CN111373034A - 重组尿酸酶 - Google Patents

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Abstract

公开了具有提高的胰酶稳定性和/或活性的重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，含有这些尿酸酶的组合物，在其他方面以外，它们可用于治疗与尿酸量升高相关的疾病或障碍，包括例如高尿酸血症、高尿酸尿症和痛风。

Description

重组尿酸酶
与相关申请的交叉引用
本申请要求2017年7月7日提交的美国申请号62/529,726和2018年5月31日提交的美国申请号62/678,511的利益和优先权，每个所述申请的内容为所有目的整体通过引用并入本文。
发明领域
本发明总的来说涉及用于治疗与尿酸量升高相关的疾病或障碍的方法和组合物，并且更具体来说，本发明涉及重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，和使用这些尿酸酶以及含有这些尿酸酶的组合物治疗与尿酸量升高相关的疾病或障碍的方法。
背景技术
尿酸是人类和高等灵长动物中嘌呤代谢的最终氧化产物。尿酸酶或尿酸盐氧化酶是将尿酸降解成尿囊素和二氧化碳的酶。由于突变沉默，人类和高等灵长动物缺少有功能的尿酸酶基因。因此，与某些其他哺乳动物不同，由于肝脏尿酸酶的突变沉默，人类已失去通过所述酶代谢尿酸的能力。尽管人类产生大量尿酸，但大多数所述尿酸在尿液中排泄。然而，尿酸生产的增加和/或排泄的减少会导致血液中(高尿酸血症)和尿液中(高尿酸尿症)高水平的尿酸。由于尿酸盐在关节和皮肤组织中的沉积，高尿酸血症和高尿酸尿症会导致例如炎症性关节炎。
痛风是一种据估计影响8百万美国人的病症，并以关节炎症(关节炎)的反复发作为特征。所述关节炎症由尿酸晶体在关节液(滑膜液)和关节衬(滑膜衬)中的沉积造成。当白细胞吞噬尿酸晶体并释放出炎性化学物质时，引发强烈的关节炎症，引起关节组织的疼痛、发热和发红。慢性痛风可以额外导致肾功能下降和肾结石。
现有的痛风疗法例如口服黄嘌呤氧化酶抑制剂(例如别嘌呤醇)、排尿酸药和静脉内尿酸酶药剂的效能和/或耐受性的限制，造成了痛风中对降尿酸盐疗法(ULT)的不应性。例如，别嘌呤醇的延迟或不足施用造成难治性痛风。参见Fels和Sundy(2008)，CURR.OPIN.RHEUMATOL.,20(2):198-202。肾排泄是尿酸消除的主要途径，但胃肠道(GIT)在尿酸盐体内平衡中发挥日益受到认可的作用，特别是在尿酸盐肾消除受损的慢性肾病(CKD)中。
有功能的尿酸酶可以在广范围的生物体包括动物、植物、细菌和真菌中找到，因此，外源尿酸酶已被用于治疗与尿酸量升高相关的疾病或障碍。临床上批准的尿酸酶包括已被批准用于治疗慢性难治性痛风的
Figure BDA0002388985330000021
(pegloticase)和已被批准用于肿瘤溶解综合征的
Figure BDA0002388985330000024
(rasburicase)。
尽管迄今为止已经取得了进展，但对用于治疗和管理与尿酸量升高相关的疾病或障碍例如高尿酸血症和痛风的新的有效的疗法，以及用于治疗和管理此类疾病或障碍的改良的尿酸酶，仍存在着持续不断的需求。
发明内容
本发明部分是基于在人类中有活性并具有与天然存在的酶相比更高的稳定性和/或活性的重组尿酸酶的发现。具体来说，本发明的重组酶与所述酶的天然存在的版本相比，表现出对胰酶(由胰腺分泌的酶的集合体)的蛋白水解消化的提高的稳定性。此外，本发明的重组酶与野生型尿酸酶相比，可能具有更高的比活性。此外，设想了本文中描述的重组酶由于其增强的稳定性可能适合于口服施用，并且因此与可商购的注射形式的尿酸酶(例如
Figure BDA0002388985330000022
和
Figure BDA0002388985330000023
)相比可能更加安全并且更加可耐受，因为设想了所述酶将在肠内保留活性并且将不通过肠壁吸收。
一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)突变，其中所述至少一个突变选自：(a)在第180位，异亮氨酸被缬氨酸或丙氨酸替换(I180V或I180A)，(b)在第165位，酪氨酸被苯丙氨酸替换(Y165F)，(c)在第190位，缬氨酸被甘氨酸或丙氨酸替换(V190G或V190A)，(d)在第51位，谷氨酸被赖氨酸替换(E51K)，(e)在第244位，谷氨酰胺被赖氨酸替换(Q244K)，(f)在第132位，异亮氨酸被精氨酸或天冬酰胺替换(I132R或I132N)，(g)在第97位，缬氨酸被异亮氨酸替换(V97I)，(h)在第92位，谷氨酸被天冬酰胺替换(E92N)，(i)在第87位，丙氨酸被甘氨酸替换(A87G)，(j)在第142位，天冬氨酸被谷氨酸替换(D142E)，(k)在第44位，甘氨酸被丙氨酸替换(G44A)，(l)在第128位，甘氨酸被脯氨酸替换(G128P)，(m)在第236位，丙氨酸被天冬酰胺替换(A236N)，(n)在第208位，赖氨酸被丙氨酸替换(K208A)，(o)在第213位，天冬酰胺被丙氨酸替换(N213A)，(p)在第140位，丝氨酸被苏氨酸替换(S140T)，(q)在第253位，酪氨酸被谷氨酰胺替换(Y253Q)，(r)在第84位，丙氨酸被丝氨酸替换(A84S)，(s)在第47位，苏氨酸被谷氨酸替换(T47E)，(t)在第95位，丝氨酸被脯氨酸替换(S95P)，(u)在第103位，赖氨酸被苏氨酸替换(K103T)，(v)在第134位，天冬氨酸被谷氨酸替换(D134E)，(w)在第136位，酪氨酸被精氨酸替换(Y136R)，(x)在第196位，异亮氨酸被亮氨酸替换(I196L)，(y)在第224位，苏氨酸被天冬氨酸替换(T224D)，(z)在第285位，脯氨酸被丝氨酸替换(P285S)，和(aa)在第296位，缬氨酸被丙氨酸替换(V296A)。
在某些实施方式中，所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，V190A，E51K，Q244K，I132R，V97I，E92N，A87G，D142E，G44A，G128P，A236N，K208A，N213A，S140T，Y253Q和A84S。在某些其他实施方式中，所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，Q244K，I132R，V97I，E92N，A87G，D142E和G44A。在某些其他实施方式中，所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，I132R和G44A。在某些其他实施方式中，所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，E51K，I132R和G44A。在某些其他实施方式中，所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，Q244K和I132R。
另一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其在对应于SEQ IDNO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5或6个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第190位、第51位、第132位和第44位的位置处。在某些实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是保守替换，而在某些其他实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是非保守替换。
另一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其在对应于SEQ IDNO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4或5个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第51位、第132位和第44位的位置处。在某些实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是保守替换，而在某些其他实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是非保守替换。
另一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其在对应于SEQ IDNO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4或5个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第190位、第51位、第244位和第132位的位置处。在某些实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是保守替换，而在某些其他实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是非保守替换，
在某些实施方式中，在任何前述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶中，尿酸酶包含2、3、4、5、6、7或8个突变。
在某些实施方式中，在任何前述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶中，所述尿酸酶单独地或与其他替换相组合包含下述替换：(i)I180V、Y165F、E51K、I132R和G44A，(ii)I180A、Y165F、E51K、I132R和G44A，(iii)I180V、Y165F、V190G、E51K、I132R和G44A，(iv)I180A、Y165F、V190G、E51K、I132R和G44A，(v)I180V和Y165F，或(vi)I180V、Y165F、V190G、E51K、Q244K和I132R。
在某些实施方式中，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含在下文表1的给定行中列出的3个替换。在某些实施方式中，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含在下文表2的给定行中列出的5个替换。
另一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其在胰酶存在下具有至少35分钟的半衰期，例如在胰酶存在下如在实施例1中阐述的条件下具有35-200分钟的半衰期。
设想了任何上述重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶与野生型尿酸酶相比，在胰酶存在下可以例如具有高5-50倍、10-40倍、10-30倍、20-40倍或20-30倍的稳定性。所述尿酸酶与模板(或参比)野生型尿酸酶相比可能例如在低于约6.5的pH下更稳定。
设想了任何上述重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶可以例如被偶联到水溶性聚合物，例如聚乙二醇(PEG)。
在某些实施方式中，在任何前述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶中，所述尿酸酶被分离。
另一方面，本发明提供了一种分离的核酸，其包含编码任一上述尿酸酶的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述核苷酸序列被密码子优化，以用于在宿主细胞例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)细胞中表达。本发明还提供了一种表达载体，其包含任一上述核苷酸序列。同样地，本发明提供了宿主细胞例如大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)细胞，其包含一种或多种上述表达载体。
另一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含任一上述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶和至少一种可药用载体和/或赋形剂。所述酶可以采取可溶形式或晶体形式。此外，所述组合物可以包含提高pH的试剂。设想了所述药物组合物可以例如被配制成口服剂型或肠胃外剂型。在某些实施方式中，所述组合物被配制成粉剂、颗粒剂、球丸、微球丸或小片剂。在某些实施方式中，所述组合物被包封在胶囊例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊、软明胶胶囊或硬明胶胶囊中，或者所述组合物被配制成片剂剂型。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中治疗与尿酸量升高相关的疾病或障碍的方法。在某些实施方式中，所述疾病或障碍与所述受试者的血浆或尿液中的尿酸量升高相关。所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文中描述的任何尿酸酶或组合物，以在所述受试者中治疗所述疾病或障碍。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中治疗高尿酸血症和/或高尿酸尿症的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文中描述的任何尿酸酶或组合物，以在所述受试者中治疗所述高尿酸血症和/或高尿酸尿症。
另一方面，本发明提供了一种在需要的受试者中治疗痛风的方法。所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文中描述的任何尿酸酶或组合物，以在所述受试者中治疗所述痛风。
在某些实施方式中，在任何上述方法中，所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶与黄嘌呤氧化酶抑制剂(例如别嘌呤醇或非布索坦)、排尿酸药(例如丙磺舒、苯溴马隆、氯沙坦或雷西奈德)或其组合相联合施用。
本发明的这些和其他方面和特点在下面的详细描述和权利要求书中描述。
附图说明
参考下述附图，可以更完全地理解本发明。
图1A是描绘了胰酶、野生型产朊假丝酵母尿酸酶(His-UO)和与胰酶温育90分钟后的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的SDS-PAGE凝胶。图1B是描绘了将野生型产朊假丝酵母尿酸酶与胰酶温育指定的时间点后，通过底物尿酸浓度的丧失所测量的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的活性的线图。尿酸浓度通过298nm处的吸收值来测量。
图2A是描绘了所指示的突变产朊假丝酵母尿酸酶在胰酶存在下的活性的线图。对每种尿酸酶描绘了来自于两个独立制备物的数据。活性值归一化到在胰酶存在下零时的活性。图2B是展示了在图2A中描绘的数据的每个制备物间的可重复性的线图。
图3是描绘了R2_V79、R2_15、R2_V16和R2_Parent突变产朊假丝酵母尿酸酶在与胰酶温育所指示的时间点后的活性的线图。活性值归一化到在胰酶存在下零时的活性。
图4示出了通过差示扫描荧光测定法(DSF)为野生型产朊假丝酵母尿酸酶和所指示的突变产朊假丝酵母尿酸酶所确定的蛋白质去折叠。
图5是示出了在与胰酶温育所指示的时间点后的R2_V17、R2_V4和R2_V79突变产朊假丝酵母尿酸酶的SDS-PAGE凝胶。
图6是示出了在与胰酶温育所指示的时间点后的野生型产朊假丝酵母尿酸酶和R2_V17突变产朊假丝酵母尿酸酶的SDS-PAGE凝胶。
图7是示出了所指示的突变产朊假丝酵母尿酸酶相对于野生型的胰酶稳定性的条形图。描绘了实施例1中描述的各自含有5个替换的R2突变产朊假丝酵母尿酸酶(右侧)和实施例2中描述的各自含有单个替换的突变产朊假丝酵母尿酸酶(左侧和中间)。
图8是示出了实施例2中描述的各自含有单个替换的突变产朊假丝酵母尿酸酶相对于野生型的胰酶稳定性的瀑布图。酶相对于它们对稳定性的作用进行排序。
图9A是示出了具有严重高尿酸血症的尿酸酶敲除(UrOxKO)小鼠中的血浆尿酸盐水平(mg/dL)的条形图。示出了治疗前(在除去维持剂量的别嘌呤醇后第7天收集的样品中测量血浆尿酸盐水平)、治疗(在分别施用50mg/L的别嘌呤醇、150mg/L的别嘌呤醇或150mg/天的突变产朊假丝酵母尿酸酶后第7天收集的样品中测量血浆尿酸盐水平)和治疗后(在治疗结束后第7天收集的样品中测量血浆尿酸盐水平)的血浆尿酸盐水平的平均值(SEM)。
图9B是示出了具有高尿酸尿症的UrOxKO小鼠中的尿液尿酸水平(mg/dL)的条形图。在治疗前的最后3天和所指示的治疗期中收集的24小时尿液样品中测量尿酸水平。
详细描述
本发明部分是基于在人类中有活性并具有与天然存在的酶相比更高的稳定性和/或活性的重组尿酸酶的发现。具体来说，本发明的重组酶与所述酶的天然存在的版本相比，表现出对胰酶(由胰腺分泌的酶的集合体)的蛋白水解消化的提高的稳定性。此外，本发明的重组酶与野生型尿酸酶相比，可能具有更高的比活性。此外，设想了本文中描述的重组酶由于其增强的稳定性可能适合于口服施用，并且因此与可商购的注射形式的尿酸酶(例如
Figure BDA0002388985330000081
和
Figure BDA0002388985330000082
)相比可能更加安全并且更加可耐受，因为设想了由于所述重组酶的尺寸排除了被动吸收并且尚未从肠鉴定到用于所述酶的主动运输的受体，因此所述酶将在肠内保留活性并且将不通过肠壁吸收。
本发明的各个不同特点和方面将在下文更详细讨论。
I.尿酸和尿酸酶
尿酸(也被称为尿酸盐)是人类和高等灵长动物中嘌呤代谢的最终产物。尿酸酶(也被称为尿酸盐氧化酶或UrOx)通过催化下述反应将尿酸降解成尿囊素：
尿酸+O2+H2O→5-羟基异尿酸+H2O2→尿囊素+CO2。
由于突变沉默，人类和高等灵长动物缺少有功能的尿酸酶基因。然而，有功能的尿酸酶可以在广泛的生物体包括动物、植物、细菌和真菌中找到。一种这样的生物体是酵母产朊假丝酵母(Candida utlilus)(也被称为Cyberlindnera jadinii或圆酵母)。产朊假丝酵母尿酸酶是一种同四聚体酶，其催化不需金属原子或有机辅因子。野生型产朊假丝酵母尿酸酶的氨基酸序列如下：
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGYNKCDFTTLQPTTDRILSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(SEQ ID NO：1)。
编码所述野生型产朊假丝酵母尿酸酶的示例性核苷酸序列如下：
ATGTCGACGACCCTGAGCAGCAGCACCTATGGCAAAGATAATGTGAAATTTCTGAAAGTCAAAAAAGACCCGCAGAACCCTAAGAAACAAGAGGTCATGGAAGCGACCGTTACGTGTCTGCTGGAAGGCGGCTTCGACACCAGCTATACCGAAGCGGATAATTCCTCCATCGTTCCGACCGATACGGTCAAGAACACCATTCTGGTTCTGGCCAAGACCACGGAAATCTGGCCAATTGAGCGCTTCGCCGCGAAACTGGCGACCCATTTCGTTGAGAAGTACAGCCACGTGAGCGGCGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTCAAATATGCCGTGGATGGTAAGCCGCATGACCACAGCTTTATTCACGAGGGTGGCGAGAAGCGTATCACTGACCTGTATTACAAGCGCAGCGGTGACTACAAATTGAGCAGCGCAATCAAAGACCTGACGGTCCTGAAAAGCACCGGTTCTATGTTTTACGGTTACAATAAGTGCGACTTTACGACGCTCCAACCGACTACGGACCGTATCCTGTCTACCGATGTAGACGCGACCTGGGTCTGGGATAACAAGAAAATTGGCAGCGTGTACGATATTGCGAAAGCCGCTGACAAGGGTATCTTCGACAACGTCTATAATCAAGCGCGTGAGATCACCCTGACCACGTTTGCTCTGGAGAATTCCCCGAGCGTTCAGGCGACCATGTTTAACATGGCAACGCAGATTTTGGAAAAGGCATGTAGCGTGTACAGCGTGAGCTATGCATTGCCGAATAAGCACTACTTCCTGATTGATCTGAAGTGGAAGGGTCTGGAGAACGATAACGAACTGTTCTATCCGAGCCCGCACCCGAATGGTCTGATCAAGTGCACCGTTGTGCGTAAAGAAAAGACTAAACTG(SEQ ID NO：7).
II.重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶
除了其他方面之外，本发明提供了一类重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其例如可用于在受试者中治疗与尿酸水平升高相关的障碍，例如与所述受试者的血浆中尿酸水平升高相关的障碍。在某些实施方式中，本文中描述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶具有与野生型产朊假丝酵母尿酸酶相比更高的稳定性，例如在胰酶存在下与野生型产朊假丝酵母尿酸酶相比更高的稳定性，并且因此与野生型产朊假丝酵母尿酸酶相比更好地适合于口服递送和在肠中的活性。当在本文中使用时，除非另有陈述，否则野生型产朊假丝酵母尿酸酶是指具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列的产朊假丝酵母尿酸酶或其能够催化尿酸氧化成5-羟基异尿酸的功能性片段。当在本文中使用时，术语“功能性片段”被理解为SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的蛋白质片段，其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的活性，催化尿酸向5-羟基异尿酸和/或尿囊素的转化。
一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)突变，其中所述至少一个突变选自：(a)在第180位，异亮氨酸被缬氨酸或丙氨酸替换(I180V或I180A)，(b)在第165位，酪氨酸被苯丙氨酸替换(Y165F)，(c)在第190位，缬氨酸被甘氨酸或丙氨酸替换(V190G或V190A)，(d)在第51位，谷氨酸被赖氨酸替换(E51K)，(e)在第244位，谷氨酰胺被赖氨酸替换(Q244K)，(f)在第132位，异亮氨酸被精氨酸或天冬酰胺替换(I132R或I132N)，(g)在第97位，缬氨酸被异亮氨酸替换(V97I)，(h)在第92位，谷氨酸被天冬酰胺替换(E92N)，(i)在第87位，丙氨酸被甘氨酸替换(A87G)，(j)在第142位，天冬氨酸被谷氨酸替换(D142E)，(k)在第44位，甘氨酸被丙氨酸替换(G44A)，(l)在第128位，甘氨酸被脯氨酸替换(G128P)，(m)在第236位，丙氨酸被天冬酰胺替换(A236N)，(n)在第208位，赖氨酸被丙氨酸替换(K208A)，(o)在第213位，天冬酰胺被丙氨酸替换(N213A)，(p)在第140位，丝氨酸被苏氨酸替换(S140T)，(q)在第253位，酪氨酸被谷氨酰胺替换(Y253Q)，(r)在第84位，丙氨酸被丝氨酸替换(A84S)，(s)在第47位，苏氨酸被谷氨酸替换(T47E)，(t)在第95位，丝氨酸被脯氨酸替换(S95P)，(u)在第103位，赖氨酸被苏氨酸替换(K103T)，(v)在第134位，天冬氨酸被谷氨酸替换(D134E)，(w)在第136位，酪氨酸被精氨酸替换(Y136R)，(x)在第196位，异亮氨酸被亮氨酸替换(I196L)，(y)在第224位，苏氨酸被天冬氨酸替换(T224D)，(z)在第285位，脯氨酸被丝氨酸替换(P285S)，和(aa)在第296位，缬氨酸被丙氨酸替换(V296A)。
在某些实施方式中，所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，V190A，E51K，Q244K，I132R，V97I，E92N，A87G，D142E，G44A，G128P，A236N，K208A，N213A，S140T，Y253Q和A84S。在某些其他实施方式中，所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，Q244K，I132R，V97I，E92N，A87G，D142E和G44A。在某些其他实施方式中，所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，I132R和G44A。在某些其他实施方式中，所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，E51K，I132R和G44A。在某些其他实施方式中，所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，Q244K和I132R。
另一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其在对应于SEQ IDNO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5或6个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第190位、第51位、第132位和第44位的位置处。在某些实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是保守替换，而在某些其他实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是非保守替换。
另一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其在对应于SEQ IDNO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4或5个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第51位、第132位和第44位的位置处。在某些实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是保守替换，而在某些其他实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是非保守替换。当在本文中使用时，术语“保守替换”是指使用结构相似的氨基酸的替换。例如，保守替换可以包括在下述组内的替换：Ser和Cys；Leu、Ile和Val；Glu和Asp；Lys和Arg；Phe、Tyr和Trp；以及Gln、Asn、Glu、Asp和His。保守替换也可以由BLAST(基本局部比对搜索工具)算法、BLOSUM替换矩阵(例如BLOSUM 62矩阵)或PAM替换:p矩阵(例如PAM 250矩阵)来定义。非保守替换是不是保守替换的氨基酸替换。
另一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其在对应于SEQ IDNO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5或6个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第190位、第51位、第244位和第132位的位置处。在某些实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是保守替换，而在某些其他实施方式中，相对于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶，一个或多个突变可以是非保守替换。
在某些实施方式中，在任何前述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶中，所述尿酸酶包含2、3、4、5、6、7或8个突变。
在某些实施方式中，在任何前述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶中，所述尿酸酶单独地或与其他替换相组合包含下述替换：(i)I180V、Y165F、E51K、I132R和G44A，(ii)I180A、Y165F、E51K、I132R和G44A，(iii)I180V、Y165F、V190G、E51K、I132R和G44A，(iv)I180A、Y165F、V190G、E51K、I132R和G44A，(v)I180V和Y165F，或(vi)I180V、Y165F、V190G、E51K、Q244K和I132R。
一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含在表1的给定行中列出的3个替换。
表1
1 K130T I180V V190A
2 E51K H125K Q217L
3 Y165F D201E A242C
4 A83G V97I D201E
5 T38C G128P S251L
6 H125K G128P I196L
7 I180V V214A A242C
8 K130T F170Y A236N
9 Y165F I180V G197A
10 Y165F Q217L T243Q
11 A83G H119S Y165F
12 E51K Y137A Y165F
13 E92N S95A K130T
14 E92D I180V F281Y
15 G44A V97I S256N
16 S95A V185I Q217L
另一方面，本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含在表2的给定行中列出的5个替换。
表2
Figure BDA0002388985330000141
Figure BDA0002388985330000151
Figure BDA0002388985330000161
本文公开的重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶可以例如具有比SEQID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶更高的比活性。例如，重组突变产朊假丝酵母尿酸酶可以具有比所述野生型产朊假丝酵母尿酸酶高5至50倍的比活性。在某些实施方式中，所述尿酸酶具有比野生型产朊假丝酵母尿酸酶高约5至约50、约5至约40、约5至约30、约5至约20、约5至约10、约10至约50、约10至约40、约10至约30、约10至约20、约20至约50、约20至约40、约20至约30、约30至约50、约30至约40、约40至约50、约5、约10、约20、约30、约40或约50倍的比活性。
可选地或此外，本文公开的重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶可以例如具有比所述野生型产朊假丝酵母尿酸酶更高的稳定性，例如在胰酶存在下更高的稳定性。例如，在胰酶存在下，重组突变产朊假丝酵母尿酸酶可以具有比所述野生型产朊假丝酵母尿酸酶高5至50倍的稳定性。在某些实施方式中，在胰酶存在下，所述尿酸酶具有比所述野生型产朊假丝酵母尿酸酶高约5至约50、约5至约40、约5至约30、约5至约20、约5至约10、约10至约50、约10至约40、约10至约30、约10至约20、约20至约50、约20至约40、约20至约30、约30至约50、约30至约40、约40至约50、约5、约10、约20、约30、约40或约50倍的稳定性。
可选地或此外，所述重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶可以例如在胰酶存在下具有至少35分钟的半衰期。在某些实施方式中，所述尿酸酶在胰酶存在下具有至少约35至约200分钟、约35至约175分钟、约35至约150分钟、约35至约125分钟、约35至约100分钟、约35至约75分钟、约35至约50分钟、约50至约200分钟、约50至约175分钟、约50至约150分钟、约50至约125分钟、约50至约100分钟、约50至约75分钟、约75至约200分钟、约75至约175分钟、约75至约150分钟、约75至约125分钟、约75至约100分钟、约100至约200分钟、约100至约175分钟、约100至约150分钟、约100至约125分钟、约125至约200分钟、约125至约175分钟、约125至约150分钟、约150至约200分钟、约150至约175分钟、约175至约200分钟、约35分钟、约50分钟、约75分钟、约100分钟、约125分钟、约150分钟、约175分钟或约200分钟的半衰期。尿酸酶稳定性或半衰期可以通过本领域中已知的任何方法来测量，包括基于吸收的测定法或实施例1中所描述的SDS-PAGE。尿酸酶在胰酶存在下的半衰期取决于测量所述半衰期的实验条件，包括例如胰酶的浓度。在某些实施方式中，所公开的重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶在胰酶存在下的半衰期，在20ng/μL或80ng/μL的胰酶例如可以从Sigma-Aldrich获得的胰酶(目录号P7545)存在下测量。
可选地或此外，设想了本文公开的重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶与所述野生型产朊假丝酵母尿酸酶相比可以例如在低于约6.5的pH下具有更高的稳定性。例如，与所述野生型产朊假丝酵母尿酸酶相比，重组突变产朊假丝酵母尿酸酶在胰酶存在下可以具有高5至50倍的稳定性。在某些实施方式中，所述尿酸酶与野生型产朊假丝酵母尿酸酶相比在低于约6.5的pH下具有高约5至约50、约5至约40、约5至约30、约5至约20、约5至约10、约10至约50、约10至约40、约10至约30、约10至约20、约20至约50、约20至约40、约20至约30、约30至约50、约30至约40、约40至约50、约5、约10、约20、约30、约40或约50倍的稳定性。尿酸酶稳定性或半衰期可以通过本领域中已知的任何方法来测量，包括基于吸收的测定法或实施例1中所描述的SDS-PAGE。
本发明还提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含下述替换：Y165F，I180V，G44A，E51K和I132R，例如包含下述氨基酸序列的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，例如在本文中被称为R2_V17的重组突变尿酸酶：
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGAFDTSYTKADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRRTDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGFNKCDFTTLQPTTDRVLSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(SEQ ID NO：2)。
本发明还提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含下述替换：Y165F，I180V，E51K，V97I和A236N，例如包含下述氨基酸序列的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，例如在本文中被称为R2_V4的重组突变尿酸酶：
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTKADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHISGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGFNKCDFTTLQPTTDRVLSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQNTMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(SEQ ID NO：3)。
本发明还提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含下述替换：Y165F，I180V，I132R，Q217L和P285S，例如包含下述氨基酸序列的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，例如在本文中被称为R2_V79的重组突变尿酸酶：
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTEADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRRTDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGFNKCDFTTLQPTTDRVLSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNLAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSSHPNGLIKCTVVRKEKTKL(SEQ ID NO：4)。
本发明还提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含下述替换：Y165F，I180V，E51K，V97I和I196L，例如包含下述氨基酸序列的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，例如在本文中被称为R2_V47的重组突变尿酸酶：
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTKADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHISGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGDYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGFNKCDFTTLQPTTDRVLSTDVDATWVWDNKKLGSVYDIAKAADKGIFDNVYNQAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(SEQ ID NO：5)。
本发明提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含下述替换：Y165F，I180V，E51K，D142E和Q217L，例如包含下述氨基酸序列的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，例如在本文中被称为R2_V39的重组突变尿酸酶：
MSTTLSSSTYGKDNVKFLKVKKDPQNPKKQEVMEATVTCLLEGGFDTSYTKADNSSIVPTDTVKNTILVLAKTTEIWPIERFAAKLATHFVEKYSHVSGVSVKIVQDRWVKYAVDGKPHDHSFIHEGGEKRITDLYYKRSGEYKLSSAIKDLTVLKSTGSMFYGFNKCDFTTLQPTTDRVLSTDVDATWVWDNKKIGSVYDIAKAADKGIFDNVYNLAREITLTTFALENSPSVQATMFNMATQILEKACSVYSVSYALPNKHYFLIDLKWKGLENDNELFYPSPHPNGLIKCTVVRKEKTKL(SEQ ID NO：6)。
本发明还提供了一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其与本文中公开的产朊假丝酵母尿酸酶具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性，并具有野生型产朊假丝酵母尿酸酶的至少60％的比活性和/或高5倍的稳定性。序列一致性可以以本领域技术范围之内的各种不同方式来确定，例如使用可公开获得的计算机软件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。BLAST(基本局部比对搜索工具)分析使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx采用的算法(Karlin等，(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87:2264-2268；Altschul，(1993)J.MOL.EVOL.36,290-300；Altschul等，(1997)NUCLEIC ACIDS RES.25:3389-3402，通过参考并入)被定制用于序列相似性搜索。对于搜索序列数据库中的基本问题的讨论，参见Altschul等，(1994)NATUREGENETICS 6:119-129，其全部通过参考并入。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适合参数，包括在相比较的序列的全长内实现最大对齐所需的任何算法。用于直方图、描述、比对、期望值(即用于报告与数据库序列的匹配的统计显著性阈值)、截止值、矩阵和筛选程序的搜索参数处于缺省设置。被blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的缺省评分矩阵是BLOSUM62矩阵(Henikoff等，(1992)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 89:10915-10919，完全通过参考并入)。四个blastn参数可以如下调整：Q＝10(间隙生成罚分)；R＝10(间隙延长罚分)；wink＝1(在沿着查询序列的每个第wink位置处产生字命中)；和gapw＝16(设置在其中产生带间隙的比对的窗口宽度)。等同的Blastp参数设置可以是Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。搜索也可以使用NCBI(美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information))BLAST高级选项参数来进行(例如：-G，开放间隙的代价[整数]：缺省值＝对于核苷酸来说5/对于蛋白质来说11；-E，延长间隙的代价[整数]：缺省值＝对于核苷酸来说2/对于蛋白质来说1；-q，核苷酸错配的罚分[整数]：缺省值＝-3；-r，核苷酸匹配的奖励[整数]：缺省值＝1；-e，预期值[实数]：缺省值＝10；-W，字大小[整数]：缺省值＝对于核苷酸来说11/对于megablast来说28/对于蛋白质来说3；-y，以比特为单位的用于blast延伸的Dropoff(X)：缺省值＝对于blastn来说20/对于其他来说7；-X，用于带间隙比对的X dropoff值(以比特为单位)：缺省值＝对于所有程序来说15，不适用于blastn；和–Z，用于带间隙比对的最终X dropoff值(以比特为单位)：对于blastn来说50，对于其他来说25)。也可以使用用于成对蛋白质比对的ClustalW(缺省参数可以包括例如Blosum62矩阵，间隙开放罚分＝10和间隙延长罚分＝0.1)。可以在GCG软件包第10.0版中获得的Bestfit序列间比较，使用DNA参数GAP＝50(间隙生成罚分)和LEN＝3(间隙延长罚分)，并且在蛋白质比较中的等同设置是GAP＝8和LEN＝2。
设想了公开的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶可以被修饰、工程化改造或化学偶联。例如，设想了公开的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶可以使用标准的体外偶联化学偶联到效应剂。如果所述效应剂是多肽，则所述尿酸酶可以化学偶联到所述效应剂或作为融合蛋白联接到所述效应剂。融合蛋白的构建在本领域的普通技术范围之内。
在某些实施方式中，取决于具体的施用方式或活性位点，公开的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶可以用提高它在循环中例如在血液、血清或其他组织中的稳定性和/或保留的基团来修饰。例如，可以将公开的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶偶联到聚合物如基本上无抗原性的聚合物，例如聚亚烷基氧化物或聚氧化乙烯。在某些实施方式中，将公开的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶偶联到水溶性聚合物如亲水性聚乙烯基聚合物，例如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。这些聚合物的实例包括聚亚烷基氧化物均聚物例如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化的多元醇、其共聚物及其嵌段共聚物。其他有用的聚合物包括聚氧化烯例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯和聚氧化乙烯与聚氧化丙烯的嵌段共聚物、聚甲基丙烯酸酯、卡波姆以及支链或非支链多糖。
III.尿酸酶生产
用于生产本发明的尿酸酶的方法在本领域中是已知的。例如，可以使用本文中提供的序列信息化学合成编码尿酸酶的DNA分子。可以将合成的DNA分子连接到其他适合的核苷酸序列包括例如表达控制序列，以产生编码所需尿酸酶的常规基因表达构建物。
编码所需尿酸酶的核酸可以并入(连接)到表达载体中，所述表达载体可以通过常规的转染或转化技术引入到宿主细胞中。转化的宿主细胞可以在允许所述宿主细胞表达编码所述尿酸酶的基因的条件下生长。
编码本发明的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的核酸可以通过使用本领域中已知的方法突变编码野生型产朊假丝酵母尿酸酶的核苷酸序列例如本文中公开的SEQ ID NO：7来产生。此外，在某些实施方式中，编码本发明的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的核酸可以使用本领域中已知的方法进行密码子优化，用于在异源细胞例如大肠杆菌细胞中表达。
在一个实施方式中，编码包含Y165F、I180V、G44A、E51K和I132R替换的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶例如在本文中被称为R2_V17的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的示例性核苷酸序列如下：ATGTCGACGACCCTGAGCAGCAGCACCTATGGCAAAGATAATGTGAAATTTCTGAAAGTCAAAAAAGACCCGCAGAACCCTAAGAAACAAGAGGTCATGGAAGCGACCGTTACGTGTCTGCTGGAAGGCGCGTTCGACACCAGCTATACCAAAGCGGATAATTCCTCCATCGTTCCGACCGATACGGTCAAGAACACCATTCTGGTTCTGGCCAAGACCACGGAAATCTGGCCAATTGAGCGCTTCGCCGCGAAACTGGCGACCCATTTCGTTGAGAAGTACAGCCACGTGAGCGGCGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTCAAATATGCCGTGGATGGTAAGCCGCATGACCACAGCTTTATTCACGAGGGTGGCGAGAAGCGTCGTACTGACCTGTATTACAAGCGCAGCGGTGACTACAAATTGAGCAGCGCAATCAAAGACCTGACGGTCCTGAAAAGCACCGGTTCTATGTTTTACGGTTTCAATAAGTGCGACTTTACGACGCTCCAACCGACTACGGACCGTGTTCTGTCTACCGATGTAGACGCGACCTGGGTCTGGGATAACAAGAAAATTGGCAGCGTGTACGATATTGCGAAAGCCGCTGACAAGGGTATCTTCGACAACGTCTATAATCAAGCGCGTGAGATCACCCTGACCACGTTTGCTCTGGAGAATTCCCCGAGCGTTCAGGCGACCATGTTTAACATGGCAACGCAGATTTTGGAAAAGGCATGTAGCGTGTACAGCGTGAGCTATGCATTGCCGAATAAGCACTACTTCCTGATTGATCTGAAGTGGAAGGGTCTGGAGAACGATAACGAACTGTTCTATCCGAGCCCGCACCCGAATGGTCTGATCAAGTGCACCGTTGTGCGTAAAGAAAAGACTAAACTG(SEQ ID NO：8)。
编码包含Y165F、I180V、E51K、V97I和A236N替换的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶例如在本文中被称为R2_V4的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的示例性核苷酸序列如下：
ATGTCGACGACCCTGAGCAGCAGCACCTATGGCAAAGATAATGTGAAATTTCTGAAAGTCAAAAAAGACCCGCAGAACCCTAAGAAACAAGAGGTCATGGAAGCGACCGTTACGTGTCTGCTGGAAGGCGGCTTCGACACCAGCTATACCAAAGCGGATAATTCCTCCATCGTTCCGACCGATACGGTCAAGAACACCATTCTGGTTCTGGCCAAGACCACGGAAATCTGGCCAATTGAGCGCTTCGCCGCGAAACTGGCGACCCATTTCGTTGAGAAGTACAGCCACATCAGCGGCGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTCAAATATGCCGTGGATGGTAAGCCGCATGACCACAGCTTTATTCACGAGGGTGGCGAGAAGCGTATCACTGACCTGTATTACAAGCGCAGCGGTGACTACAAATTGAGCAGCGCAATCAAAGACCTGACGGTCCTGAAAAGCACCGGTTCTATGTTTTACGGTTTCAATAAGTGCGACTTTACGACGCTCCAACCGACTACGGACCGTGTTCTGTCTACCGATGTAGACGCGACCTGGGTCTGGGATAACAAGAAAATTGGCAGCGTGTACGATATTGCGAAAGCCGCTGACAAGGGTATCTTCGACAACGTCTATAATCAAGCGCGTGAGATCACCCTGACCACGTTTGCTCTGGAGAATTCCCCGAGCGTTCAGAACACCATGTTTAACATGGCAACGCAGATTTTGGAAAAGGCATGTAGCGTGTACAGCGTGAGCTATGCATTGCCGAATAAGCACTACTTCCTGATTGATCTGAAGTGGAAGGGTCTGGAGAACGATAACGAACTGTTCTATCCGAGCCCGCACCCGAATGGTCTGATCAAGTGCACCGTTGTGCGTAAAGAAAAGACTAAACTG(SEQ ID NO：9)。
编码包含Y165F、I180V、I132R、Q217L和P285S替换的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶例如在本文中被称为R2_V79的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的示例性核苷酸序列如下：
ATGTCGACGACCCTGAGCAGCAGCACCTATGGCAAAGATAATGTGAAATTTCTGAAAGTCAAAAAAGACCCGCAGAACCCTAAGAAACAAGAGGTCATGGAAGCGACCGTTACGTGTCTGCTGGAAGGCGGCTTCGACACCAGCTATACCGAAGCGGATAATTCCTCCATCGTTCCGACCGATACGGTCAAGAACACCATTCTGGTTCTGGCCAAGACCACGGAAATCTGGCCAATTGAGCGCTTCGCCGCGAAACTGGCGACCCATTTCGTTGAGAAGTACAGCCACGTGAGCGGCGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTCAAATATGCCGTGGATGGTAAGCCGCATGACCACAGCTTTATTCACGAGGGTGGCGAGAAGCGTCGTACTGACCTGTATTACAAGCGCAGCGGTGACTACAAATTGAGCAGCGCAATCAAAGACCTGACGGTCCTGAAAAGCACCGGTTCTATGTTTTACGGTTTCAATAAGTGCGACTTTACGACGCTCCAACCGACTACGGACCGTGTTCTGTCTACCGATGTAGACGCGACCTGGGTCTGGGATAACAAGAAAATTGGCAGCGTGTACGATATTGCGAAAGCCGCTGACAAGGGTATCTTCGACAACGTCTATAATCTGGCGCGTGAGATCACCCTGACCACGTTTGCTCTGGAGAATTCCCCGAGCGTTCAGGCGACCATGTTTAACATGGCAACGCAGATTTTGGAAAAGGCATGTAGCGTGTACAGCGTGAGCTATGCATTGCCGAATAAGCACTACTTCCTGATTGATCTGAAGTGGAAGGGTCTGGAGAACGATAACGAACTGTTCTATCCGAGCAGCCACCCGAATGGTCTGATCAAGTGCACCGTTGTGCGTAAAGAAAAGACTAAACTG(SEQ ID NO：10)。
编码包含Y165F、I180V、E51K、V97I和I196L替换的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶例如在本文中被称为R2_V47的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的示例性核苷酸序列如下：
ATGTCGACGACCCTGAGCAGCAGCACCTATGGCAAAGATAATGTGAAATTTCTGAAAGTCAAAAAAGACCCGCAGAACCCTAAGAAACAAGAGGTCATGGAAGCGACCGTTACGTGTCTGCTGGAAGGCGGCTTCGACACCAGCTATACCAAAGCGGATAATTCCTCCATCGTTCCGACCGATACGGTCAAGAACACCATTCTGGTTCTGGCCAAGACCACGGAAATCTGGCCAATTGAGCGCTTCGCCGCGAAACTGGCGACCCATTTCGTTGAGAAGTACAGCCACATCAGCGGCGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTCAAATATGCCGTGGATGGTAAGCCGCATGACCACAGCTTTATTCACGAGGGTGGCGAGAAGCGTATCACTGACCTGTATTACAAGCGCAGCGGTGACTACAAATTGAGCAGCGCAATCAAAGACCTGACGGTCCTGAAAAGCACCGGTTCTATGTTTTACGGTTTCAATAAGTGCGACTTTACGACGCTCCAACCGACTACGGACCGTGTTCTGTCTACCGATGTAGACGCGACCTGGGTCTGGGATAACAAGAAACTGGGCAGCGTGTACGATATTGCGAAAGCCGCTGACAAGGGTATCTTCGACAACGTCTATAATCAAGCGCGTGAGATCACCCTGACCACGTTTGCTCTGGAGAATTCCCCGAGCGTTCAGGCGACCATGTTTAACATGGCAACGCAGATTTTGGAAAAGGCATGTAGCGTGTACAGCGTGAGCTATGCATTGCCGAATAAGCACTACTTCCTGATTGATCTGAAGTGGAAGGGTCTGGAGAACGATAACGAACTGTTCTATCCGAGCCCGCACCCGAATGGTCTGATCAAGTGCACCGTTGTGCGTAAAGAAAAGACTAAACTG(SEQ ID NO：11)。
编码包含Y165F、I180V、E51K、D142E和Q217L替换的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶例如在本文中被称为R2_V39的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的示例性核苷酸序列如下：
ATGTCGACGACCCTGAGCAGCAGCACCTATGGCAAAGATAATGTGAAATTTCTGAAAGTCAAAAAAGACCCGCAGAACCCTAAGAAACAAGAGGTCATGGAAGCGACCGTTACGTGTCTGCTGGAAGGCGGCTTCGACACCAGCTATACCAAAGCGGATAATTCCTCCATCGTTCCGACCGATACGGTCAAGAACACCATTCTGGTTCTGGCCAAGACCACGGAAATCTGGCCAATTGAGCGCTTCGCCGCGAAACTGGCGACCCATTTCGTTGAGAAGTACAGCCACGTGAGCGGCGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTCAAATATGCCGTGGATGGTAAGCCGCATGACCACAGCTTTATTCACGAGGGTGGCGAGAAGCGTATCACTGACCTGTATTACAAGCGCAGCGGTGAGTACAAATTGAGCAGCGCAATCAAAGACCTGACGGTCCTGAAAAGCACCGGTTCTATGTTTTACGGTTTCAATAAGTGCGACTTTACGACGCTCCAACCGACTACGGACCGTGTTCTGTCTACCGATGTAGACGCGACCTGGGTCTGGGATAACAAGAAAATTGGCAGCGTGTACGATATTGCGAAAGCCGCTGACAAGGGTATCTTCGACAACGTCTATAATCTGGCGCGTGAGATCACCCTGACCACGTTTGCTCTGGAGAATTCCCCGAGCGTTCAGGCGACCATGTTTAACATGGCAACGCAGATTTTGGAAAAGGCATGTAGCGTGTACAGCGTGAGCTATGCATTGCCGAATAAGCACTACTTCCTGATTGATCTGAAGTGGAAGGGTCTGGAGAACGATAACGAACTGTTCTATCCGAGCCCGCACCCGAATGGTCTGATCAAGTGCACCGTTGTGCGTAAAGAAAAGACTAAACTG(SEQ ID NO：12)。
具体的表达和纯化条件将随着所使用的表达系统而变。例如，如果基因将要在大肠杆菌中表达，则可以通过将所述工程化的基因放置在适合的细菌启动子例如Trp或Tac和原核信号序列的下游，将它克隆在表达载体中。所述表达的分泌蛋白积累在折射体或包含体中，并且可以在通过弗氏压碎器或超声处理破碎细胞后收获。然后将所述折射体溶解，通过本领域中已知的方法将蛋白质重折叠并切割。
尿酸酶可以通过将用编码这些尿酸酶的表达载体转染的宿主细胞在允许所述尿酸酶表达的条件下生长(培养)来生产。在表达后，可以使用本领域中已知的技术收获并纯化或分离所述尿酸酶，例如亲和标签如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和组氨酸标签。用于尿酸酶的示例性表达和纯化流程描述在Liu等，(2011)APPL.MICROBIOL.BIOTECHNOL.92(3):529-37中。
IV.药物组合物
对于治疗性用途来说，本文中描述的重组尿酸酶优选地与可药用载体组合。当在本文中使用时，“可药用”是指那些在健全的医学判断范围之内适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。
当在本文中使用时，术语“可药用载体”是指适合与人类和动物的组织相接触使用而没有过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、载体和赋形剂。可药用载体包括任何标准的制药载体，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种不同类型的润湿剂。所述组合物还可以包括稳定剂和防腐剂。对于载体、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，《Remington制药学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)第15版，Mack Publ.Co.,Easton,PA[1975]。可药用载体包括与药物施用相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途在本领域中是已知的。
在某些实施方式中，所述尿酸酶可以与提高pH的药剂例如质子泵抑制剂(PPI)一起配制或例如通过肠途径(例如口服)共同施用(同时或顺序地)，以例如在酸性环境中，例如在胃肠道中提高所述尿酸酶的稳定性。
质子泵抑制剂是一类主要作用是显著并长期持续地减少胃酸生产的药物。质子泵抑制剂通过阻断胃壁细胞的氢/钾腺苷三磷酸酶系统(H+/K+ATP酶或更通常来说仅仅是胃质子泵)起作用。所述质子泵是胃酸分泌的最终阶段，直接负责将H+离子分泌到胃腔中，使其成为抑制酸分泌的理想靶点。质子泵抑制剂的实例包括：奥美拉唑(商标名：
Figure BDA0002388985330000281
)；兰索拉唑(商标名：
Figure BDA0002388985330000282
Figure BDA0002388985330000283
)；埃索美拉唑(商标名：
Figure BDA0002388985330000284
)；和泮托拉唑(商标名：
Figure BDA0002388985330000285
)。
含有本文中公开的重组尿酸酶的药物组合物可以以剂量单元形式存在，并且可以通过任何适合的方法制备。药物组合物应该被配制成与它的计划施用途径相容。所述药物组合物可以采取各种不同的形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液、分散系或悬液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的形式取决于计划施用方式和治疗性应用。
尽管所述组合物优选被配制成用于肠(例如口服)施用，这些组合物可以通过肠胃外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射)施用。当在本文中使用时，短语“肠胃外施用”意味着肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射，并包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨下注射和输注。
所述组合物可以被配制成溶液、微乳液、分散系、脂质体或适合于以高浓度稳定储存的其他有序结构。无菌注射溶液可以通过将本文中描述的药剂以所需量与所需的上文列出的成分之一或其组合一起并入到适合的溶剂中，然后过滤除菌来制备。通常，分散系通过将本文中描述的药剂并入到无菌介质中来制备，所述介质含有基础分散介质和来自于上文列出的成分的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从先前除菌过滤过的溶液产生本文中描述的药剂加上任何其他所需成分的粉剂。溶液的适合的流动性可以例如通过使用包衣例如卵磷脂，在分散系的情况下通过维持所需的粒子尺寸，和通过使用表面活性剂来维持。注射用组合物的延长吸收可以通过在所述组合物中包含延迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐和明胶来产生。
取决于施用方式例如通过肠胃外施用，可能希望生产无菌的药物剂型。除菌可以通过任何适合的方法例如通过无菌过滤膜过滤来实现。在所述组合物被冷冻干燥的情况下，过滤除菌可以在冷冻干燥和重构之前或之后进行。
在某些实施方式中，所公开的组合物包含可以例如包被所述尿酸酶的聚离子试剂(例如所述组合物包含聚离子包衣)。示例性的聚离子试剂包括PSS(聚(4-苯乙烯磺酸钠))、PAA(聚丙烯酸钠盐)、PMG(聚(亚甲基-共-胍)盐酸盐)、DS(硫酸葡聚糖)、PMA(聚(丙烯酸甲酯))或PVS(聚乙烯基硅氧烷)。
V.治疗性用途
本文中公开的重组尿酸酶可用于治疗与受试者中尿酸量升高相关的各种不同疾病或障碍。当在本文中使用时，“受试者中尿酸量升高”可以是指相对于没有所述疾病或障碍的受试者，在受试者中体液(例如血液、血浆、血清或尿液)、组织和/或细胞中尿酸量的升高。在人类血液中，对女性来说2.4-6mg/dL之间并且对男性来说3.4-7.2mg/dL之间的尿酸浓度，被Clinical Mayo Reference laboratory认为是正常的。
本发明提供了一种在受试者中治疗与尿酸量升高相关的疾病或障碍的方法。在某些实施方式中，所述疾病或障碍与所述受试者的血浆中的尿酸量升高相关。所述方法包括单独地或与另一种治疗剂相组合向所述受试者施用有效量的所公开的重组尿酸酶，以在所述受试者中治疗所述疾病或障碍。当在本文中使用时，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的活性药剂(例如本发明的重组尿酸酶)的量。有效量可以在一次或多次施用、施用或剂量中施用，并且不有意限于特定剂型或施用途径。
在某些实施方式中，所述方法包括单独地或与另一种治疗剂相组合向所述受试者口服施用有效量的所公开的重组尿酸酶，以在所述受试者中治疗所述疾病或障碍。设想了在某些实施方式中，所述口服施用的重组尿酸酶由于其尺寸可以避免在肠中的被动吸收，并且如果被代谢，与食物一起口服施用的本发明的新的重组尿酸酶将以与任何其他被摄入的蛋白质相似的方式被代谢。
当在本文中使用时，“治疗”意味着受试者中例如人类中疾病的治疗。这包括：(a)抑制所述疾病，即阻止其发展；和(b)减轻所述疾病，即引起所述疾病状态的消退。当在本文中使用时，术语“受试者”和“患者”是指将要通过本文中描述的方法和组合物治疗的生物体。这些生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠类、猿猴类、马科动物、牛科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物等)，更优选地包括人类。
与尿酸量升高相关的疾病或障碍的实例包括代谢障碍例如代谢综合征、高尿酸血症、痛风(例如痛风性关节炎)、Lesch-Nyhan综合征、心血管疾病、糖尿病、高血压、肾病、代谢综合征、尿酸肾结石症(或肾结石(参见Wiederkehr等，(2011)，Clin.Rev.Bone.Miner.Metab.,9(3-4):207-217(尿酸肾结石症是系统性代谢障碍的特征性表现。在所有结石形成者中它的患病率为约10％，是工业化世界中第三常见的肾结石类型)))、肿瘤溶解综合征和高尿酸尿症。
本文中描述的方法和组合物可以单独地或与其他治疗剂和/或方式相联合使用。当在本文中使用时，术语“相联合”施用被理解为意味着在所述受试者患有所述障碍的过程中向所述受试者递送两种(或更多种)不同治疗，使得对所述患者的治疗效果在时间点上交叠。在某些实施方式中，当第二种治疗的递送开始时，第一种治疗的递送仍在进行，使得在施用方面存在交叠。这在本文中有时被称为“同时”或“并发递送”。在其他实施方式中，一种治疗的递送在另一种治疗的递送开始之前结束。在上述任一种情况的某些实施方式中，由于联合施用，治疗更加有效。例如，与在不存在第一种治疗时施用第二种治疗的情形中观察到的相比，所述第二种治疗更加有效例如使用更少的第二种治疗观察到等同的效果，或者所述第二种治疗更大程度地减轻症状，或者，类似的情形在所述第一种治疗同样可见。在某些实施方式中，所述递送使得症状或与所述障碍相关的其他参数的减轻，与在不存在另一种治疗时递送一种治疗所观察到的情况相比更高。所述两种治疗的效果可以部分累加、完全累加或高于累加。所述递送可以使当第二种治疗递送时，所述递送的第一种治疗的效果仍可检测。
在某些实施方式中，本文中描述的方法或组合物与一种或多种另外的疗法相联合施用，所述另外的疗法选自黄嘌呤氧化酶抑制剂(例如别嘌呤醇、TEI-6720(2-(3-氰基-4-异丁氧基苯基)-4-甲基-5-噻唑甲酸)、非布索坦(2-[3-氰基-4-异丁氧基苯基]-4-甲基噻唑-5-甲酸)、羟嘌呤醇或蝶啶醛)、排尿酸药(例如丙磺舒、雷西奈德、磺吡酮或非诺贝特)、乙二胺四乙酸、乙酰唑胺、钾增补剂及其任何组合。
在整个本说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在过程和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，设想了另外存在实质上由所叙述的组分构成或由其构成的本发明的组合物，并存在实质上由所叙述的过程步骤构成或由其构成的根据本发明的过程和方法。
在本申请中，在要素或组分被称为包含在叙述的要素或组分的名单中和/或选自所述名单的情况下，应该理解所述要素或组分可以是所述叙述的要素或组分中的任一者，或者所述要素或组分可以选自由所述叙述的要素或组分中的两者或更多者构成的组。
此外，不论在本文中是明示还是暗示的，本文中描述的组合物或方法的要素和/或特点应该理解为可以以各种不同方式组合而不背离本发明的精神和范围。例如，在指称特定化合物的情况下，除非从上下文另有理解，否则该化合物可用于本发明的组合物的各种不同实施方式中和/或用于本发明的方法中。换句话说，在本申请中，实施方式以能够书写和绘制出清楚简明的申请的方式进行描述和描绘，但旨在并且应该理解，在不背离本教导和发明的前提下，可以对实施方式进行各种不同的组合或分离。例如应该认识到，本文中描述和描绘的所有特点可以适用于本文中描述和描绘的本发明的所有方面。
应该理解，表述“……中的至少一者”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
当在定量值之前使用术语“约”时，本发明还包括所述特定定量值本身，除非另有具体陈述。当在本文中使用时，术语“约”是指与标称值相差±10％，除非另有指明或推断。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
实施例
下面的实施例仅仅是说明性的，并且不打算以任何方式限制本发明的范围或内容。
实施例1–重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶的设计和测试
本实施例描述了具有提高的胰酶稳定性的重组突变产朊假丝酵母(Candidautilis)尿酸酶的设计和测试。
设计了95种突变产朊假丝酵母尿酸酶，其各自相对于野生型序列具有3个氨基酸替换。所述突变产朊假丝酵母尿酸酶被标注为R1_V1-R1_V95。
将编码所述95种突变产朊假丝酵母尿酸酶的DNA片段克隆到编码N-端His标签的鼠李糖pD861-NH表达载体(ATUM,Newark,CA)中。所有构建物通过测序验证。在大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)细胞中表达后，将每种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶结合到Ni-NTA柱，并在含有25mM Tris-HCl pH 8.0、100mM NaCl、200mM咪唑和50％(v/v)甘油的缓冲液中洗脱。
测试所述纯化的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶在胰酶(Sigma-Aldrich，目录号P7545；其在40℃下，在水中，在5分钟内将至少25倍其重量的马铃薯淀粉转变成可溶性糖类，在40℃下，在pH 7.5下，在60分钟内消化至少25倍其重量的酪蛋白，并且在37℃下，在pH9.0下，每mg胰酶每分钟从橄榄油释放至少2微当量的酸)存在下的酶活性，以确定胰酶稳定性。简单来说，将25ng/μL的尿酸酶与20ng/μL的胰酶在37℃下温育最长200分钟。所述测定在96孔板中，在模拟肠液(SIF)缓冲液(50mM磷酸钾，pH 6.8)中进行。在与胰酶温育指示的时间点后，使用基于吸收的测定法监测酶活性。尿酸在293nm处具有强吸收，并且尿酸酶催化的尿酸向5-羟基异尿酸的酶氧化引起293nm吸收值随时间的相应下降。
在多个蛋白质制备物上确认了具有最高胰酶稳定性的产朊假丝酵母尿酸酶突变体的结果。野生型产朊假丝酵母尿酸酶的代表性数据描绘在图1中，并且一部分突变产朊假丝酵母尿酸酶的代表性数据描绘在图2中。
表3描绘了所述95种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的氨基酸替换以及每种酶的比活性(每1.2ng/μl的尿酸酶的μM/分钟)、胰酶稳定性(半衰期，分钟)和表达产量(μg/ml)。“nd”指示由于表达产量不足，活性和稳定性测量值未被确定。
表3
Figure BDA0002388985330000331
Figure BDA0002388985330000341
Figure BDA0002388985330000351
Figure BDA0002388985330000361
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*比活性单位：每1.2ng/μl的尿酸酶的μM/分钟；#胰酶稳定性单位：半衰期，分钟
使用蛋白质建模工具对所述95种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶进行分析，鉴定到Y165F和I180V是对提高的胰酶稳定性有贡献的关键替换。因此，含有这两个替换的突变产朊假丝酵母尿酸酶在第二轮产朊假丝酵母尿酸酶的设计中被用作母体。
除非另有指明，否则第二轮的突变设计、表达、纯化和胰酶稳定性测定均如上所述来进行。所述过程产生95种突变产朊假丝酵母尿酸酶，其各自相对于野生型序列具有5个氨基酸替换，在每种情况下其中2个是Y165F和I180V替换。所述突变产朊假丝酵母尿酸酶在表4中被标注为R2_V1–R2_V95。
表4描绘了所述95种突变产朊假丝酵母尿酸酶的氨基酸替换以及每种酶的比活性(每1.2ng/μl的尿酸酶的μM/分钟)、胰酶稳定性(半衰期，分钟)和表达产量(μg/ml)。胰酶稳定性在80ng/μL的可溶性胰酶下测定。“nd”指示由于表达产量不足，活性和稳定性测量值未被确定。
表4
Figure BDA0002388985330000381
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*比活性单位：每1.2ng/μl的尿酸酶的μM/分钟；#胰酶稳定性单位：半衰期，分钟
一部分所述突变产朊假丝酵母尿酸酶的代表性胰酶稳定性数据描绘在图3中。一部分突变产朊假丝酵母尿酸酶通过差示扫描荧光测定法(DSF)进一步测试了热稳定性。DSF是一种通过将蛋白质在荧光染料存在下加热来评估热稳定性的方法，所述荧光染料在结合到蛋白质去折叠后暴露出的所述蛋白质疏水内部后将增加它的荧光。蛋白质去折叠曲线描绘在图4中。正如可以看到的，在那些测试过的尿酸酶中R2_V17具有最高的解链温度，相对于野生型尿酸酶提高5℃。
一部分突变产朊假丝酵母尿酸酶通过SDS-PAGE进一步测试了胰酶稳定性。图5示出了在将144ng/μL的尿酸酶与80ng/μL的胰酶在37℃下，在SIF缓冲液中温育指示的时间点后，通过SDS-PAGE进行的R2_V17、R2_V4和R2_V79产朊假丝酵母尿酸酶的分析。图6示出了在将100ng/μL的尿酸酶与320ng/μL的胰酶在37℃下，在SIF缓冲液中温育指示的时间点后，通过SDS-PAGE进行的野生型和R2_V17产朊假丝酵母尿酸酶的分析。来自于所述SDS-PAGE分析的结果与活性测定数据相一致。具体来说，R2_V17、R2_V4和R2_V79突变体相对于野生型显示出在胰酶存在下提高的稳定性。
合在一起，这些结果鉴定了与野生型产朊假丝酵母尿酸酶相比具有提高的对抗胰酶的稳定性并且比活性不显著降低的突变产朊假丝酵母尿酸酶。
实施例2–提高产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶稳定性的单个替换的鉴定
本实施例描述了在实施例1中描述的重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶中包括的单个替换的测试。
在实施例1中描述的突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶中包括的各种不同替换中，通过蛋白质建模工具选择了一组单个替换进行测试。在某些情况下，保守替换与实施例1中鉴定到的原始替换一起进行测试。总共设计并测试了51种突变产朊假丝酵母尿酸酶，其各自相对于野生型序列具有一个氨基酸替换。所述51种含有一个氨基酸替换的突变产朊假丝酵母尿酸酶在表5中用所述单个替换注明。将所述突变产朊假丝酵母尿酸酶与一部分实施例1中描述的突变产朊假丝酵母尿酸酶一起在胰酶稳定性测定法中进行测试。一部分在实施例1中描述的含有5个替换的突变产朊假丝酵母尿酸酶被测试，如表3中所阐述。结果概述在表5、图7和图8中。
表5描绘了所述突变产朊假丝酵母尿酸酶的氨基酸替换以及每种酶的比活性(每1.2μM的尿酸酶的μM/分钟)、胰酶稳定性(半衰期，分钟，±SEM)和表达产量(μg/ml)。胰酶稳定性在40ng/μL的可溶性胰酶下测定。“nd”指示由于表达产量不足，活性和稳定性测量值未被确定。
表5
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Figure BDA0002388985330000441
Figure BDA0002388985330000451
合在一起，这些结果鉴定了与野生型产朊假丝酵母尿酸酶相比具有提高的对抗胰酶的稳定性并且比活性不显著降低的突变产朊假丝酵母尿酸酶，并鉴定了足以提高产朊假丝酵母尿酸酶稳定性的单一替换。
实施例3-在肾病UrOx敲除(UrOxKO)小鼠中重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶减轻严重高尿酸血症并使高尿酸尿症恢复正常
在本实施例中，调查了通过重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶的口服施用进行的尿酸盐(尿酸)的定向消化道消除对高尿酸血症(血液中尿酸盐过量)和高尿酸尿症(尿液中尿酸过量)的效果。通过ES细胞中的基因打靶在尿酸盐氧化酶处引起定点突变而产生的UrOxKO小鼠(遵照在Wu等，PROC.NAT.ACAD.SCI.USA(1994),91:742-746中描述的方法)，发生严重的高尿酸血症、高尿酸尿症和尿酸结晶性阻塞性肾病，因此是调查模拟人类病症的高尿酸血症和相关障碍的适合的模型。
将包含编码突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶的SEQ ID NO：13的密码子优化的核酸序列的表达载体在大肠杆菌中表达，并分离和纯化表达的重组突变尿酸酶。
ATGAGCACCACACTGAGCAGCAGCACCTATGGTAAAGATAATGTGAAATTCCTGAAAGTGAAAAAAGATCCGCAGAACCCGAAAAAACAAGAAGTTATGGAAGCAACCGTTACCTGTCTGCTGGAAGGTGCATTTGATACCAGCTATACCAAAGCAGATAATAGCAGCATTGTTCCGACCGATACCGTGAAAAATACCATTCTGGTTCTGGCAAAAACCACCGAAATTTGGCCGATTGAACGTTTTGCAGCCAAACTGGCAACCCATTTTGTTGAGAAATATTCTCATGTTAGCGGTGTGAGCGTTAAAATTGTTCAGGATCGTTGGGTTAAATATGCCGTTGATGGTAAACCGCATGATCACAGCTTTATTCATGAAGGTGGTGAAAAACGTCGTACCGATCTGTATTACAAACGTAGCGGTGATTATAAACTGTCCAGCGCAATTAAAGATCTGACCGTTCTGAAAAGCACCGGCAGCATGTTTTATGGTTTTAACAAATGCGATTTCACAACCCTGCAGCCGACCACCGATCGTGTTCTGAGCACCGATGTTGATGCAACCTGGGTTTGGGATAATAAGAAAATTGGTAGCGTGTACGATATTGCCAAAGCAGCAGATAAAGGCATCTTCGATAATGTGTATAATCAGGCACGTGAAATTACCCTGACCACCTTTGCACTGGAAAATAGCCCGAGCGTTCAGGCAACCATGTTTAATATGGCGACCCAGATTCTGGAAAAAGCGTGTAGCGTTTATAGCGTTAGCTATGCACTGCCGAACAAACACTATTTTCTGATTGACCTGAAATGGAAGGGCCTTGAAAATGATAACGAACTGTTTTATCCGAGTCCGCATCCGAATGGTCTGATTAAATGTACCGTTGTGCGTAAAGAGAAAACCAAACTG(SEQ ID NO：13)
所述研究在三个研究阶段的三个平行组中使用了UrOxKO小鼠——治疗前组、治疗组和随访组，每个组持续7天。在研究开始之前，所有小鼠均接受了150mg/L的别嘌呤醇(ALLO)；这个阶段是ALLO的维持剂量。在“治疗前”阶段期间，不向所述小鼠施用维持剂量的ALLO或用于治疗严重高尿酸血症、高尿酸尿症和尿酸结晶性阻塞性肾病的任何其他治疗剂。
在所述治疗组中选择八(8)只小鼠使用重组突变尿酸酶进行治疗，并且作为阳性对照，选择十七(17)只小鼠使用别嘌呤醇(ALLO)进行治疗(对于ALLO 150mg/L来说n＝9，对于ALLO 50mg/L来说n＝8)；在开始治疗之前(撤除ALLO维持剂量的第7天或治疗前阶段的第7天)，在治疗期间(在治疗的第7天(25％尿酸酶和75％海藻糖的喷雾干燥粉剂，与3.5g食物混合，每天施用共7天，并在所述治疗的第7天进行测量))，和治疗结束后7天在随访组中，从同一组小鼠(即封闭组群)获取血浆尿酸盐水平的测量值。在所述重组突变尿酸酶和ALLO组群两者中，在开始相应的治疗前观察期之前小鼠接受150mg/L ALLO的维持剂量。
在所述治疗前阶段开始时，撤除150mg/L ALLO的维持剂量。在撤除ALLO维持剂量后第7天测量收集的血浆样品中的血浆尿酸盐水平，并测量在所述治疗前阶段的最后3天期间收集的24小时尿液样品中的尿液尿酸水平。血浆尿酸盐水平和尿液尿酸水平按照Cormay,Poland的Liquick Cor-UA 30plus方案(Liquick Cor-UA 30plus，试剂盒尺寸5x30ml，目录号2-260)来测量。
用重组突变尿酸酶治疗的小鼠(n＝8)口服接受与食物混合的大约62mg/天(或1,500U/天)的重组突变尿酸酶(25％尿酸酶和75％海藻糖的喷雾干燥粉剂，与3.5g食物混合)。在对照组中，小鼠(n＝17)被施用增补在水中的150mg/L ALLO(n＝9)和50mg/L ALLO(n＝8)。在分别使用重组突变尿酸酶、ALLO 150mg/L和ALLO 50mg/L治疗的第7天，测量从小鼠收集的血液样品中的血浆尿酸盐水平，并测量在所述治疗阶段的最后3天期间收集的24小时尿液样品中的尿液尿酸水平。
在随访阶段中，在分别使用重组突变尿酸酶、ALLO 150mg/L和ALLO 50mg/L的治疗结束后的第7天，测量从小鼠收集的血液样品中的血浆尿酸盐水平。
用于尿液尿酸的测定法按照制造商的说明书进行(Cormay,Poland的LiquickCor-UA 30plus方案(Liquick Cor-UA 30plus，试剂盒尺寸5x 30ml，目录号2-260))。例如，取决于动物组和收集时间，将尿液样品1:4、1:9或1:14稀释。为了防止尿酸的盐的沉淀，在收集24小时样本之前向收集管添加1滴NaOH(500g/L)。
血浆尿酸盐水平也按照制造商的说明书来测量(Liquick Cor-UA30plus方案)。血液样品中的尿酸盐水平不稀释或用双蒸水(ddH2O)1:1稀释进行测量。
所述测量到的血浆尿酸盐水平和尿液尿酸水平证实了在口服施用重组突变尿酸酶后的7天内，高尿酸血症(即血液中的过量尿酸)显著降低(p<0.001)并且高尿酸尿症(即尿液中存在过量尿酸)恢复正常(图9A和9B)。与治疗前相比，用重组突变尿酸酶治疗的小鼠的血浆尿酸盐减少44％(平均值的标准误差(SEM)从14.5±0.9到8.1±0.5mg/dL)，其与在50mg/L ALLO小鼠中观察到的51％的减少(平均值(SEM)从13.2±2.6到6.5±1.1mg/dL)相近；p＝NS。所述结果证实，在ALLO 50mg/L和重组突变尿酸酶对血浆尿酸盐水平的效果之间不存在显著差异。在用ALLO 150mg/L治疗的小鼠中观察到69％的最高的减少(平均值(SEM)从13.8±1.7到4.3±0.6mg/dL)。
重组突变尿酸酶或ALLO的撤除导致高尿酸血症返回到接近治疗前的水平。这如下进行研究。
使用重组突变尿酸酶尿液尿酸排泄恢复正常(<2mg/24小时)，减少86％(平均值(SEM)从4.7±0.6到0.7±0.1mg/24h)；而在用ALLO50mg/L和150mg/L治疗的小鼠中，减少分别为34％(平均值(SEM)从4.9±0.4到3.2±0.3mg/24h)和66％(平均值(SEM)从6.4±0.7到2.2±0.3mg/24h)。来自于胃肠道(GIT)的不同部分的消化物(食物被胃分泌物转变成的半流体物质，其经过胃进入小肠)的分析表明尿酸沿着整个消化道存在，证实了尿酸盐从循环的分泌。
本实施例中呈现的结果证实了在肾病UrOxKO小鼠中，通过口服施用的重组突变尿酸酶靶向肠内尿酸(从循环分泌到肠内的尿酸)成功地降低了血清尿酸水平。
编号的实施方式
应该理解，尽管本公开已结合其详细描述进行了描述，但上面的描述旨在说明而不是限制由随附的权利要求书的范围所呈现的本公开的范围。其他的方面、优点和修改在下面的权利要求书的范围之内。
本文公开的实施方式包括在本公开的编号实施方式中所提供的实施方式P1至P53：
实施方式P1：一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)突变，其中所述至少一个突变选自：(a)在第180位，异亮氨酸被缬氨酸或丙氨酸替换(I180V或I180A)，(b)在第165位，酪氨酸被苯丙氨酸替换(Y165F)，(c)在第190位，缬氨酸被甘氨酸或丙氨酸替换(V190G或V190A)，(d)在第51位，谷氨酸被赖氨酸替换(E51K)，(e)在第244位，谷氨酰胺被赖氨酸替换(Q244K)，(f)在第132位，异亮氨酸被精氨酸或天冬酰胺替换(I132R或I132N)，(g)在第97位，缬氨酸被异亮氨酸替换(V97I)，(h)在第92位，谷氨酸被天冬酰胺替换(E92N)，(i)在第87位，丙氨酸被甘氨酸替换(A87G)，(j)在第142位，天冬氨酸被谷氨酸替换(D142E)，(k)在第44位，甘氨酸被丙氨酸替换(G44A)，(l)在第128位，甘氨酸被脯氨酸替换(G128P)，(m)在第236位，丙氨酸被天冬酰胺替换(A236N)，(n)在第208位，赖氨酸被丙氨酸替换(K208A)，(o)在第213位，天冬酰胺被丙氨酸替换(N213A)，(p)在第140位，丝氨酸被苏氨酸替换(S140T)，(q)在第253位，酪氨酸被谷氨酰胺替换(Y253Q)，(r)在第84位，丙氨酸被丝氨酸替换(A84S)，(s)在第47位，苏氨酸被谷氨酸替换(T47E)，(t)在第95位，丝氨酸被脯氨酸替换(S95P)，(u)在第103位，赖氨酸被苏氨酸替换(K103T)，(v)在第134位，天冬氨酸被谷氨酸替换(D134E)，(w)在第136位，酪氨酸被精氨酸替换(Y136R)，(x)在第196位，异亮氨酸被亮氨酸替换(I196L)，(y)在第224位，苏氨酸被天冬氨酸替换(T224D)，(z)在第285位，脯氨酸被丝氨酸替换(P285S)，和(aa)在第296位，缬氨酸被丙氨酸替换(V296A)。
实施方式P2：实施方式P1所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，V190A，E51K，Q244K，I132R，V97I，E92N，A87G，D142E，G44A，G128P，A236N，K208A，N213A，S140T，Y253Q和A84S。
实施方式P3：实施方式P1或P2所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，Q244K，I132R，V97I，E92N，A87G，D142E和G44A。
实施方式P4：实施方式P1-P3中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，I132R和G44A。
实施方式P5：实施方式P1-P4中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，E51K，I132R和G44A。
实施方式P6：实施方式P1-P5中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V，I180A，Y165F，V190G，E51K，Q244K和I132R。
实施方式P7：一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5或6个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第190位、第51位、第132位和第44位的位置处。
实施方式P8：一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4或5个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第51位、第132位和第44位的位置处。
实施方式P9：一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5或6个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第190位、第51位、第244位和第132位的位置处。
实施方式P10：实施方式P1-P9中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含2、3、4、5、6、7或8个突变。
实施方式P11：实施方式P1-P10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180V，Y165F，E51K，I132R和G44A。
实施方式P12：实施方式P1-P10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180A，Y165F，E51K，I132R和G44A。
实施方式P13：实施方式P1-P10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180V，Y165F，V190G，E51K，I132R和G44A。
实施方式P14：实施方式P1-P10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180A，Y165F，V190G，E51K，I132R和G44A。
实施方式P15：实施方式P1-P10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180V和Y165F。
实施方式P16：实施方式P1-P10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180V，Y165F，V190G，E51K，Q244K和I132R。
实施方式P17：一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含列于表1或表2中的替换。
实施方式P18：一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在胰酶存在下具有至少35分钟的半衰期。
实施方式P19：实施方式P17所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中在胰酶存在下所述半衰期为35–200分钟。
实施方式P20：实施方式P1-P19中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中与野生型尿酸酶相比，所述尿酸酶在胰酶存在下具有高5-50倍的稳定性。
实施方式P21：实施方式P20所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中与野生型尿酸酶相比，所述尿酸酶在胰酶存在下具有高20-30倍的稳定性。
实施方式P22：实施方式P1-P21中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶被分离。
实施方式P23：实施方式P1-P22中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶被偶联到水溶性聚合物。
实施方式P24：实施方式P23所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶被偶联到聚乙二醇(PEG)。
实施方式P25：一种表达载体，其包含编码实施方式P1-P24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的核酸序列。
实施方式P26：实施方式P25所述的表达载体，其中所述编码重组突变尿酸酶的核酸序列被密码子优化，用于在异源细胞中表达。
实施方式P27：实施方式P26所述的表达载体，其中所述异源细胞是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。
实施方式P28：一种细胞，其包含实施方式P25-P27中任一项所述的表达载体。
实施方式P29：实施方式28所述的细胞，其中所述细胞是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。
实施方式P30：一种药物组合物，其包含实施方式P1-P24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶。
实施方式P31：实施方式P30所述的药物组合物，其还包含可药用载体和/或赋形剂。
实施方式P32：实施方式P30或P31所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成口服剂型或肠胃外剂型。
实施方式P33：实施方式P32所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成口服剂型。
实施方式P34：实施方式P30-P33中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成粉剂、颗粒剂、球丸、微球丸或小片剂。
实施方式P35：实施方式P30-P34中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被包封在胶囊中或配制成片剂剂型。
实施方式P36：实施方式P35所述的药物组合物，其中所述胶囊是羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊、软明胶胶囊或硬明胶胶囊。
实施方式P37：实施方式P32所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成肠胃外剂型。
实施方式P38：实施方式P37所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成静脉内剂型。
实施方式P39：一种在需要的受试者中治疗与尿酸量升高相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方式P1-P24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，由此在所述受试者中治疗所述疾病或障碍。
实施方式P40：实施方式P39所述的方法，其中所述疾病或障碍与所述受试者的血浆中尿酸量升高相关。
实施方式P41：一种在需要的受试者中治疗高尿酸血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方式P1-P24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，由此在所述受试者中治疗高尿酸血症。
实施方式P42：一种在需要的受试者中治疗痛风的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方式P1-P24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，由此在所述受试者中治疗痛风。
实施方式P43：一种在需要的受试者中治疗高尿酸血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方式P30-P38中任一项所述的药物组合物，由此在所述受试者中治疗高尿酸血症。
实施方式P44：一种在需要的受试者中治疗痛风的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方式P30-P38中任一项所述的药物组合物，由此在所述受试者中治疗痛风。
实施方式P45：实施方式P39-P44中任一项所述的方法，其中所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶与黄嘌呤氧化酶抑制剂、排尿酸药或其组合相联合施用。
实施方式P46：实施方式P45所述的方法，其中所述黄嘌呤氧化酶抑制剂选自别嘌呤醇和非布索坦。
实施方式P47：实施方式P45所述的方法，其中所述排尿酸药选自丙磺舒、苯溴马隆、氯沙坦和雷西奈德。
实施方式P48：一种在需要的受试者中治疗高尿酸尿症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方式P1-P24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，由此在所述受试者中治疗高尿酸尿症。
实施方式P49：一种在需要的受试者中治疗高尿酸尿症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的实施方式P30-P38中任一项所述的药物组合物，由此在所述受试者中治疗高尿酸尿症。
实施方式P50：实施方式P48或P49所述的方法，其中所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶与黄嘌呤氧化酶抑制剂、排尿酸药或其组合相联合施用。
实施方式P51：实施方式P48或P49所述的方法，其中所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶在黄嘌呤氧化酶抑制剂、排尿酸药或其组合的施用之后施用。
实施方式P52：实施方式P50或P51所述的方法，其中所述黄嘌呤氧化酶抑制剂选自别嘌呤醇和非布索坦。
实施方式P53：实施方式P50或P51所述的方法，其中所述排尿酸药选自丙磺舒、苯溴马隆、氯沙坦和雷西奈德。
通过参考并入
本文中参考的每个专利和科学文献的全部公开内容为所有目的通过参考并入本文。
等同性
本发明可以以其他特定形式体现，而不背离本发明的精神或本质特征。因此，前述实施方式在所有方面都应认为是说明性的，而不是对本文中描述的发明的限制。因此，本发明的范围由随附的权利要求书而不是由前述描述指明，并意图将落入权利要求书的等同性含义和范围之内的所有改变都包括在其中。
序列表
<110> 艾乐娜制药有限公司
<120> 重组尿酸酶
<130> AJ4309PT2001
<150> US62/678,511
<151> 2018-05-31
<150> US62/529,726
<151> 2017-07-07
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
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cgcttcgccg cgaaactggc gacccatttc gttgagaagt acagccacgt gagcggcgtg 300
agcgttaaaa ttgttcagga tcgttgggtc aaatatgccg tggatggtaa gccgcatgac 360
cacagcttta ttcacgaggg tggcgagaag cgtatcactg acctgtatta caagcgcagc 420
ggtgagtaca aattgagcag cgcaatcaaa gacctgacgg tcctgaaaag caccggttct 480
atgttttacg gtttcaataa gtgcgacttt acgacgctcc aaccgactac ggaccgtgtt 540
ctgtctaccg atgtagacgc gacctgggtc tgggataaca agaaaattgg cagcgtgtac 600
gatattgcga aagccgctga caagggtatc ttcgacaacg tctataatct ggcgcgtgag 660
atcaccctga ccacgtttgc tctggagaat tccccgagcg ttcaggcgac catgtttaac 720
atggcaacgc agattttgga aaaggcatgt agcgtgtaca gcgtgagcta tgcattgccg 780
aataagcact acttcctgat tgatctgaag tggaagggtc tggagaacga taacgaactg 840
ttctatccga gcccgcaccc gaatggtctg atcaagtgca ccgttgtgcg taaagaaaag 900
actaaactg 909
<210> 13
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码突变产朊假丝酵母（Candida utilis）尿酸酶的密码子优化的核酸序列
<400> 13
atgagcacca cactgagcag cagcacctat ggtaaagata atgtgaaatt cctgaaagtg 60
aaaaaagatc cgcagaaccc gaaaaaacaa gaagttatgg aagcaaccgt tacctgtctg 120
ctggaaggtg catttgatac cagctatacc aaagcagata atagcagcat tgttccgacc 180
gataccgtga aaaataccat tctggttctg gcaaaaacca ccgaaatttg gccgattgaa 240
cgttttgcag ccaaactggc aacccatttt gttgagaaat attctcatgt tagcggtgtg 300
agcgttaaaa ttgttcagga tcgttgggtt aaatatgccg ttgatggtaa accgcatgat 360
cacagcttta ttcatgaagg tggtgaaaaa cgtcgtaccg atctgtatta caaacgtagc 420
ggtgattata aactgtccag cgcaattaaa gatctgaccg ttctgaaaag caccggcagc 480
atgttttatg gttttaacaa atgcgatttc acaaccctgc agccgaccac cgatcgtgtt 540
ctgagcaccg atgttgatgc aacctgggtt tgggataata agaaaattgg tagcgtgtac 600
gatattgcca aagcagcaga taaaggcatc ttcgataatg tgtataatca ggcacgtgaa 660
attaccctga ccacctttgc actggaaaat agcccgagcg ttcaggcaac catgtttaat 720
atggcgaccc agattctgga aaaagcgtgt agcgtttata gcgttagcta tgcactgccg 780
aacaaacact attttctgat tgacctgaaa tggaagggcc ttgaaaatga taacgaactg 840
ttttatccga gtccgcatcc gaatggtctg attaaatgta ccgttgtgcg taaagagaaa 900
accaaactg 909

Claims (53)

1.一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5、6、7或8个)突变，其中所述至少一个突变选自：(a)在第180位，异亮氨酸被缬氨酸或丙氨酸替换(I180V或I180A)，(b)在第165位，酪氨酸被苯丙氨酸替换(Y165F)，(c)在第190位，缬氨酸被甘氨酸或丙氨酸替换(V190G或V190A)，(d)在第51位，谷氨酸被赖氨酸替换(E51K)，(e)在第244位，谷氨酰胺被赖氨酸替换(Q244K)，(f)在第132位，异亮氨酸被精氨酸或天冬酰胺替换(I132R或I132N)，(g)在第97位，缬氨酸被异亮氨酸替换(V97I)，(h)在第92位，谷氨酸被天冬酰胺替换(E92N)，(i)在第87位，丙氨酸被甘氨酸替换(A87G)，(j)在第142位，天冬氨酸被谷氨酸替换(D142E)，(k)在第44位，甘氨酸被丙氨酸替换(G44A)，(l)在第128位，甘氨酸被脯氨酸替换(G128P)，(m)在第236位，丙氨酸被天冬酰胺替换(A236N)，(n)在第208位，赖氨酸被丙氨酸替换(K208A)，(o)在第213位，天冬酰胺被丙氨酸替换(N213A)，(p)在第140位，丝氨酸被苏氨酸替换(S140T)，(q)在第253位，酪氨酸被谷氨酰胺替换(Y253Q)，(r)在第84位，丙氨酸被丝氨酸替换(A84S)，(s)在第47位，苏氨酸被谷氨酸替换(T47E)，(t)在第95位，丝氨酸被脯氨酸替换(S95P)，(u)在第103位，赖氨酸被苏氨酸替换(K103T)，(v)在第134位，天冬氨酸被谷氨酸替换(D134E)，(w)在第136位，酪氨酸被精氨酸替换(Y136R)，(x)在第196位，异亮氨酸被亮氨酸替换(I196L)，(y)在第224位，苏氨酸被天冬氨酸替换(T224D)，(z)在第285位，脯氨酸被丝氨酸替换(P285S)，和(aa)在第296位，缬氨酸被丙氨酸替换(V296A)。
2.权利要求1所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V、I180A、Y165F、V190G、V190A、E51K、Q244K、I132R、V97I、E92N、A87G、D142E、G44A、G128P、A236N、K208A、N213A、S140T、Y253Q和A84S。
3.权利要求1或2所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V、I180A、Y165F、V190G、E51K、Q244K、I132R、V97I、E92N、A87G、D142E和G44A。
4.权利要求1-3中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V、I180A、Y165F、V190G、E51K、I132R和G44A。
5.权利要求1-4中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V、I180A、Y165F、E51K、I132R和G44A。
6.权利要求1-5中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含选自下述的至少一个突变：I180V、I180A、Y165F、V190G、E51K、Q244K和I132R。
7.一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5或6个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第190位、第51位、第132位和第44位的位置处。
8.一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4或5个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第51位、第132位和第44位的位置处。
9.一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在对应于SEQ ID NO：1的野生型产朊假丝酵母尿酸酶的位置处包含至少一个(例如1、2、3、4、5或6个)突变，其中所述至少一个突变存在于选自第180位、第165位、第190位、第51位、第244位和第132位的位置处。
10.权利要求1-9中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含2、3、4、5、6、7或8个突变。
11.权利要求1-10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180V、Y165F、E51K、I132R和G44A。
12.权利要求1-10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180A、Y165F、E51K、I132R和G44A。
13.权利要求1-10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180V、Y165F、V190G、E51K、I132R和G44A。
14.权利要求1-10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180A、Y165F、V190G、E51K、I132R和G44A。
15.权利要求1-10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180V和Y165F。
16.权利要求1-10中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶包含下述替换：I180V、Y165F、V190G、E51K、Q244K和I132R。
17.一种重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其包含表1或表2中列出的替换。
18.一种重组突变产朊假丝酵母(Candida utilis)尿酸酶，其在胰酶存在下具有至少35分钟的半衰期。
19.权利要求17所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中在胰酶存在下所述半衰期为35–200分钟。
20.权利要求1-19中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中与野生型尿酸酶相比，所述尿酸酶在胰酶存在下具有高5-50倍的稳定性。
21.权利要求20所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中与野生型尿酸酶相比，所述尿酸酶在胰酶存在下具有高20-30倍的稳定性。
22.权利要求1-21中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶被分离。
23.权利要求1-22中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶被偶联到水溶性聚合物。
24.权利要求23所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，其中所述尿酸酶被偶联到聚乙二醇(PEG)。
25.一种表达载体，其包含编码权利要求1-24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶的核酸序列。
26.权利要求25所述的表达载体，其中所述编码重组突变尿酸酶的核酸序列经密码子优化以在异源细胞中表达。
27.权利要求26所述的表达载体，其中所述异源细胞是大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)。
28.一种细胞，其包含权利要求25-27中任一项所述的表达载体。
29.权利要求28所述的细胞，其中所述细胞是大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)。
30.一种药物组合物，其包含权利要求1-24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶。
31.权利要求30所述的药物组合物，其还包含可药用载体和/或赋形剂。
32.权利要求30或31所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成口服剂型或肠胃外剂型。
33.权利要求32所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成口服剂型。
34.权利要求30-33中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成粉剂、颗粒剂、球丸、微球丸或小片剂。
35.权利要求30-34中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物被包封在胶囊中或配制成片剂剂型。
36.权利要求35所述的药物组合物，其中所述胶囊是羟丙基甲基纤维素(HPMC)胶囊、软明胶胶囊或硬明胶胶囊。
37.权利要求32所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成肠胃外剂型。
38.权利要求37所述的药物组合物，其中所述组合物被配制成静脉内剂型。
39.一种在需要的受试者中治疗与尿酸量升高相关的疾病或障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，由此在所述受试者中治疗所述疾病或障碍。
40.权利要求39所述的方法，其中所述疾病或障碍与所述受试者的血浆中尿酸量升高相关。
41.一种在需要的受试者中治疗高尿酸血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，由此在所述受试者中治疗高尿酸血症。
42.一种在需要的受试者中治疗痛风的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，由此在所述受试者中治疗痛风。
43.一种在需要的受试者中治疗高尿酸血症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求30-38中任一项所述的药物组合物，由此在所述受试者中治疗高尿酸血症。
44.一种在需要的受试者中治疗痛风的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求30-38中任一项所述的药物组合物，由此在所述受试者中治疗痛风。
45.权利要求39-44中任一项所述的方法，其中所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶与黄嘌呤氧化酶抑制剂、排尿酸药或其组合相联合施用。
46.权利要求45所述的方法，其中所述黄嘌呤氧化酶抑制剂选自别嘌呤醇和非布索坦。
47.权利要求45所述的方法，其中所述排尿酸药选自丙磺舒、苯溴马隆、氯沙坦和雷西奈德。
48.一种在需要的受试者中治疗高尿酸尿症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-24中任一项所述的重组突变产朊假丝酵母尿酸酶，由此在所述受试者中治疗高尿酸尿症。
49.一种在需要的受试者中治疗高尿酸尿症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求30-38中任一项所述的药物组合物，由此在所述受试者中治疗高尿酸尿症。
50.权利要求48或49所述的方法，其中所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶与黄嘌呤氧化酶抑制剂、排尿酸药或其组合相联合施用。
51.权利要求48或49所述的方法，其中所述重组突变产朊假丝酵母尿酸酶在黄嘌呤氧化酶抑制剂、促尿酸排泄药或其组合的施用之后施用。
52.权利要求50或51所述的方法，其中所述黄嘌呤氧化酶抑制剂选自别嘌呤醇和非布索坦。
53.权利要求50或51所述的方法，其中所述排尿酸药选自丙磺舒、苯溴马隆、氯沙坦和雷西奈德。
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