CN111000991A

CN111000991A - 新型柯萨奇病毒a组6型重组亚单位蛋白疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN111000991A
Application number: CN201911328786.9A
Authority: CN
Inventors: 高孟; 沈钱通; 杨宏宏; 庄昉成; 毛子安
Original assignee: ZHEJIANG PUKANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: ZHEJIANG PUKANG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2020-04-14
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN111000991B

Abstract

本发明提供了一种新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗及其制备方法。本发明为人工设计一种新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗。该疫苗包括具有免疫佐剂效果的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白与CV‑A6抗原结构蛋白进行融合设计形成的重组蛋白，重组蛋白通过大肠杆菌表达，层析柱分离、纯化、配伍，最终制备得到具有良好免疫原性的重组亚单位蛋白疫苗。该疫苗可以有效激活机体产生针对柯萨奇病毒A组6型的中和抗体，同时可以有效预防柯萨奇病毒A组6型对机体的感染。本发明疫苗通过对表达基因进行密码自由化，实现目的蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效表达，从而大大提高制备效率，降低生产成本，为大规模人群的推广免疫接种奠定的基础。

Description

新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，特别是一种新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗的制备方法。

背景技术

手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病。大多数患者仅表现为发热或口腔、手、足部位的疱疹和皮疹等，少数患者发病较重，可出现心肌炎、呼吸道感染、脑膜炎、脑炎等，重症儿童病情变化快，可引起多种并发症而导致死亡。手足口病对不同年龄段幼儿均可感染发病，以5岁及以下儿童为主，尤其是3岁及以下儿童发病率最高，占发病数85％-95％。近年来，手足口病已在世界多个地区暴发和流行。我国大部分省份均有手足口病流行报道，少数省份爆发流行并报告死亡病例，且病例数有逐年增多的趋势，因而我国已于2008年将该传染病列入法定丙类传染病管理。从手足口病整个病原体分布报道来看，引起我国手足口病流行的病原体主要是肠道病毒71型(EV-A71)、柯萨奇A组16型(CV-A16)和柯萨奇A组6型(CV-A6)。

治疗手足口病的特效药物至今未见面世，接种预防性疫苗是该病防控最为经济、有效的手段，因此研发手足口预防性疫苗具有十分重要的社会意义和市场前景。我国于2016年完成了首个针对EV-A71病毒预防性疫苗的Ⅲ期临床试验，该灭活疫苗具有良好的免疫原性和安全性，获得国家食品药品监督管理局批准生产上市。而针对CV-A16的灭活病毒疫苗等研究也已取得了一定的进展，已有厂家向国家药监部门申报了临床试验申请。预计不久的将来随着EV-A71和CV-A16灭活病毒疫苗的研制成功和投入使用，易感人群将建立针对这两个病毒的免疫屏障。然而，这两种病毒疫苗诱导的免疫力并不能提供对其它手足口病病原的交叉保护，因此有必要开展CV-A6疫苗的研究。

目前，常规的手足口疫苗制备主要通过灭活人工培养的手足口病毒来实现。这种制备方式因为涉及生产用基质细胞培养，成本较大，产能也受到较大限制。为了提高疫苗的产能，降低成本，利用重组蛋白表达系统(原核/真核)来高效获得病毒抗原蛋白是一种有效、可行的技术手段。通过基因工程技术，构建一个表达系统来高效表达具有良好免疫原性的CV-A6抗原蛋白，对于CV-A6病毒在人际传播的防治有着极大价值和意义。

发明内容

本发明的目的是设计一种新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗，并提供该疫苗制备方法。

本发明的内容是将具有免疫佐剂效果的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白与CV-A6抗原结构蛋白(CV-A6 VP1)进行融合设计，形成一种新的重组融合蛋白命名为CRM197-CVA6VP1，该蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其中第1-193位为CRM197的功能区，第194-208位为两个蛋白的融合链接结构，第209-513位为CV-A6抗原结构蛋白(CVA6VP1)。CRM197-CVA6VP1重组融合蛋白可以借助CRM197蛋白的免疫佐剂功能，有效提高CV-A6 VP1蛋白的免疫活性，提高机体的体液免疫水平。

本发明所述CRM197-CVA6VP1重组亚单位蛋白疫苗的制备方法为，以SEQ ID NO.1所述氨基酸序列为模板，设计经过密码子优化的能够在大肠杆菌表达系统中高效表达CRM197-CVA6VP1蛋白的基因序列，最终得到优化后的表达基因SEQ ID NO.2，所得SEQ IDNO.2基因序列插入表达系统中，可以通过大肠杆菌高效表达得到重组的CRM197-CVA6VP1融合蛋白，所得蛋白在经过配伍即得柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗。具体包括如下步骤：

(1)以重组亚单位蛋白疫苗氨基酸序列SEQ ID NO.1为模板，人工合成能够在大肠杆菌表达系统中高效表达CRM197-CVA6VP1蛋白的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；将人工合成的SEQ ID NO.2基因，通过分子克隆技术插入大肠杆菌表达系统，获得表达CRM197-CVA6VP1重组蛋白的重组大肠杆菌；

(2)在37℃条件下培养步骤(1)获得的重组大肠杆菌至对数生长期，在25-37℃温度条件下诱导4-24小时，离心收集菌体沉淀；

(3)将步骤(2)得到的菌体沉淀进行细胞破碎，破碎后离心获得CRM197-CVA6VP1重组蛋白包涵体粗提物；

(4)将步骤(3)得到的CRM197-CVA6VP1重组蛋白包涵体粗提物通过层析柱进行分离纯化、用换相液进行换相复性，得到CRM197-CVA6VP1重组蛋白纯化液；

(5)将步骤(4)所述CRM197-CVA6VP1重组蛋白纯化液与佐剂进行配伍、分装，即得到所需柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗。

进一步地，所述步骤(1)中，人工合成的能够在大肠杆菌表达系统中高效表达CRM197-CVA6VP1蛋白的基因序列还包括在该基因序列5’端引入的组氨酸标签catcaccatcatcaccac，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述步骤(2)中，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂进行诱导，诱导剂终浓度为1毫摩尔/毫升，诱导温度为37℃。

进一步地，所述步骤(4)中的换相液配方为：甘氨酸1-3克，乙二胺四乙酸二钠0.1-0.3克，加水溶解定容至1升，调节pH值至7.0-9.0。

进一步地，所述步骤(4)中的佐剂包括铝佐剂。

本发明的有益效果为：提供了一种具有强免疫原性、低成本、高产能的柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗。该疫苗通过CRM197蛋白来增加CV-A6 VP1蛋白的免疫原性，使得该亚单位疫苗的免疫效果得到保证。同时，本发明所述亚单位蛋白疫苗通过对表达基因进行密码自由化，实现目的蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效表达，从而大大提高制备效率，降低生产成本，为大规模人群的推广免疫接种奠定的基础。

附图说明

图1为CRM197-CVA6VP1重组蛋白表达电泳图谱；其中，M：蛋白分子量Marker；1：诱导表达前；2：25度诱导表达4小时；3：29度诱导表达4小时；4：33度诱导表达4小时；5：37度诱导表达4小时。

图2为不同温度CRM197-CVA6VP1重组蛋白表达量；

图3为CRM197-CVA6VP1重组蛋白纯化电泳图谱；其中，M：蛋白分子量Marker；1：诱导后破菌液；2：破菌液上清；3：柱层析上样；4：柱层析流穿；5：柱层析洗脱。

图4a为柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗诱导沙鼠产生中和抗体；图4b为CRM197重组蛋白增强CVA6VP1重组蛋白的免疫原性；其中，A为免疫CRM197-CVA6VP1重组蛋白组；B为免疫单独的CVA6VP1重组蛋白组。

图5为柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗预防柯萨奇病毒A组6型对沙鼠的感染。

具体实施方式

以下实施例用来解释本发明，但不是限制本发明，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。

实施例1柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白CRM197-CVA6VP1的表达

(1)利用密码子兼并原则以及大肠杆菌对密码子的使用频率，以SEQ ID NO.1所述氨基酸序列为模板，设计出表达CRM197-CVA6VP1重组蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.2，通过XhoI和NcoI两个酶切位点将所合成的基因插入pET28a大肠杆菌表达质粒，得到重组表达质粒。将所得重组表达质粒通过42度热激活法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并通过LB固体培养基平皿进行单克隆筛选，得到表达目的蛋白重组大肠杆菌单克隆菌落，挑取重组大肠杆菌单克隆菌落至5毫升LB液体培养基37℃过夜培养，即得表达目的蛋白重组大肠杆菌种子液。

(2)取重组大肠杆菌种子液，按体积比1：100的比例接种于5毫升LB液体培养基37℃培养过夜培养。将过夜培养后的菌液按体积比1：100的比例接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养菌体OD₆₀₀至0.7，分成四瓶，然后分别加诱导剂(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导(诱导剂终浓度为1毫摩尔/毫升)，四瓶分别在25℃、29℃、33℃、37℃四个温度下连续诱导4小时取样。

(3)四个诱导温度下，CRM197-CVA6VP1重组单位蛋白均有很高的表达量，其中37℃诱导4小时，目的蛋白的相对表达量可达22.3％。(图1、2所示)

上述所用溶液如下：

LB液体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，加水溶解定容至1升。

LB固体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，琼脂粉15克，加水定容至1升。

实施例2柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗的制备

(1)利用密码子兼并原则以及大肠杆菌对密码子的使用频率，以SEQ ID NO.1所述氨基酸序列为模板，设计出表达CRM197-CVA6VP1重组蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.2，并在该核苷酸序列5’端引入组氨酸标签atgcatcacc atcatcaccac，通过人工基因合成技术合成基因序列SEQ ID NO.3，便于后续纯化，并通过XhoI和NcoI两个酶切位点将所合成的基因插入pET28a大肠杆菌表达质粒，得到重组表达质粒。将所得重组表达通过42度热激活法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并通过LB固体培养基平皿进行单克隆筛选，得到表达目的蛋白重组大肠杆菌单克隆菌落，挑取重组大肠杆菌单克隆菌落，用5毫升LB液体培养基37℃过夜培养，即得表达目的蛋白重组大肠杆菌种子液。

(2)取重组大肠杆菌种子液，按1：100的比例接种于5毫升LB液体培养基37℃培养过夜、活化。将过夜培养后的菌液按1：100的比例接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养菌体OD₆₀₀至0.7，然后加诱导剂(IPTG)进行诱导(诱导剂终浓度为1毫摩尔/毫升)，诱导温度为37℃，连续诱导6小时。

(3)用离心机在6000转/分钟条件下离心20分钟收集诱导表达后的菌落沉淀，所得菌落沉淀用破菌缓冲液以1：20的质量体积比重悬，并用超音仪超声破碎菌落细胞壁，超声破碎后的菌液用离心机12000转/分钟离心30分钟收集破菌沉淀。

(4)所得破菌沉淀用变性液溶解，12000转/分钟离心30分钟收集上清。所得上清液用5毫升柱体积(CV)的镍离子亲和层析柱进行层析纯化，层析条件如下：先用5个CV的变性液平衡层析柱，然后上样5毫升至层析柱中，再用5个CV的变性液平衡层析柱，最后用洗脱液洗脱得到CRM197-CVA6VP1重组蛋白纯化液。图3为CRM197-CVA6VP1重组蛋白纯化电泳图谱，从图中可以看出纯化后重组蛋白的纯化结果。结果表明本发明所述亚单位蛋白疫苗通过对表达基因进行密码自由化，实现目的蛋白在大肠杆菌表达系统中的高效表达，从而大大提高制备效率。

(5)将纯化所得CRM197-CVA6VP1重组蛋白纯化液置于10000道尔顿透析袋中，用换相液进行透析换相，换相后的液体用0.22微米过滤器过滤除菌，加入终浓度为1毫克/毫升的铝佐剂，即得柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗原液。

所用溶液如下：

破菌缓冲液：三羟甲基氨基甲烷2.4克,氯化钠29.22克，加水溶解定容至1升，调节pH值至8.0。

变性液：三羟甲基氨基甲烷2.4克,氯化钠29.22克，尿素480g，咪唑3.4克，加水溶解定容至1升，调节pH值至7.5。

洗脱液：三羟甲基氨基甲烷2.4克,氯化钠29.22克，尿素480g，咪唑34克，加水溶解定容至1升，调节pH值至7.5。

换相液：甘氨酸1.5克，甘油50克，加水溶解定容至1升，调节pH值至8.0。

实施例3柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗诱导机体产生中和抗体

(1)以CVA6VP1蛋白序列为模板，设计得到表达CVA6VP1蛋白的核苷酸序列SEQ IDNO.4。按照实施例2的制备方法制备得到单独的CVA6VP1重组蛋白疫苗；

(2)取4周龄长爪沙鼠30只，分成试验组、单独的CVA6VP1重组蛋白组和对照组三组，每组10只，试验组免疫柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗，免疫剂量为20ug/只；单独的CVA6VP1重组蛋白组免疫单独的CVA6VP1重组蛋白疫苗，免疫剂量为20ug/只；对照组注射等量的换相液加铝佐剂。一周后加强免疫，在四周后采集血清。

(3)用无血清培养基倍比稀释沙鼠血清(1:2-1:32)，分别与柯萨奇病毒A组6型病毒稀释液(1000半数细胞感染数(TCID₅₀)/毫升)按体积1:1混合，37度孵育2小时后4度过夜。

(4)按1×10⁴/孔细胞量将人横纹肌瘤细胞接种至96孔细胞培养板中，37度条件下培养细胞至单层。弃去细胞培养板中培养液，无钙镁缓冲液洗涤2次后，按100微升/孔的量加入步骤(3)中的病毒抗体混合液，并补充等体积的病毒维持液，每个血清稀释度设置5个复孔。同时设立无病毒、无血清和空白组作为阴性对照，35度、5％CO₂条件下培养5-7天，观察细胞病变状况。按Reed-Muench两氏法计算抗体血清效价。结果如图4所示，所得柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗可以有效诱导机体产生针对柯萨奇病毒A组6型病毒的中和抗体的几何平均数为33.18，与对照组比，有显著性差异。而单独的CVA6VP1重组蛋白组中和抗体的几何平均数为5.89，表明CRM197蛋白来增加CV-A6 VP1蛋白的免疫原性，使得该亚单位疫苗的免疫效果得到保证。

本实施例中所用材料和溶液如下所示，但不限于此：

所用柯萨奇病毒A组6型病毒通过手足口病病人咽拭子样本分离培养得到，并进行全基因测序并以上传至基因库(编号：MH536772.1)。

所用人横纹肌瘤细胞来自美国模式培养物集存库(ATCC)。

无钙镁缓冲液：氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸氢二钠1.44克、磷酸二氢钾0.24克,用盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水溶解定容至1升。

病毒维持液：用市售的DMEM细胞培养基加入1％的胎牛血清配制而成。

实施例4柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗预防柯萨奇病毒A组6型对机体的感染

(1)取4周龄长爪沙鼠20只，分成试验组和对照组两组，每组10只，试验组免疫柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗，免疫剂量为20ug/只；对照组免疫同体积的换相液加铝佐剂混合物。一周后加强免疫一次。

(2)在初次免疫三周后，每只长爪沙鼠腹腔接种柯萨奇病毒A组6型病毒液1×10⁴TCID₅₀，观察长爪沙鼠存活情况。结果如图5所示，对照组在攻毒后第3天开始出现沙鼠死亡，在第13天沙鼠全部死亡；试验组未发现沙鼠死亡，说明本发明提供的疫苗对沙鼠的保护率达100％。

上述实施例仅仅是本发明技术构思实现形式的列举，本发明的保护范围不仅限于上述实施例，本发明的保护范围可延伸至本领域技术人员根据本发明的技术构思所能想到的等同技术手段。

序列表

<110> 浙江普康生物技术股份有限公司

<120> 新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗及其制备方法

<141> 2019-12-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 513

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

195 200 205

Asn Asp Pro Ile Thr Asn Ala Val Glu Ser Ala Val Ser Ala Leu Ala

210 215 220

Asp Thr Thr Ile Ser Arg Val Thr Ala Ala Asn Thr Ala Ala Ser Thr

225 230 235 240

His Ser Leu Gly Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr

245 250 255

Gly Ala Ser Ser Asn Ala Ser Asp Glu Asn Leu Ile Glu Thr Arg Cys

260 265 270

Val Met Asn Arg Asn Gly Val Asn Glu Ala Ser Val Glu His Phe Tyr

275 280 285

Ser Arg Ala Gly Leu Val Gly Val Val Glu Val Lys Asp Ser Gly Thr

290 295 300

Ser Leu Asp Gly Tyr Thr Val Trp Pro Ile Asp Val Met Gly Phe Val

305 310 315 320

Gln Gln Arg Arg Lys Leu Glu Leu Ser Thr Tyr Met Arg Phe Asp Ala

325 330 335

Glu Phe Thr Phe Val Ser Asn Leu Asn Asp Ser Thr Thr Pro Gly Met

340 345 350

Leu Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala Pro Lys Pro Asp Ser

355 360 365

Arg Lys Ser Tyr Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Ala

370 375 380

Lys Leu Ser Asp Pro Pro Pro Gln Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro

385 390 395 400

Ala Thr Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu

405 410 415

His Lys Gln Ala Thr Asn Leu Gln Tyr Gly Gln Cys Pro Asn Asn Met

420 425 430

Met Gly His Phe Ala Ile Arg Thr Val Ser Glu Ser Thr Thr Gly Lys

435 440 445

Asn Val His Val Arg Val Tyr Met Arg Ile Lys His Val Arg Ala Trp

450 455 460

Val Pro Arg Pro Leu Arg Ser Gln Ala Tyr Met Val Lys Asn Tyr Pro

465 470 475 480

Thr Tyr Ser Gln Thr Ile Thr Asn Thr Ala Thr Asp Arg Ala Ser Ile

485 490 495

Thr Thr Thr Asp Tyr Glu Gly Gly Val Pro Ala Asn Pro Gln Arg Thr

500 505 510

Ser

<210> 2

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcgcagacg acgtagtaga ttctagcaaa tccttcgtta tggagaactt cagctcttat 60

cacggcacca aaccaggcta cgtagactcc atccagaaag gtatccagaa gccgaaatct 120

ggtactcaag gcaactatga tgatgactgg aaagagttct acagcaccga taacaaatac 180

gatgcagcgg gttactctgt ggataacgag aacccgctgt ccggcaaagc aggtggtgtg 240

gttaaagtaa cctatccagg cctgactaaa gtgctggcgc tgaaagtgga caacgcggaa 300

accatcaaga aagagctggg tctgagcctg actgagccgc tgatggaaca ggttggcacc 360

gaagagttca tcaagcgttt cggcgatggt gcttcccgtg tggtactgag cctgccattt 420

gctgaaggtt ctagctctgt tgagtacatt aacaactggg aacaagcgaa agccctgtcc 480

gtagagctgg aaatcaactt cgagactcgc ggtaaacgtg gtcaagatgc tatgtacgaa 540

tacatggcac aggcgtgcgc tggcaaccgt gtacgtcgtg gtggtggcgg ttctggcggt 600

ggtggtagcg gtggtggtgg ttctaatgac ccgattacta acgcagtgga atctgctgtg 660

agcgctctgg cagacaccac tatctctcgc gtaactgctg cgaacaccgc tgcttctacc 720

cactctctgg gtactggtcg tgttccagct ctgcaagcag cagaaactgg tgcgtctagc 780

aacgcaagcg acgagaatct gatcgaaacc cgctgtgtga tgaaccgcaa cggcgttaat 840

gaagcaagcg ttgagcactt ctacagccgt gcgggtctgg ttggtgttgt ggaggtgaaa 900

gactctggca cctccctgga tggttatacc gtttggccga tcgacgttat gggtttcgta 960

caacagcgtc gtaaactgga actgtccact tacatgcgct ttgacgcgga gttcactttc 1020

gtgtccaacc tgaacgactc tactactcca ggtatgctgc tgcaatacat gtacgtaccg 1080

ccaggtgcac cgaaaccgga cagccgtaag tcctaccagt ggcagactgc gaccaacccg 1140

tctgtatttg ctaaactgag cgatccgcca ccgcaggtga gcgtgccatt catgtctccg 1200

gcaaccgcgt accagtggtt ctacgacggt tatccaactt tcggcgaaca taaacaggct 1260

accaacctgc aatacggcca gtgcccaaac aacatgatgg gtcatttcgc aatccgcacc 1320

gtttccgagt ctaccactgg taagaacgtt catgttcgcg tttacatgcg tatcaaacat 1380

gttcgtgcgt gggtgccacg tccgctgcgt tctcaggcgt acatggttaa gaactacccg 1440

acctattccc agactatcac taacaccgca accgatcgtg cttctattac taccactgat 1500

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<211> 1560

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atgcatcacc atcatcacca cggcgcagac gacgtagtag attctagcaa atccttcgtt 60

atggagaact tcagctctta tcacggcacc aaaccaggct acgtagactc catccagaaa 120

ggtatccaga agccgaaatc tggtactcaa ggcaactatg atgatgactg gaaagagttc 180

tacagcaccg ataacaaata cgatgcagcg ggttactctg tggataacga gaacccgctg 240

tccggcaaag caggtggtgt ggttaaagta acctatccag gcctgactaa agtgctggcg 300

ctgaaagtgg acaacgcgga aaccatcaag aaagagctgg gtctgagcct gactgagccg 360

ctgatggaac aggttggcac cgaagagttc atcaagcgtt tcggcgatgg tgcttcccgt 420

gtggtactga gcctgccatt tgctgaaggt tctagctctg ttgagtacat taacaactgg 480

gaacaagcga aagccctgtc cgtagagctg gaaatcaact tcgagactcg cggtaaacgt 540

ggtcaagatg ctatgtacga atacatggca caggcgtgcg ctggcaaccg tgtacgtcgt 600

ggtggtggcg gttctggcgg tggtggtagc ggtggtggtg gttctaatga cccgattact 660

aacgcagtgg aatctgctgt gagcgctctg gcagacacca ctatctctcg cgtaactgct 720

gcgaacaccg ctgcttctac ccactctctg ggtactggtc gtgttccagc tctgcaagca 780

gcagaaactg gtgcgtctag caacgcaagc gacgagaatc tgatcgaaac ccgctgtgtg 840

atgaaccgca acggcgttaa tgaagcaagc gttgagcact tctacagccg tgcgggtctg 900

gttggtgttg tggaggtgaa agactctggc acctccctgg atggttatac cgtttggccg 960

atcgacgtta tgggtttcgt acaacagcgt cgtaaactgg aactgtccac ttacatgcgc 1020

tttgacgcgg agttcacttt cgtgtccaac ctgaacgact ctactactcc aggtatgctg 1080

ctgcaataca tgtacgtacc gccaggtgca ccgaaaccgg acagccgtaa gtcctaccag 1140

tggcagactg cgaccaaccc gtctgtattt gctaaactga gcgatccgcc accgcaggtg 1200

agcgtgccat tcatgtctcc ggcaaccgcg taccagtggt tctacgacgg ttatccaact 1260

ttcggcgaac ataaacaggc taccaacctg caatacggcc agtgcccaaa caacatgatg 1320

ggtcatttcg caatccgcac cgtttccgag tctaccactg gtaagaacgt tcatgttcgc 1380

gtttacatgc gtatcaaaca tgttcgtgcg tgggtgccac gtccgctgcg ttctcaggcg 1440

tacatggtta agaactaccc gacctattcc cagactatca ctaacaccgc aaccgatcgt 1500

gcttctatta ctaccactga ttatgaaggt ggtgttccgg caaacccgca acgtacctct 1560

<210> 4

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgcatcatc atcatcatca taatgacccg attactaacg cagtggaatc tgctgtgagc 60

gctctggcag acaccactat ctctcgcgta actgctgcga acaccgctgc ttctacccac 120

tctctgggta ctggtcgtgt tccagctctg caagcagcag aaactggtgc gtctagcaac 180

gcaagcgacg agaatctgat cgaaacccgc tgtgtgatga accgcaacgg cgttaatgaa 240

gcaagcgttg agcacttcta cagccgtgcg ggtctggttg gtgttgtgga ggtgaaagac 300

tctggcacct ccctggatgg ttataccgtt tggccgatcg acgttatggg tttcgtacaa 360

cagcgtcgta aactggaact gtccacttac atgcgctttg acgcggagtt cactttcgtg 420

tccaacctga acgactctac tactccaggt atgctgctgc aatacatgta cgtaccgcca 480

ggtgcaccga aaccggacag ccgtaagtcc taccagtggc agactgcgac caacccgtct 540

gtatttgcta aactgagcga tccgccaccg caggtgagcg tgccattcat gtctccggca 600

accgcgtacc agtggttcta cgacggttat ccaactttcg gcgaacataa acaggctacc 660

aacctgcaat acggccagtg cccaaacaac atgatgggtc atttcgcaat ccgcaccgtt 720

tccgagtcta ccactggtaa gaacgttcat gttcgcgttt acatgcgtat caaacatgtt 780

cgtgcgtggg tgccacgtcc gctgcgttct caggcgtaca tggttaagaa ctacccgacc 840

tattcccaga ctatcactaa caccgcaacc gatcgtgctt ctattactac cactgattat 900

gaaggtggtg ttccggcaaa cccgcaacgt acctct 936

Claims

1.一种新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗，其特征在于，所述重组亚单位蛋白疫苗包括由白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白与CV-A6抗原结构蛋白重组融合形成的重组亚单位蛋白CRM197-CVA6VP1，重组亚单位蛋白CRM197-CVA6VP1的氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示。

2.一种权利要求1所述新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以重组亚单位蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.1为模板，人工合成能够在大肠杆菌表达系统中高效表达CRM197-CVA6VP1蛋白的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；将人工合成的SEQ ID NO.2基因，通过分子克隆技术插入大肠杆菌表达系统，获得表达CRM197-CVA6VP1重组蛋白的重组大肠杆菌；

3.根据权利要求2所述新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，人工合成的能够在大肠杆菌表达系统中高效表达CRM197-CVA6VP1蛋白的基因序列还包括在该基因序列5’端引入的组氨酸标签catcacc atcatcaccac，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂进行诱导，诱导剂终浓度为1毫摩尔/毫升，诱导温度为37℃。

5.根据权利要求2所述新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的换相液配方为：甘氨酸1-3克，乙二胺四乙酸二钠0.1-0.3克，加水溶解定容至1升，调节pH值至7.0-9.0。

6.根据权利要求2所述新型柯萨奇病毒A组6型重组亚单位蛋白疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的佐剂包括铝佐剂。