CN111979213A - 新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体及制备方法 - Google Patents

新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了新型冠状病毒SARS‑CoV‑2主蛋白酶与紫草素复合物晶体及制备方法，包括如下步骤：制备M‑pro蛋白；生成M‑pro蛋白晶体；把M‑pro蛋白晶体与紫草素按比例混合；采用气相扩散法中的悬滴法进行结晶，得到M‑pro蛋白与紫草素复合物晶体。本发明优点有：获得新型冠状病毒SARS‑CoV‑2主蛋白酶M‑pro蛋白与中药活性成分紫草素复合物晶体，有助于了解M‑pro蛋白与紫草素相互作用的分子机理，阐明体内M‑pro蛋白与紫草素的结合位点，揭示中药治疗新冠病毒的新型分子机制，为中药进入临床提供理论依据。便于通过开发出特效口服中药制剂形式及利用现代药物化学手段进行改造，从而为新型冠状病毒的一线防控治疗提供有疗效的方剂。

Description

新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体及制 备方法
技术领域
本发明涉及蛋白质结晶技术领域，尤其涉及新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与中药活性成分复合物结晶技术。
背景技术
全球新型冠状病毒SARS-CoV-2(新冠病毒)感染疫情发展凶猛，国内外大型药企和科研机构都相继投入到SARS-CoV-2的治疗药物和疫苗开发中。研究表明RNA聚合酶抑制剂瑞德西韦(Remdesivir)、洛匹那韦/利托那韦、阿比朵儿/达芦那韦、磷酸氯喹、干扰素等在体外细胞水平和体内均表现出对SARS-CoV-2的抑制作用，但是，这些药物都不是针对新型冠状病毒靶点的靶向药物。
在这场新型冠状病毒防治疫情的战争中，中药成分在治疗该病毒引起的新型冠状病毒肺炎(新冠肺炎)当中起着至关重要的作用。由于中药的安全性和预防中的独特作用，现已有大量确有疗效的方剂应用于临床治疗中，能够缩短患者的病程和降低重症的发生率。因此，靶向新冠病毒靶点的中药成分的研究和理解中药活性成分如何抑制新冠病毒的分子机制显得尤为重要。
M-pro蛋白是新型冠状病毒产生的主要的蛋白酶，冠状病毒大多数功能蛋白(非结构蛋白)由ORF1ab基因编码，先翻译成一个多蛋白体(7096aa)，再由M-pro蛋白切割成多个有活性的蛋白，抑制M-pro蛋白能够有效抑制病毒的感染与复制。因此，M-pro蛋白是治疗SARS-CoV-2药物的最重要、最有潜力的靶点之一。
通过解析M-pro蛋白与中药成分的复合结构，有利于我们更好的理解其作用机制，为基于结构的靶向药物设计提供基础研究。
发明内容
本发明的目的在于提供新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体及制备方法，以解决现有技术中基于结构的靶向药物设计缺乏研究基础的问题。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体，是M-pro蛋白与紫草素复合物晶体。
一种新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，
包括如下步骤：
(1)制备M-pro蛋白；
(2)生成M-pro蛋白晶体；
(3)把M-pro蛋白晶体与紫草素按比例混合；采用气相扩散法中的悬滴法进行结晶，得到M-pro蛋白与紫草素复合物晶体。
进一步地，所述M-pro蛋白的浓度是10mg/mL以上。
进一步地，所述步骤(2)是使用气相扩散法中的座滴法获得蛋白质的结晶，先在48孔蛋白结晶板中的池液孔中加入80μl池液1，然后用晶体枪分别吸取1μl蛋白质点到左边点样孔中，2μl蛋白质点到右边点样孔中，再用枪吸取1μl池液1分别滴在左右两个点样孔上，最后用胶布密封；置于20℃，3天后成功获得M-pro蛋白晶体。
进一步地，所述步骤(3)是采用气相扩散法中的悬滴法进行混合物的结晶，在24孔蛋白结晶板中的池液孔加入500μl池液2，先用晶体枪吸取3μl池液2点到在盖玻片上，然后滴上浓度为2mM紫草素化合物0.3μl，得到含有池液2和紫草素的混合物，M-pro蛋白晶体放入含有池液2和紫草素的混合物中，将含有M-pro蛋白晶体和紫草素与池液2混合物的盖玻片反盖到边缘涂有真空脂的盛有500μl池液2的容器上，轻轻压紧，使液滴与容器内的池液2能够在同一个密闭的空间内，结晶温度为20℃，40h后成功获得复合物晶体。
进一步地，所述池液1和池液2均是0.1M HEPES pH7.5，质量分数为20％PEG10000的混合物。
进一步地，所述步骤(1)的M-pro蛋白的获得步骤包括：构建M-pro蛋白表达质粒；将M-pro蛋白表达质粒转化，诱导培养表达M-pro蛋白；纯化M-pro蛋白。
进一步地，所述诱导培养表达M-pro蛋白的过程：取100μL培养菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为0.67mmol，30℃，200rpm，诱导5小时。
进一步地，所述纯化M-pro蛋白的过程是：过夜诱导后以6000rpm的转速离心15min，收集沉淀物即菌体，称3～4g，以缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在缓冲液1中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱1～2ml进行蛋白纯化实验，镍柱使用前用20倍柱体积缓冲液2对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、100mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；含150mM、300mM咪唑的洗脱液含有目的蛋白M-pro，然后将150mM和300mM咪唑浓度所得的洗脱液于缓冲液3中4℃过夜透析，再使用10kDa分子量截止浓缩器浓缩，直至浓度为10mg/mL以上。
进一步地，所述缓冲液1含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，1mM DTT，10mM咪唑；
所述缓冲液2含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole；
所述缓冲液3含有300mMNaCl，25mM HEPES，5mM DTT，质量分数为5％甘油。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
得到M-pro与紫草素复合物晶体的结构，有助于了解M-pro与紫草素相互作用的分子机理，阐明体内M-pro与紫草素的结合位点，揭示中药治疗新冠病毒的新型分子机制，为中药进入临床提供理论依据。便于通过开发出特效口服中药制剂形式及利用现代药物化学手段进行改造，从而为新型冠状病毒的一线防控治疗提供有疗效的方剂，有望摆脱针对新型冠状病毒无特效药的尴尬境地，甚至能针对整个冠状病毒家族提供了行之有效的治疗药物。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1是M-pro蛋白透析后SDS-PAGE试验实验图；
图2是M-pro蛋白晶体实验图；
图3是M-pro蛋白-紫草素复合物晶体实验图；
图4是M-pro蛋白-紫草素复合物晶体的X射线衍射测试实验图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
1.M-pro蛋白表达质粒的构建
将新型冠状病毒M-pro蛋白(氨基酸1-933)的基因克隆到pET28a载体中，以构建表达质粒，此项工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，M-pro蛋白大小为27kDa，编码新型冠状病毒M-pro蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1：
5'--3'
ggatccAGCGGCTTTCGTAAAATGGCATTTCCGAGCGGTAAAGTGGAAGGTTGTATGGTTCAGGTGACCTGTGGCACCACCACCCTGAATGGCCTGTGGCTGGATGATGTGGTGTATTGTCCGCGTCATGTTATTTGTACCTCAGAAGATATGCTGAATCCGAATTATGAGGACCTGCTGATTCGTAAATCTAATCATAATTTTCTGGTTCAGGCAGGCAATGTTCAGCTGCGCGTGATTGGTCATAGTATGCAGAATTGTGTGCTGAAACTGAAAGTGGATACCGCAAATCCGAAAACCCCGAAATATAAATTTGTTCGCATTCAGCCGGGCCAGACCTTTAGCGTGCTGGCATGTTATAATGGCTCTCCGAGCGGCGTGTATCAGTGTGCAATGCGCCCGAATTTTACCATTAAAGGTAGTTTTCTGAATGGCTCTTGTGGTAGCGTGGGCTTTAATATTGATTATGATTGTGTGAGCTTTTGTTATATGCATCACATGGAACTGCCGACCGGCGTTCATGCAGGTACCGATCTGGAAGGCAATTTTTATGGTCCGTTTGTTGATCGCCAGACCGCACAGGCAGCAGGTACCGATACCACCATTACCGTTAATGTTCTGGCATGGCTGTATGCAGCAGTTATTAATGGCGATCGTTGGTTTCTGAATCGCTTTACCACCACCCTGAATGATTTTAATCTGGTTGCAATGAAATATAATTATGAACCGCTGACCCAGGATCATGTTGATATTCTGGGCCCGCTGTCAGCACAGACCGGTATTGCAGTTCTGGATATGTGTGCAAGCCTGAAAGAACTGCTTCAAAATGGCATGAATGGTCGTACCATTCTGGGTAGCGCACTGCTGGAAGATGAATTTACCCCGTTTGATGTGGTGCGCCAGTGTAGCGGCGTGACCTTTCAGTAActcgag(下划线部分为酶切位点)
构建好重组质粒，再将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中，涂板于含有50μg/ml抗生素Kan+的LB平板上培养，挑选菌落，质粒抽提并经酶切鉴定筛选阳性单克隆。验证成功后，构建表达质粒。最后得到M-pro质粒冻干粉。
2.M-pro表达质粒的转化
将5μgM-pro质粒冻干粉在12000rpm离心5min,加入30μL去离子水，振荡溶解，12000rpm离心10min。将上清液取2μl转化到100μL Escherichia coli BL21 Rosetta(DE3)感受态菌株中，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，加入500μL的LB液体培养基，在37℃摇床、150rpm的摇床上培养1h，取30μL培养液涂布到含有50μg/ml Kan+抗生素LB固体培养板上，在温度为37℃的培养箱中培养过夜；挑选出单一菌落，加入到含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养8小时。
3.M-pro蛋白的诱导表达
取100μL培养菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为0.67mmol，30℃，200rpm，诱导5小时。
4.M-pro蛋白的纯化
诱导后以6000rpm的转速离心15min，收集沉淀物即菌体，称3～4g，以缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，1mM DTT，10mM咪唑的缓冲液1中。高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀。选用镍柱(1～2ml)进行蛋白纯化实验，经过数次实验，对蛋白纯化条件进行优化。镍柱使用前用20倍柱体积含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole的缓冲液2对柱子进行平衡。再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、100mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液。含150mM、300mM咪唑的洗脱液含有目的蛋白M-pro蛋白，然后将150mM和300mM咪唑浓度所得的洗脱液于含有300mMNaCl，25mMHEPES，5mM DTT，5％甘油的缓冲液3中4℃过夜透析，透析得到的蛋白比过分子筛得到的蛋白更稳定,透析后的蛋白不容易聚集沉降。将透析过的溶液进行SDS-PAGE试验，结果如图1所示，再使用10kDa分子量截止浓缩器浓缩，直至浓度为10mg/mL以上。
在此说明一下，洗脱液就是以平衡柱子所用的缓冲液2加入相应浓度的咪唑而得到的。
5.结晶的生成
使用气相扩散法中的座滴法获得蛋白质的结晶，先在48孔蛋白结晶板中的池液孔中加入80μl池液1(0.1M HEPES pH7.5，20％PEG10000)，然后用晶体枪分别吸取1μl蛋白质点到左边点样孔中，2μl蛋白质点到右边点样孔中，再用枪吸取1μl池液1分别滴在左右两个点样孔上，最后用胶布密封。置于20℃约3天后成功获得蛋白质晶体(单晶)，如图2所示。
随后采用气相扩散法中的悬滴法进行混合物的结晶。在24孔蛋白结晶板中的池液孔加入500μl池液2(0.1M HEPES pH7.5，20％PEG10000)，先用晶体枪吸取3μl池液2(0.1MHEPES pH7.5，20％PEG10000)点到在盖玻片上，然后滴上浓度为2mM紫草素化合物0.3μl，得到含有池液2和紫草素的混合物，最后将座滴法得到的单晶完整捞出放入含有池液2和紫草素的混合物中，将含有单晶和紫草素与池液2混合物的盖玻片反盖到边缘涂有真空脂的盛有500μl池液2的容器上，轻轻压紧，使液滴与容器内的池液2能够在同一个密闭的空间内，结晶温度为20℃，约40h后成功获得复合物晶体，如图3所示。
将获得的晶体送往上海光源进行X射线衍射测试，衍射结果如图4所示，通过该实验结果能够解析蛋白质结晶复合物的结构。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
序列表
<110> 李健
张进
周学兰
万双燕
<120> 新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体及制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 933
<212> DNA
<213> 新型冠状病毒（SARS-CoV-2 ）(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccagcg gctttcgtaa aatggcattt ccgagcggta aagtggaagg ttgtatggtt 60
caggtgacct gtggcaccac caccctgaat ggcctgtggc tggatgatgt ggtgtattgt 120
ccgcgtcatg ttatttgtac ctcagaagat atgctgaatc cgaattatga ggacctgctg 180
attcgtaaat ctaatcataa ttttctggtt caggcaggca atgttcagct gcgcgtgatt 240
ggtcatagta tgcagaattg tgtgctgaaa ctgaaagtgg ataccgcaaa tccgaaaacc 300
ccgaaatata aatttgttcg cattcagccg ggccagacct ttagcgtgct ggcatgttat 360
aatggctctc cgagcggcgt gtatcagtgt gcaatgcgcc cgaattttac cattaaaggt 420
agttttctga atggctcttg tggtagcgtg ggctttaata ttgattatga ttgtgtgagc 480
ttttgttata tgcatcacat ggaactgccg accggcgttc atgcaggtac cgatctggaa 540
ggcaattttt atggtccgtt tgttgatcgc cagaccgcac aggcagcagg taccgatacc 600
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tatgaaccgc tgacccagga tcatgttgat attctgggcc cgctgtcagc acagaccggt 780
attgcagttc tggatatgtg tgcaagcctg aaagaactgc ttcaaaatgg catgaatggt 840
cgtaccattc tgggtagcgc actgctggaa gatgaattta ccccgtttga tgtggtgcgc 900
cagtgtagcg gcgtgacctt tcagtaactc gag 933

Claims (10)

1.新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体，其特征在于：
是M-pro蛋白与紫草素复合物晶体。
2.一种如权利要求1所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
包括如下步骤：
(1)制备M-pro蛋白；
(2)生成M-pro蛋白晶体；
(3)把M-pro蛋白晶体与紫草素按比例混合；采用气相扩散法中的悬滴法进行结晶，得到M-pro蛋白与紫草素复合物晶体。
3.根据权利要求2所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述M-pro蛋白的浓度是10mg/mL以上。
4.根据权利要求2所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(2)是使用气相扩散法中的座滴法获得蛋白质的结晶，先在48孔蛋白结晶板中的池液孔中加入80μl池液1，然后用晶体枪分别吸取1μl蛋白质点到左边点样孔中，2μl蛋白质点到右边点样孔中，再用枪吸取1μl池液1分别滴在左右两个点样孔上，最后用胶布密封；置于20℃，3天后成功获得M-pro蛋白晶体。
5.根据权利要求4所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(3)是采用气相扩散法中的悬滴法进行混合物的结晶，在24孔蛋白结晶板中的池液孔加入500μl池液2，先用晶体枪吸取3μl池液2点到在盖玻片上，然后滴上浓度为2mM紫草素化合物0.3μl，得到含有池液2和紫草素的混合物，M-pro蛋白晶体放入含有池液2和紫草素的混合物中，将含有M-pro蛋白晶体和紫草素与池液2混合物的盖玻片反盖到边缘涂有真空脂的盛有500μl池液2的容器上，轻轻压紧，使液滴与容器内的池液2能够在同一个密闭的空间内，结晶温度为20℃，40h后成功获得复合物晶体。
6.根据权利要求5所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述池液1和池液2均是0.1M HEPES pH7.5，质量分数为20％PEG10000的混合物。
7.根据权利要求2所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述步骤(1)的M-pro蛋白的获得步骤包括：构建M-pro蛋白表达质粒；将M-pro蛋白表达质粒转化，诱导培养表达M-pro蛋白；纯化M-pro蛋白。
8.根据权利要求7所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述诱导培养表达M-pro蛋白的过程：取100μL培养菌液到100mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养过夜；将全部过夜菌液加到1000mL含有50μg/ml Kan+抗生素的LB液体培养基中，在37℃，200rpm的摇床上培养直至OD600为0.6-0.8之间。加入IPTG，使终浓度为0.67mmol，30℃，200rpm，诱导5小时。
9.根据权利要求7所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述纯化M-pro蛋白的过程是：过夜诱导后以6000rpm的转速离心15min，收集沉淀物即菌体，称3～4g，以缓冲液：菌重＝10mL:1g的比例重悬在缓冲液1中；高压破碎后以11000rpm的转速离心35min，取上清，弃掉沉淀；选用镍柱1～2ml进行蛋白纯化实验，镍柱使用前用20倍柱体积缓冲液2对柱子进行平衡；再将离心取得的上清液流过柱子，再依次用10倍柱体积含0mM、50mM、100mM、150mM、300mM的咪唑浓度的洗脱液进行洗脱，收集不同咪唑浓度的洗脱液；含150mM、300mM咪唑的洗脱液含有目的蛋白M-pro蛋白，然后将150mM和300mM咪唑浓度所得的洗脱液于缓冲液3中4℃过夜透析，再使用10kDa分子量截止浓缩器浓缩，直至浓度为10mg/mL以上。
10.根据权利要求9所述的新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体的制备方法，其特征在于：
所述缓冲液1含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，1mM DTT，10mM咪唑；
所述缓冲液2含有100mM Tris HCl pH7.5，300mM NaCl，10mM imidazole；
所述缓冲液3含有300mMNaCl，25mM HEPES，5mM DTT，质量分数为5％甘油。
CN202010688829.0A 2020-07-17 2020-07-17 新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶与紫草素复合物晶体及制备方法 Withdrawn CN111979213A (zh)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN113699212A (zh) * 2021-07-01 2021-11-26 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种筛选新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂的方法及筛选模型
CN115089564A (zh) * 2022-05-18 2022-09-23 南方科技大学 紫草素和左旋紫草素在制备抗冠状病毒药物中的应用

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