵体洗8遍，离心收集沉淀得到包涵体。CRM197包涵体用水以1∶2比例悬浮，将包涵体悬浮液加入到50倍体积的变性液中，变性液为50mM Tris-HCl，1mM EDTA，15mM β-ME pH8.7，.在37℃变性45min，12000rpm离心20min，取上清，上清液进行10体积稀释复性，复性液为20mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.7，复性液中蛋白浓度控制在100ug/ml左右，在4℃复性48h后，复性液进行DEAE阴离子柱纯化，所用平衡缓冲液为20mM Tris-HCI，1mM EDTA，pH8.7，先用20mM NaCl洗去一部分杂质蛋白，再用0.4M NaCl洗脱，收集该洗脱组分，0.2um微孔滤器过滤除菌，包埋浓缩，然后用50mM PB(pH7.6)缓冲液透析过夜，透析后样品进行S-100纯化，缓冲体系为50mM PB，pH7.6，流速小于1ml/min(XK26/100)，先后洗脱出两个峰，分别为峰1和峰2，收集峰2，过滤除菌，电泳检测目的蛋白纯度。5g包涵体可以获得纯度在95％以上的CRM197样品250mg，如图3所示。

3.免疫原性的检测

3.1动物免疫试验

将纯化的CRM197溶于生理盐水，并与等量弗氏佐剂混合，使得CRM197的最终浓度为1mg/ml。免疫时间为0、21、42天；免疫方法采用家兔后腿肌肉注射，第一次注射右腿，第二次注射左腿，第三次注射右腿，注射点略高于第一次注射点。第一次注射采用弗氏完全佐剂处理样品，后两次采用弗氏不完全佐剂处理，并且第一次免疫剂量为1mg，后两次的免疫剂量为0.5mg。

采用家兔耳缘静脉采血，采集的血清室温下放置1小时，凝固后置4℃过夜，析出血清，2000rpm离心，分离血清。血清保存于-20℃，2周内备用。

3.2抗血清效价评价

抗血清效价检测最为常用的方法是酶联免疫法(ELISA)，此法对所有的抗体均适用。以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24小时后测定结合率。通常以结合率为50％时的稀释度为效价。抗血清的效价除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间。所用稀释度的成分及其pH等因素的影响。

本试验所使用的检测方法即为ELISA法。具体为：将免疫原CRM197用包被液稀释至0.1ug/ml，包被聚苯乙烯96孔板，50ul/孔，4℃培育过夜。洗板三次后封闭，50ul/孔，37℃，2小时。加抗血清，将采集的抗血清做如下倍数稀释：1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000，每孔50ul，37℃培育2小时。以注射生理盐水的兔血清为阴性对照，以商品抗白喉毒素抗体为阳性对照。洗涤三次后加入二抗，1∶4000稀释，37℃孵育1小时。洗板10次后加底物显色，37℃孵育40分钟后终止反应，测定A₄₉₁值。

结果如图4和表1所示，从图中可以看出经过三次免疫之后产生了高滴度的抗CRM197抗体，最高效价达到1∶64000。实验结果充分证明本发明表达的目标产物具有白喉毒素的免疫原性。

表1：酶标板上用A405可见光检测酶联免疫的吸光度数值表

阳性对照	0.724	0.609	0.479	0.454	0.329	0.304	0.20	0.183
									样品	1.41	1.121	1.259	0.902	0.616	0.484	0.465	0.162
阴性对照	0.139	0.268	0.191	0.153	0.071	0.175	0.108	0.077

4.急性毒性试验

取300～400g的豚鼠16只，随机分为两组，一组皮下注射白喉毒素作为阳性对照组，注射剂量20ng/只；另一组皮下注射CRM-197 200ug/只，注射容积皆为1ml。注射完毕后，观察豚鼠存活状况、注射局部反应及体重变化。注射后48小时内阳性对照(锡克毒素)组动物全部死亡，而CRM-197实验组动物精神正常，吃食良好，注射局部无反应，跟踪观察30天，体重呈持续上升趋势，如图4所示，未反应出任何毒性反应症状。CRM-197实验组注射剂量为白喉毒素组注射剂量10000倍的情况下，实验动物吃食良好，精神正常，体重呈正常上升趋势，说明此方法制备的CRM-197为一安全无毒的生物制品。实验结果充分证明本发明表达的目标产物不具有毒性。

经过上述有关实验证明，本发明的目标产物与CRM197的典型特征一致。

序列表

<110>齐鲁制药有限公司

<120>白喉毒素突变体CRM197及其制备方法

<140>

<141>

<160>5

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>536

<212>蛋白质

<213>白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)

<400>1

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser

1               5                   10                  15                  20

Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

21              25                  30                  35                  40

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys

41              45                  50                  55                  60

Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

61              65                  70                  75                  80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn AIa

81              85                  90                  95                  100

Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

101             105                 110                 115                 120

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro

121             125                 130                 135                 140

Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

141             145                 150                 155                 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr

161             165                 170                 175                 180

Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

181             185                 190                 195                 200

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser

201             205                 210                 215                 220

Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser

221             225                 230                 235                 240

Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu

241             245                 250                 255                 260

Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

261             265                 270                 275                 280

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys

281             285                 290                 295                 300

Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly

301             305                 310                 315                 320

Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met

321             325                 330                 335                 340

Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

341             345                 350                 355                 360

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala

361             365                 370                 375                 380

Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn

381             385                 390                 395                 400

Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys

401             405                 410                 415                 420

Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

421             425                 430                 435                 440

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met

441             445                 450                 455                 460

Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val

461             465                 470                 475                 480

Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile

481             485                 490                 495                 500

His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

501             505                 510                 515                 520

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

521             525                 530                 535

<210>2

<211>1611

<212>cDNA

<213>白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)

<400>2

atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg    60

taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa    120

tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa    180

tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc    240

gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc    300

gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga    360

acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc    420

ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta    480

agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat    540

gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg    600

tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct    660

ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct    720

gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa    780

ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg    840

gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag    900

acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt    960

gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc atctttaatg    1020

gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat    1080

tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg    1140

tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt cagttggaac    1200

actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca cgacataaaa    1260

attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac tattcctgga    1320

aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa aataaggatg    1380

cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc tgtttatgtt    1440

ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc ggagaaaatt    1500

cattctaatg aaatttcatc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa aacagtagat    1560

cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagctg a             1611

<210>3

<211>1635

<212>DNA

<213>白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)

<400>3

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cttttcttcg taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca    120

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gcaagtcgga acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct    420

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gaaagcgtta agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga    540

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tagctcattg tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa    660

gatagagtct ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa    720

aacagtatct gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga    780

gcatcctgaa ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc    840

taactatgcg gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa    900

tttggaaaag acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat    960

tgcagacggt gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc    1020

gtctttaatg gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc    1080

tgcatataat tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa    1140

tcgtcccgcg tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt    1200

cagttggaac actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca    1260

cgacataaaa attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac    1320

tattcctgga aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa    1380

aataaggatg cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc    1440

tgtttatgtt ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc    1500

ggagaaaatt cattctaatg aaatttcgtc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa    1560

aacagtagat cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagcta    1620

aaagcttgcg gccgc                                                     1635

<210>4

<211>21

<212>DNA

<400>4

正向引物：5’-catatgggcgctgatgatgtt-3’

<210>5

<211>21

<212>DNA

<400>5

反向引物：5’-gcggccgcaagcttttagctt-3’

Claims (8)

1.一种白喉毒素突变体CRM197，其特征在于，在大肠杆菌中以包涵体形式表达，氨基酸序列如下：

Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser

1               5                   10                   15                 20

Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys

21              25                  30                  35                  40

Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys

41              45                  50                  55                  60

Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly

61              65                  70                  75                  80

Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala

81              85                  90                  95                  100

Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly

101             105                 110                 115                 120

Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro

121             125                 130                 135                 140

Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu

141             145                 150                 155                 160

Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr

161             165                 170                 175                 180

Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu

181             185                 190                 195                 200

Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser

201             205                 210                 215                 220

Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser

221             225                 230                 235                 240

Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu

241             245                 250                 255                 260

Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala

261             265                 270                 275                 280

Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys

281             285                 290                 295                 300

Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly

301             305                 310                 315                 320

Ala Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met

321             325                 330                 335                 340

Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn

341             345                 350                 355                 360

Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala

361             365                 370                 375                 380

Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn

381             385                 390                 395                 400

Thr Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His Asp Ile Lys

401             405                 410                 415                 420

Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly

421             425                 430                 435                 440

Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met

441             445                 450                 455                 460

Arg Cys Arg Ala Ile Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val

461             465                 470                 475                 480

Gly Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser Glu Lys Ile

481             485                 490                 495                 500

His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp

501             505                 510                 515                 520

His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser

521             525                 530                 535      。

2.白喉毒素突变体CRM197转录因子cDNA，其特征在于，具有如下序列：

atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa cttttcttcg    60

taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca aaagccaaaa   120

tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac cgacaataaa   180

tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa agctggaggc   240

gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt ggataatgcc   300

gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga gcaagtcgga   360

acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct cagccttccc   420

ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc gaaagcgtta   480

agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga tgcgatgtat   540

gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg tagctcattg   600

tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa gatagagtct   660

ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa aacagtatct   720

gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga gcatcctgaa   780

ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc taactatgcg   840

gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa tttggaaaag   900

acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat tgcagacggt   960

gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc gtctttaatg  1020

gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc tgcatataat  1080

tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa tcgtcccgcg  1140

tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt cagttggaac  1200

actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca cgacataaaa  1260

attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac tattcctgga  1320

aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa aataaggatg  1380

cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc tgtttatgtt  1440

ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc ggagaaaatt  1500

cattctaatg aaatttcgtc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa aacagtagat  1560

cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagcta a           1611。

3.白喉毒素突变体CRM197的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)克隆编码CRM197的基因

设计CRM197的DNA序列及引物序列；合成两条重组质粒鉴定引物；

(2)构建表达CRM197的重组表达质粒

将CRM197的DNA序列与载体DNA进行酶切、纯化及连接、转化；筛选并鉴定含目的基因的阳性重组子，具体包括重组子质粒DNA的抽提、PCR筛选、酶切筛选；

(3)转化至大肠杆菌表达宿主中以包涵体形式表达

将鉴定正确的重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主中表达，进行筛选、鉴定及表达具体包括目的蛋白的诱导表达、目的蛋白聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳分析；将表达的菌株进行测序鉴定重组质粒的正确性；

(4)CRM197纯化

包括包涵体的提取、洗涤、变复性、上阴离子柱纯化以及分子筛纯化，目的蛋白的分析鉴定，包括纯化蛋白的聚丙烯酰胺SDS-PAGE电泳。

4.如权利要求3所述的白喉毒素突变体CRM197的制备方法，其特征在于，步骤(1)中

以包涵体形式表达CRM197的DNA序列如下：

ggaattccat atgggcgctg atgatgttgt tgattcttct aaatcttttg tgatggaaaa    60

cttttcttcg taccacggga ctaaacctgg ttatgtagat tccattcaaa aaggtataca   120

aaagccaaaa tctggtacac aaggaaatta tgacgatgat tggaaagggt tttatagtac   180

cgacaataaa tacgacgctg cgggatactc tgtagataat gaaaacccgc tctctggaaa   240

agctggaggc gtggtcaaag tgacgtatcc aggactgacg aaggttctcg cactaaaagt   300

ggataatgcc gaaactatta agaaagagtt aggtttaagt ctcactgaac cgttgatgga   360

gcaagtcgga acggaagagt ttatcaaaag gttcggtgat ggtgcttcgc gtgtagtgct   420

cagccttccc ttcgctgagg ggagttctag cgttgaatat attaataact gggaacaggc   480

gaaagcgtta agcgtagaac ttgagattaa ttttgaaacc cgtggaaaac gtggccaaga   540

tgcgatgtat gagtatatgg ctcaagcctg tgcaggaaat cgtgtcaggc gatcagtagg   600

tagctcattg tcatgcataa atcttgattg ggatgtcata agggataaaa ctaagacaaa   660

gatagagtct ttgaaagagc atggccctat caaaaataaa atgagcgaaa gtcccaataa   720

aacagtatct gaggaaaaag ctaaacaata cctagaagaa tttcatcaaa cggcattaga   780

gcatcctgaa ttgtcagaac ttaaaaccgt tactgggacc aatcctgtat tcgctggggc   840

taactatgcg gcgtgggcag taaacgttgc gcaagttatc gatagcgaaa cagctgataa   900

tttggaaaag acaactgctg ctctttcgat acttcctggt atcggtagcg taatgggcat   960

tgcagacggt gccgttcacc acaatacaga agagatagtg gcacaatcaa tagctttatc  1020

gtctttaatg gttgctcaag ctattccatt ggtaggagag ctagttgata ttggtttcgc  1080

tgcatataat tttgtagaga gtattatcaa tttatttcaa gtagttcata attcgtataa  1140

tcgtcccgcg tattctccgg ggcataaaac gcaaccattt cttcatgacg ggtatgctgt  1200

cagttggaac actgttgaag attcgataat ccgaactggt tttcaagggg agagtgggca  1260

cgacataaaa attactgctg aaaatacccc gcttccaatc gcgggtgtcc tactaccgac  1320

tattcctgga aagctggacg ttaataagtc caagactcat atttccgtaa atggtcggaa  1380

aataaggatg cgttgcagag ctatagacgg tgatgtaact ttttgtcgcc ctaaatctcc  1440

tgtttatgtt ggtaatggtg tgcatgcgaa tcttcacgtg gcatttcaca gaagcagctc  1500

ggagaaaatt cattctaatg aaatttcgtc ggattccata ggcgttcttg ggtaccagaa  1560

aacagtagat cacaccaagg ttaattctaa gctatcgcta ttttttgaaa tcaaaagcta  1620

aaagcttgcg gccgc                                                   1635。

5.如权利要求2所述的白喉毒素突变体CRM197的制备方法，其特征在于，步骤(1)引物序列如下：

正向引物：5’-catatgggcgctgatgatgtt-3’

反向引物：5’-gcggccgcaagcttttagctt-3’。

6.如权利要求3所述的白喉毒素突变体CRM197的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的适用大肠杆菌表达的载体是PET系列载体、PACYC载体或PMBPC载体。

7.如权利要求3所述的白喉毒素突变体CRM197的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的大肠杆菌表达宿主是BL21(DE3)、JM109(DE3)、OrigmaB(DE3)或Resseta(DE3)。

8.如权利要求3所述的白喉毒素突变体CRM197的纯化方法，其特征在于，步骤(4)中所述的阴离子柱纯化，包括DEAE柱或Q柱。

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