CN1561390A - Peg修饰的尿酸酶 - Google Patents

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Abstract

本发明针对聚乙二醇修饰的尿酸酶和治疗特征为循环尿酸水平增加的不同疾病的方法，包括但不限于高尿酸血症和肿瘤崩解综合症。

Description

PEG修饰的尿酸酶
发明的领域
本发明针对聚乙二醇修饰的尿酸酶和治疗特征为循环尿酸水平增加的不同疾病的方法。
发明的背景
尿酸是鸟、爬行动物和灵长类动物包括人中嘌呤代谢的产物。尿酸是鸟嘌呤核苷酸分解代谢中的中间物，而次黄嘌呤是在腺嘌呤核苷酸分解中产生的尿酸是通过黄嘌呤和次黄嘌呤的氧化在肝脏中产生的。在大部分哺乳动物中，尿酸进一步被酶尿酸氧化酶氧化成尿囊素。尿囊素由于失去其嘧啶环，表现出超过尿酸20倍多的水溶解性。
尿酸氧化酶也称为尿酸酶，是嘌呤降解途径的酶。尿酸酶催化尿酸+O2转变成尿囊素+CO2。
人缺乏尿酸酶且不能生成尿囊素。这是突变的结果，突变在人尿酸酶基因编码序列中引入提前终止密码子(Wu等.，J.Mol.Evol.34：78-84，1992；Wu等.，ProcNatl Acad Sci USA 91：742-6，1994，各自纳入本文供参考)。作为此突变的结果，人中的嘌呤分解代谢终止于尿酸生成，尿酸相对不可溶(蒸馏水中的溶解性指数是13.2mg/dl)，使人对称为高尿酸血症的病理情况敏感。肾处理尿酸是复杂的且需要肾小球过滤、过滤尿酸的再吸收、肾小管分泌和最终的分泌后再吸收。
高尿酸血症定义为在尿酸的血清水平高于8mg/dl时发生。高尿酸血症可导致血清中形成尿酸晶体，尿酸晶体可沉淀在关节、皮肤和肾中。这可导致关节炎症(痛风)、肾衰竭、代谢性酸中毒和高钾血症。尿酸过度生成可能有多种来源，包括先天性代谢缺陷、自毁容貌综合症、嘌呤或蛋白质的过度消化和用排尿酸药物治疗(Kelley，W.N.和Wortman，R.L.《风湿病学教科书》(Textbook ofRheumatology)，第5版，1313-1351页，1997；纳入本文供参考)。高尿酸血症也发现于心脏或肾移植并用免疫抑制剂治疗的病人。高尿酸血症可导致这些病人失去肾功能且可产生显著的发病率和死亡率。
高尿酸血症也发现于患恶性疾病的病人中。化学治疗和放射治疗的癌症病人可诱导称为肿瘤崩解综合症的威胁生命的情况(Kalemkerian，G.P.，Darwish，B.，和Varterasian，M.L.Am J.Med.103，363-367，1997；Lorigan，P.C.，Woodings，P.L.，Morgenstern，G.R.，和Scarffe，J.H.Ann Oncol.7，631-636，1996；Hande，K.R.，和Garrow，G.C.Am J.Med.94，133-139，1993)。血液恶性肿瘤如白血病和淋巴瘤，引起大部分肿瘤崩解综合症。肿瘤崩解综合症特征为高尿酸血症、高钾血症、高磷酸盐血症和急性肾衰竭的迅速发展。急性肾衰竭是尿酸的肾内沉淀的结果。肿瘤崩解综合症通常由化疗和放射疗法引起的细胞死亡触发，导致胞内物质的释放。然而，重肿瘤负担的癌症病人甚至在没有放射疗法或化疗时偶尔可表现出高尿酸血症和其它肿瘤崩解综合症的特征，这是由于恶性细胞的高转化率，恶性细胞随后将释放的嘌呤分解代谢谢到尿酸中。
防止和治疗肿瘤崩解综合症相关急性肾衰竭的疗法是相当大的挑战，且一些原因目前不令人满意。治疗高尿酸血症的方法包括水合、尿碱化、渗透性利尿和别嘌呤醇疗法。然而，治疗高尿酸血症的困难在于可能加重肿瘤崩解综合症的其它后果例如，增加尿酸溶解度的尿碱化促进磷酸钙沉淀。别嘌呤醇(4-羟基嘌呤醇)是黄嘌呤的类似物，长期作为高尿酸血症的标准治疗且也用于防止肿瘤崩解综合症。别嘌呤醇转化成羟嘌呤醇，结合并抑制黄嘌呤氧化酶，该酶催化次黄嘌呤和黄嘌呤转化成尿酸。结果，尿酸生成被抑制，黄嘌呤和次黄嘌呤浓度增加。然而，别嘌呤醇不去除已存在和作为晶体肾内沉积的尿酸。结果，通常在初次用别嘌呤醇治疗后几天(有时10-14天)可观察到血清中尿酸显著减少。尽管黄嘌呤和次黄嘌呤的溶解度仅稍高于尿酸，嘌呤在别嘌呤醇治疗中分解代谢成黄嘌呤、次黄嘌呤和尿酸，而不是大部分分解代谢成尿酸。结果是尿酸的尿浓度减少到其溶解度以下且防止进一步形成尿酸晶体。然而，在嘌呤过度分解代谢中，别嘌呤醇治疗可导致次黄嘌呤和黄嘌呤的肾内沉淀，进一步加重急性肾衰竭。此情况在临床实践中有充分的文献记载。此外，别嘌呤醇治疗也与显著毒性相关并可引起死亡。别嘌呤醇可产生严重的毒性作用，包括皮肤超敏感性反应、白细胞减少和肝肿大。此药物也涉及引起肾小管间质性肾炎。此外，别嘌呤醇可引起不利的药物相互作用，如6-巯基嘌呤和腺嘌呤阿拉伯糖苷、常用于治疗淋巴细胞增生性疾病和白血病的药物所示(Lauter，CB，Bailey，EJ，Lerner，AM.J Infect.Dis 1976；134，75-79)。最后，尽管别嘌呤醇可阻碍尿酸形成，它很少使已存在的尿酸溶解。所有这些不利作用有时使别嘌呤醇对于治疗肿瘤病人的急性高尿酸血症无效。因此别嘌呤醇不是治疗高尿酸血症的理想药物。
透析和连续动静脉血液透析是另外的方法，用于去除高尿酸血症病人中的尿酸。然而，这些治疗方法对恶性肿瘤病人有问题，因为血小板减少或抗凝作用需要引起严重出血的风险。此外，由于这些治疗的侵入性质，在许多情况中由于疾病或所接受的治疗而免疫减弱的病人发生致死感染的风险增加。
尿酸酶显示出有效治疗高尿酸血症和肿瘤崩解综合症(London，M.，和Hudson，P.B.Science，125，937-938，1957；Oberling，F.和Lang，J.M.Nouvelle Presse Med3，2026，1974；Robert，A.，Corberand，J.和Regnier，C.Rev.Med.Toulouse 12，1093-1100，1976；Masera G.，等.，J.Pediatrics 100，152-155，1982；Jankovic，M.，等.，Am.J.Pediatr.Hematol.Oncol.7，202-204，1985；Masera，G.和Jankovic，M.Ann.Oncol.8,407,1996；Jones，D.P.Mahmoud，H.和Chesney，R.W.Pediatr.Nephrol.9，206-212，1995)。用尿酸酶治疗将尿酸转变化高度可溶性尿囊素。此外，如果足够过滤入尿中，尿酸酶甚至可溶解已经沉淀的尿酸晶体并改善肾功能。
尿酸酶在治疗高尿酸血症和肾结石中有一些优势，包括低尿酸血效果的速度(在少于24h内减少高尿酸血症50％)，且与其它药物如别嘌呤醇相比更好的保护肾抗结石病。
尿酸酶仅在少数国家可用，目前限制此治疗的使用。尿酸酶通过复杂的生产过程从黄曲霉(Aspergillus flavus)中提取，在法国自1975年起且在意大利自1980年代早期尿酸酶以Uricozyme商品名可从Sanofi(Clin-Midy，Paris，France)购得。此药物在欧洲被广泛研究并显示在施用几分钟内对迅速降低病人的尿酸水平非常有效(Oberling，F.和Lang，J.M.Nouvelle Presse Med 3，2026，1974；Robert，A.，Corberand，J.和Regneir，C.Rev.Med.Toulouse 12，1093-1100，1976)。此治疗经常用于病人以防止肿瘤崩解综合症。在一个包括超过400个病人的研究中，尿酸酶治疗有效去除肿瘤崩解综合症(Masera，G.和Jankovic，M.Ann.Oncol.8，407，1996)。在美国，Uricozyme被圣裘德儿童医院和田纳面大学的一组研究人员广泛测试(Pui，C.-H.，等.，Leukemia，11，1813-1816，1997)。这些研究人员在3年中治疗了126个儿童，并发现尿酸酶治疗在降低血清尿酸水平方面比别嘌呤醇迅速得多且更有效。此外，没有尿酸酶治疗的个体发生肿瘤崩解综合症或需要透析。
尽管肿瘤学家充分了解尿酸酶的潜在优势，此治疗在肾领域没有被广泛认识。在高尿酸血症中更全面应用尿酸酶的一个障碍可能是参与发酵、提取和纯化的酶的复杂生产过程，这明显限制了其商业利用性以及酶活性的标准化。获得目前用作药物的尿酸酶是通过培养黄曲霉并经提取从培养液中分离酶，然后进行一些纯化步骤。尽管这可能获得高度纯化的尿酸酶，此方法有缺点。黄曲霉由于其生理和遗传而不易操作(WOLOSHUK等.Applied Environ.Microbiol.，55，86-90，1989)，使获得能产生足够量酶的菌株困难。黄曲霉也能产生纯化过程中难以去除的黄曲霉毒素。必须检查纯化的尿酸酶以确保它没有这些毒素。此外，因为曲霉菌(Aspergillus)酶的外源性质，在许多时候由于超敏感性反应的风险治疗限于单剂量。
尽管尿酸酶在美国已被测试，由于过敏反应对此外来蛋白质的高发生率，它不是批准的疗法。尿酸酶的临床使用也受其短循环半衰期的限制。(参见Park等.，Anticancer Res.，1：373-6(1981)。
对尿酸酶的超敏感性和尿酸酶的短循环半衰期可通过共价附着聚乙二醇(PEG)来克服(Chen，R.H.-L.，等.Biochim.Biophys.Acta 660，293-298，1981；Nishimara，H.，Matsushima，A.和Inada，Y.Enzyme，26，49-53，1981；Savoca，K.V.，Davis，F.F.和Palczuk，N.C.Int.Archs.Allegy Appl.Immun.75，58-67，1984：Tsuji，J.-I.，等.Int.J.Immunopharmac.7，725-730，1985)。PEG附着到蛋白质显示大幅降低外来蛋白质的抗原性。例如，配制有聚乙二醇(PEG)的异源蛋白质以降低抗原性，这通过核准Oncaspar(大肠杆菌天冬酰胺酶)被证明。以前的研究人员将PEG(分子量5000)附着于尿酸酶并成功地治疗了少数病人(Davis，S.，Park，Y.K.，Abuchowski，A.和Davis，F.F.Lancet 2，281-283，1981；Chua，C.C.，等.Ann.Intern.Med.109，114-117，1988)。Davis等.(1981)用单剂量PEG-尿酸酶(尿酸酶分离自产朊假丝酵母(？Candida utilis))治疗病人(120 IU/m2表面积，静脉内)。血清尿酸在注射后60分钟内下降到不能检测的水平，且保持不能检测至少32小时。PEG-5,000尿酸酶的血清半衰期是6小时。在其它研究中，天然(不加入聚乙二醇)的尿酸酶的半衰期记录为小于4小时。在任何病人中没有检测到PEG-尿酸酶或天然尿酸酶的沉淀抗体。Davis等注意到PEG-5,000尿酸酶在治疗高尿酸血症中提供了优于天然尿酸酶的潜在主要治疗。Chua，等(1988)用尿酸酶治疗非何杰金淋巴瘤，尿酸酶纯化自PEG-5,000修饰的原玻璃蝇节杆菌(Arthrobacter protoformiae)。病人通过在不同的四天肌肉内注射来治疗。血清尿酸水平在每次剂量后急剧下降。到给药后第26天没有检测到PEG-5,000尿酸酶或天然尿酸酶的抗体。Chua等推断PEG-5,000尿酸酶也许有助于治疗进行性血液恶性肿瘤中的高尿酸血症。
需要更有效尿酸酶的产生和制剂，可克服在治疗上述高尿酸水平病人中与尿酸酶使用相关的缺点。本发明针对这些以及其它重要的目标。
发明的概述
本发明针对上面确定的需要，它提供克服迄今为止所用尿酸酶组合物缺点的尿酸酶制剂。
本发明针对聚乙二醇修饰的尿酸酶。在一个较佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约10,000到约50,000的聚乙二醇修饰，直接或通过生物相容的连接基团。在一个更佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约10,000到约30,000的聚乙二醇修饰。在一个甚至更佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约20,000的聚乙二醇修饰。
发明的另一实施方案针对治疗尿酸相关疾病的方法，包括高尿酸血症、肿瘤崩解综合症和肾结石，此方法包括施用治疗有效量的化合物，化合物含PEG-修饰的尿酸酶。在一个较佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约20,000的聚乙二醇修饰。
在一些实施方案中，本发明提供提高尿酸酶的循环半衰期的方法，包括通过连接基团共价结合所述尿酸酶到聚乙二醇来修饰所述尿酸酶，其中聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约30,000，其中连接基团选自琥珀酰亚胺基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物基团、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团和它们的组合。
在一些实施方案中，本发明提供提高尿酸酶的抗尿酸活性的方法，包括通过连接基团共价结合所述尿酸酶到聚乙二醇来修饰所述尿酸酶，其中聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约30,000，其中连接基团选自琥珀酰亚胺基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团和它们的组合。
在一些实施方案中，本发明提供降低病人中尿酸水平的方法，包括施用治疗有效量的化合物给所述病人，化合物含经连接基团共价结合到聚乙二醇的尿酸酶，其中聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约30,000。在一个较佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约20,000的聚乙二醇修饰。
在一些实施方案中，本发明提供治疗病人中尿酸相关疾病的方法，包括施用治疗有效量的化合物给所述病人，化合物含经连接基团共价结合到聚乙二醇的尿酸酶，其中聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约30,000。在一个较佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约20,000的聚乙二醇修饰。
在一些实施方案中，本发明提供的化合物包含的尿酸酶偶联到聚乙二醇而没有连接基团，其中聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约30,000。在一个较佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约20,000的聚乙二醇修饰。
本发明的这些和其它方面将在下列发明的详细描述中阐明。
发明的详细描述
概述
尿酸酶可在许多微生物中发现且有助于治疗许多人的疾病和紊乱。然而，尿酸酶具有抗原性且迅速从病人的循环中清除。这些问题可通过聚乙二醇(PEG)共价修饰尿酸酶来克服。
本发明的基础是聚乙二醇修饰的尿酸酶在治疗一些类型的疾病和紊乱中提供很好的结果，这些疾病和紊乱与人中尿酸水平增加有关。与天然尿酸酶相比，尿酸酶-PEG保持大部分酶活性、抗原性小很多、循环半衰期大幅延长、治疗疾病和紊乱更有效，包括高尿酸血症和肿瘤崩解综合症。PEG-20,000特别优选，因为它具有优选的酶活性水平、抗原性、循环半衰期、功效和相对容易的生产。
定义
在本发明公开中，使用下列缩写：PEG，聚乙二醇；SS，琥珀酰亚胺基琥珀酸酯；SSA，琥珀酰亚胺基琥珀酰胺；SPA，琥珀酰亚胺基丙酸酯；NHS，N-羟基-琥珀酰亚胺。
聚乙二醇共价修饰的尿酸酶(有或没有连接基团)可在下文中称为“尿酸酶-PEG”、“尿酸氧化酶-PEG”或“PEG-尿酸酶”。
“聚乙二醇”或“PEG”指环氧乙烷缩聚物和水的混合物，分分或直链，由通式H(OCH2CH2)nOH表示，其中n至少为4。“聚乙二醇”或“PEG”与数字后缀结合使用以表示其大约平均分子量。例如，PEG-5,000指总平均分子量约5,000的聚乙二醇；PEG-12,000指总平均分子量约12,000的聚乙二醇；PEG-20,000指总平均分子量约20,000的聚乙二醇。
如本文所用，术语“病人”指动物，优选是哺乳动物，更优选是人。
如本文所用，术语“尿酸相关疾病”指特征为尿酸水平增加的疾病和紊乱。尿酸相关疾病包括但不限于高尿酸血症、肿瘤崩解综合症和肾结石。
如本文所用，术语“约”指值的+/-10％。
如本文所用，术语“生物相容”指材料或化合物一般不损害生物功能和不导致任何程度不能接受的毒性，包括变应原状态和疾病状态。
“循环半衰期”指时间段从注射修饰的尿酸酶到病人后直至尿酸酶量清除到原始峰值血清水平的一半水平。循环半衰期可在任何相关种类中确定，包括人或小鼠。
如本文所用，术语“共价结合”和“偶联”可交换使用并指连接尿酸酶和PEG的共价键，直接或通过接头。
尿酸酶
在本发明中，尿酸酶基因可从任何来源衍生、克隆或产生，包括例如来自微生物或通过重组生物技术或它们的任何组合。例如，尿酸酶可从微生物中克隆，包括但不限于黄曲霉、产朊假丝酵母和原玻璃蝇节杆菌。在一些实施方案中，本发明所用尿酸酶具有附加序列表中列出的氨基酸序列。
尿酸酶也可从大量其它生物中克隆，包括但不限于链霉菌属和杆菌属的细菌；真菌酵母属、裂殖酵母属、翘孢霉属、曲霉属和脉孢菌属(包括酵母)；果蝇(Drosophila)；哺乳动物，包括猪(Sus scrofu)、松鼠猴(Samiri sciureus)、狒狒(Papio)、猕猴(Macaca mulatta)、植物包括鹰嘴豆(Cicer arietinum)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosum)和豌豆(Pisum sativum)。
聚乙二醇
有许多分子量和连接基团不同的可用聚乙二醇。这些PEGs可对蛋白质的抗原性、免疫原性和循环半衰期有不同效果(Zalipsky，S.和Lee，C.《聚乙二醇化学：生物技术和生物医学应用》(Polyethylene Glycol Chemistry：Biotechnical andBiomedical Applications)347-370页，Plenum Press，New York，1992；Monfardini，C.，等.，bioconjugate Chem.6，62-69，1995；Delgado C；Francis GE；Fisher D.“PEG-连接蛋白质的使用和性质”(The uses and properties ofPEG-linked proteins).Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Sys.，9：249-304，1992)
在本发明的一个实施方案中，聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约50,000；更优选从约12,000到约40,000，更优选从约15,000到约30,000；最优选约20,000。一般，分子量30,000或更多的聚乙二醇难以溶解，制成产物的产量大为减少。
聚乙二醇可以是分支或直链，优选直链。增加聚乙二醇分子量一般趋向降低尿酸酶的免疫原性。有本发明所述分子量的聚乙二醇可结合尿酸酶和任选的生物相容连接基团使用，以治疗与尿酸水平提高相关的疾病和紊乱。
加入聚乙二醇(pegylation)
尿酸酶可使用本领域已知方法通过生物相容的连接基团共价结合PEG，，例如Park等，Anticancer Res.，1：373-376(1981)；Zaplipsky和Lee，《聚乙二醇化学：生物技术和生物医学应用》，J.M.Harris编辑.，Plenum Press，NY，21章(1992)，所揭示的全部纳入本文供参考。
用来使PEG共价附着尿酸酶的连接基团可以是任何生物相容的连接基团。如上所讨论，“生物相容”表示化合物或基团是非毒性且可在体外或体内使用而不引起损伤、呕吐、疾病或死亡。PEG可结合连接基团，例如通过醚键、酯键、硫醇键或酰胺键。合适的生物相容的连接基团包括例如酯基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、羧基、羟基、碳水化合物、琥珀酰亚胺基(包括例如琥珀酰亚胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SCM)、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)、环氧基、氧羰基咪唑基(包括例如羰基二咪唑基(CDI))、硝基苯基团(包括例如硝基苯碳酸盐(NPC)或三氯苯碳酸盐(TPC))、trysylate基、醛基、异氰酸基团、乙烯砜基团、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团或伯胺。生物相容的连接基团优选是酯基和/或琥珀酰亚胺基。更优选的是，连接基团是SS、SPA、SCM、SSA或NHS；SS、SPA或NHS更优选，SS或SPA最优选。
在本发明中，最优选的生物相容连接基团的共同特征是它们通过马来酰亚胺基团附着到尿酸酶的伯胺。一旦与尿酸酶偶联，SS-PEG有邻近PEG的酯键，使此位点对血清酯酶敏感，可从体内的尿酸酶中释放PEG。SPA-PEG和PEG2-NHS没有酯键，因此它们对血清酯酶不敏感。
在本发明中，具体连接基团似乎不影响PEG-尿酸酶的循环半衰期或其特异的酶活性。然而，如果使用连接基团，使用生物相容的连接基团是重要的。附着蛋白质的PEG可以是单链，如SS-PEG、SPA-PEG和SC-PEG，或可使用支链PEG，如PEG2-NHS。
另外，尿酸酶可通过氨基、巯基、羟基或羧基直接与PEG偶联(即没有连接基团)。在一个较佳实施方案中，PEG偶联尿酸酶上的赖氨酸残基。
尿酸酶-PEG
PEG附着尿酸酶使尿酸酶的循环半衰期增加。
尿酸酶上PEG单位的数量似乎与酶的循环半衰期相关，而保持酶活性的量似乎与所用PEG的平均分子量相关。
已知尿酸酶上PEG单位的数量增加使该酶的酶活性降低。同样已知一些PEG制剂难以生成和产生相对低数量的产物。因此，为获得有效产物，需要在循环半衰期、抗原性、生成效率和酶活性间达到平衡。
一般，PEG附着尿酸酶的伯胺。如技术人员已知，选择尿酸酶上聚乙二醇的附着位点由蛋白质活性结构域内各位点的作用决定。PEG可附着尿酸酶的伯胺而没有显著损失酶活性。然而如上所讨论，保持酶活性的量似乎与所用PEG的平均分子量相关。例如，克隆自产朊假丝酵母的尿酸酶有约32个赖氨酸，可通过此过程加入聚乙二醇。换句话说，32个赖氨酸是尿酸酶可经生物相容的连接基团附着PEG的所有可能位点，连接基团如SS、SPA、SCM、SSA和/或NHS。考虑到本公开对本领域技术人员显而易见的是，PEG也可附着尿酸酶上的其它位点，或通过连接基团或直接附着一个或更多残基上的基团。
1到约32个PEG分子可在赖氨酸残基共价结合尿酸酶。优选的是，尿酸酶用约5到约30个PEG分子修饰，从约10到约25个PEG分子更优选，从约18到约22个PEG分子更优选且约20个PEG分子最优选。换句话说，尿酸酶中约15％到约95％的伯胺基用PEG修饰，尿酸酶中约55％到约70％的伯胺基用PEG修饰更优选且尿酸酶中约60％的伯胺基用PEG修饰最优选。当PEG共价结合尿酸酶的末端时，优选使用仅1个PEG分子。在一个较佳实施方案中，尿酸酶用PEG-20,000修饰。
尿酸酶可在许多不同位点加入聚乙二醇。在一个较佳实施方案中，尿酸酶在除了一个或更多下列各项外的位点加入聚乙二醇(数字指产朊假丝酵母尿酸酶的氨基酸残基)：Lys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167和Lys262。在一些较佳实施方案中，尿酸酶用约20个PEG-20,000分子加入聚乙二醇。在这样一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys156不加入聚乙二醇。在另一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys167不加入聚乙二醇。在又一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys12不加入聚乙二醇。在另一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys64不加入聚乙二醇。在另外一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys262不加入聚乙二醇。在另一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys64不加入聚乙二醇。在另外一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys262不加入聚乙二醇。在又一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys117不加入聚乙二醇。在另一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys16不加入聚乙二醇。在另外一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys28不加入聚乙二醇。在又一个较佳实施方案中，尿酸酶在Lys72不加入聚乙二醇。在一个更佳的实施方案中，尿酸酶在Lys156和Lys167不加入聚乙二醇。在一个更佳的实施方案中，尿酸酶在Lys156、Lys167、Lys12、Lys64和Lys262不加入聚乙二醇。在一个甚至更佳的实施方案中，尿酸酶在Lys156、Lys167、Lys12、Lys64、Lys262和Lys117不加入聚乙二醇。在一个最佳的实施方案中，尿酸酶在Lys156、Lys167、Lys12、Lys64、Lys262、Lys117、Lys16、Lys28和Lys72不加入聚乙二醇。
如所讨论的，已知酶活性通过酶上PEG单位数量增加而降低。然而，本发明者发现当各自结合相同数量的PEG分子时，结合约20个PEG-20,000分子的尿酸酶的酶活性实际高于尿酸酶-PEG-5,000的酶活性。尿酸酶-PEG-20,000的这种活性增加可使用低于先前可能考虑的剂量治疗。较低剂量的尿酸酶-PEG-20,000提供最小化对尿酸酶-PEG免疫应答的优点，包括减少可能的超敏感性问题、最小化过敏反应、减少施用尿酸酶-PEG患者中的皮疹发生。在小鼠研究中，也显示PEG-20,000比其它PEG制剂更安全，具体是PEG-5,000。
治疗方法
在一些实施方案中，本发明提供降低病人中尿酸水平的方法，包括施用治疗有效量的化合物给所述病人，化合物含经连接基团共价结合聚乙二醇的尿酸酶，其中聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约30,000。在一个较佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约20,000的聚乙二醇修饰。
在一些实施方案中，本发明提供治疗病人中尿酸相关疾病的方法，包括施用治疗有效量的化合物给所述病人，化合物含经连接基团共价结合聚乙二醇的尿酸酶，其中聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约30,000。在一个较佳实施方案中，尿酸酶用总平均分子量约20,000的聚乙二醇修饰。
治疗有效量的本发明化合物是有效减少尿酸水平的量。一般，治疗以小剂量开始，剂量可小幅增加直到获得情况下最佳的效果。一般，治疗剂量的本发明化合物可从一周两次约1到约200mg/kg到每两周一次。例如，剂量可以是一周一次2ml静脉注射约1mg/kg到每3天一次约20mg/kg。尿酸酶-PEG20,000可每天施用几次、一天一次、一周一次或每两周一次。
注射前，PEG-尿酸酶可与磷酸缓冲盐水溶液或任何其它本领域技术人员已知的合适溶液混合。PEG-尿酸酶制剂可如所需要作为亲液体(lyophilate)或液体制剂施用。
本发明方法可包括体外或体内应用。在体外应用的情况中，包括细胞培养应用，本文所述化合物可加入培养的细胞并随后孵育。本发明的化合物也可用于促进单克隆和/或多克隆抗体生产，使用本领域熟知的抗体生产技术。对本领域技术人员显而易见的是，单克隆和/或多克隆抗体可然后用于多种诊断应用。
施用本发明化合物的体内方式取决于预期的应用而不同。本领域技术人员意识到可完成本发明PEG-尿酸酶组合物的施用，例如口腔、鼻内、腹膜内、肠胃外、静脉内、淋巴内、肿瘤内、肌肉内、间质、动脉内、皮下、眼内、滑膜内、经上皮和经皮肤。
实施例
发明进一步在以下例子中证明，用于阐明目的，不想限制本发明的范围。
实施例1：分离产朊假丝酵母尿酸酶编码序列和构建表达质粒
基因组DNA从产朊假丝酵母(ATCC 9950)中分离并用作PCR模板以分离尿酸酶基因。产朊假丝酵母在100mL YPD培养基中30℃×250rpm摇床生长。第二天，来自50mL培养物的细胞通过1500xg室温离心10分钟来沉淀。沉淀重悬浮于15mL SCED缓冲液，pH7.5(1M山梨醇、10mM柠檬酸钠，pH7.5、10mM EDTA、10mM DTT)。3mg LyticasTM(Sigma，St.Louis，MO，目录号L-4025)加入细胞且细胞在37℃培养60分钟。加入15 mL 1％SDS，缓慢混合并置于冰上5分钟。加入6mL 5M乙酸钾，pH8.9并缓慢混合。溶液在4℃以10,000xg离心10分钟。上清转移到干净的离心管中，加入2体积乙醇并室温孵育15分钟。DNA通过在4℃以10,000xg离心20分钟来沉淀。沉淀重悬浮于10mL TE缓冲液，pH7.4(10mM Tris-HCl，pH7.4、1mM EDTA)。溶液用等体积酚∶氯仿(1∶1v/v)温和提取，接着用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)。加入一半体积的7.5M醋酸铵，pH7.5和2体积的乙醇，管置于-70℃ 10分钟。DNA在4℃以10,000xg离心10分钟来沉淀。沉淀在空气中干燥并重悬浮于含50μg RNA酶A的1mL TE缓冲液，pH7.5中。DNA在室温孵育1小时，然后用等体积乙醇再沉淀。DNA在4℃以10,000xg离心10分钟来沉淀。沉淀重悬浮于1mL TE缓冲液，pH7.5。DNA浓度通过测量260nm光密度来确定。
使用PCR从产朊假丝酵母基因组DNA中分离尿酸酶基因。PCR引物具有下列序列：
正向引物，URIUforSna：5’-GTG TAC GTA ATG TCA ACA ACG CTC TCA TCA-3’(SEQ.ID.NO：1)
反向引物，URIUrevH：5’-AGA AAG CTT TTA CCA CTT GGT CTT CTC CTT A-3’(SEQ.ID.NO：2)
这些引物位于编码序列5’-末端的SnaBI位点和3’-末端的HindIII位点用于亚克隆入pQE70(Qiagen，Valencia，CA)以表达。PCR混合物在50μl最终反应体积中含有1X Vent聚合酶缓冲液、2.5mM硫酸镁、0.2mM各dNTPs、30pmole各引物、1.8μg产朊假丝酵母基因组DNA和2.5U Vent聚合酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)。PCR在98℃进行2分钟，接着98℃ 30秒进行30个循环，35℃30秒和72℃60秒。然后加入1单位Taq聚合酶(Gibco，Rockville，MD)且反应在72℃孵育7分钟。20ml的PCR在0.8％琼脂糖凝胶上展开。PCR产物从凝胶中切除并用Qiagen gel extration试剂盒提取。PCR产物亚克隆入pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA)。尿酸酶PCR产物用SnaBI和HindIII从pCR2.1中切除并用琼脂糖凝胶电泳纯化。pQE70用SphI 37℃消化1小时，Klenow片断室温处理15分钟以产生钝端，然后在80℃孵育15分钟以使Klenow酶失活。然后处理的质粒用HindIII在37℃消化1小时，在琼脂糖凝胶上展开并接着从凝胶中纯化。然后尿酸酶片断连接入消化的pQE70中以产生pQE-URIC。大肠杆菌DG101(ATCC 47041)用连接反应转化且转化子在氨卡青霉素存在时选择。筛选转化子用于尿酸酶生成，这是通过在3mL含氨卡青霉素的LB(100mg/mL)中培养细胞直到OD600达到0.5到0.6。异丙基-b-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加至1mM的终浓度且培养物另外孵育2小时。细胞提取物然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并检测凝胶中34,000Da蛋白质的存在。一个发现产生34,000Da蛋白质的转化子被测试且发现具有尿酸酶活性。pQE-URIC从此转化子中分离且将赋予四环素抗性的基因插入质粒。为将赋予四环素抗性的基因插入pQE-URIC，pBR322用EcoRI和AvaI消化，然后用Klenow聚合酶和dNTPs处理以在消化的DNA片断上产生钝端。pQE-URIC用XbaI消化，然后用Klenow聚合酶和dNTPs处理。来自含四环素抗性基因的pBR322的～1400bp片断用凝胶纯化并连接入pQE-URIC中以产生pPHX12。pPHX12序列(SEQ ID NO：3)、pPHX12中发现的尿酸酶编码序列(SEQ IDNO：4)和其翻译的氨基酸序列(SEQ ID 5)和从pPHX12中发现的编码序列推出的尿酸酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)列于附加的序列表中，序列表被纳入供参考。大肠杆菌DG101用pPHX12转化以产生大肠杆菌菌株PHX12，PHX12用于产生和纯化尿酸酶。
实施例2：在大肠杆菌中表达尿酸酶
为生产尿酸酶，PHX12在20L发酵液中生长。大肠杆菌未确定成分培养基#1用于PHX12在Bioflo台式发酵罐(New Brunswick Scientific，Edison，NJ)中生长。大肠杆菌未确定成分培养基#1的成分由基础培养基、50％甘油、100X盐溶液、100X氯化钙溶液和1000X维生素溶液组成。这些成分如下所述制备。
基础培养基
每升培养基
酪蛋白氨基酸                          30g
硫酸铵                                3g
磷酸钾，二碱价                        2.5g
溶解于920mL水中并高压灭菌或通过0.22μm滤器过滤杀菌。
浓缩盐溶液(100X)
硼酸                                  0.57g
硫酸铜(II)五水合物                    0.39g
氯化铁，100g于40mL水中                2.0ml
二氯化锰四水合物                      4.0g
氯化钠5.0g
钼酸钠二水合物                        0.5g
硫酸镁七水合物                        25.0g
硫酸2.87ml
硫酸锌七水合物1.0g
溶解于1L H2O中并高压灭菌或通过0.22μm滤器过滤杀菌。
50％(v/v)甘油
混合1000ml甘油和1000ml H2O并高压灭菌或通过0.22μm滤器过滤杀菌。
维生素溶液(1000X)
盐酸硫胺素                            0.26g
溶解于100mL H2O中并通过0.22μm滤器过滤杀菌。
钙溶液(100X)
氯化钙二水合物                        10g
溶解于1L H2O中并高压灭菌或通过0.22μm滤器过滤杀菌。
对于每升大肠杆菌未确定成分培养基#1，下列各项用无菌方法以下列量加入灭菌的基础培养基：
60ml甘油溶液
10ml浓缩盐溶液
10ml钙溶液
1ml维生素溶液
制备PHX12接种物
融化保存于-70℃的来自工作细胞库(Working Cell Bank)的PHX12小瓶，且内含物无菌转移到500mL带挡板摇瓶内的250mL大肠杆菌未确定成分培养基#1中，培养基#1含12μg/mL四环素。四环素选择仅在摇瓶水平维持。接种的带挡板摇瓶在环境培养箱中37℃ 250rpm培养。摇瓶培养物在无菌转移到BioFlo IV发酵罐前生长13到16小时，发酵罐含20升灭菌培养基。
细胞培养和收集
大肠杆菌未确定成分培养基#1用于PHX12在发酵罐生长。大肠杆菌未确定成分基本培养基制备是通过溶解600g酪蛋白氨基酸、60g硫酸铵和50g磷酸钾二碱价于2L毫微纯(nanopure)水中。发酵罐充满18.4L基本培养基，加入50mL消泡剂B到基本培养基，然后用设定于121℃的发酵罐灭菌循环灭菌30分钟。灭菌后，使培养基冷却到37℃或以下，200mL 100X氯化钙溶液、200mL 100X浓缩盐溶液、20mL 1000X维生素溶液和1200mL 50％甘油无菌加入发酵罐。
发酵罐参数如下：搅拌设定为700rpm，温度设定为37℃，空气流量设定为20Lpm。然后接种物用于接种发酵罐。培养物在发酵罐中生长到光密度(A600nm)约为8。然后IPTG无菌加入发酵罐至终浓度为1mM。加入IPTG后使发酵连续2小时。接着收集细胞并立即用空心纤维过滤器通过渗滤浓缩到2到3L。细胞通过8,000x g离心10分钟沉淀且细胞团转移到塑料贮藏容器并保存于-70℃直到进一步加工。典型的20升发酵液产生0.5到0.6Kg的细胞团。
实施例3：纯化尿酸酶
来自20升发酵液的细胞团重悬浮于0.4L裂解缓冲液(20mM磷酸钠，pH8.5、1mM EDTA)，使用PolytronTM匀浆器以获得均匀悬浮液。以＞15,000psi两次穿过微流化器(microfluidizer)来裂解细胞。然后裂解的细胞悬浮液以13,000xg离心10分钟。硫酸铵加入上清以达到30％的饱和度。悬浮液室温搅拌10分钟，然后13,000xg离心15分钟。硫酸铵加入上清至64％的饱和度且溶液室温搅拌10分钟，接着溶液以13,000xg离心15分钟。沉淀重悬浮于0.4L渗滤缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH8.5)并用50,000MW截断的滤器对5体积渗滤缓冲液渗滤。然后渗滤溶液置于Poros HQ50柱，Poros HQ50柱先前用柱缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH8.5)平衡。柱用柱缓冲液洗涤并收集流过物。然后流过物置于用柱缓冲液平衡的BioRad HA柱。HA柱用10体积柱缓冲液洗涤且尿酸酶通过梯度洗脱，从100％柱缓冲液到100％0.5M磷酸钠，pH8.5。洗脱的尿酸酶再次通过柱缓冲液平衡的Poros HQ柱。收集含尿酸酶的流过部分并保存于4℃。
实施例4：纯化的尿酸酶的鉴定
尿酸酶分析
尿酸酶活性使用Sigma(St.Louis，MO)的尿酸诊断试剂盒分析。此酶的比活性是通过用尿酸孵育酶和监控过氧化氢产生确定的。过氧化氢的产生是通过在过氧化物酶存在时与4-氨基安替比林和3，5-二氯-2-羟基苯磺酸盐反应确定的。醌亚胺染料在520nm最大吸光率形成。产生颜色的强度与形成过氧化氢的量成正比。形成过氧化氢的量是通过与标准比较确定的，标准含已知量的过氧化氢。酶比活性＝分析中nmol产生的过氧化氢/min/mg的蛋白质。酶活性以IU/mL表达。1IU定义为产生1nmol过氧化氢/分钟的酶的量。
SDS-PAGE
尿酸酶的表达水平由SDS-PAGE确定。在IPTG诱导尿酸酶表达前(诱导前样品)和IPTG加入后2小时(诱导后样品)取来自20升发酵培养物的样品(1ml)。这些样品在微离心机(12,000xg 1分钟)中快速离心，然后-70℃冷冻。冷冻的细胞沉淀重悬浮于1ml水并用探测超声波仪超声处理15秒。所得超声处理物在10-20％SDS-PAGE凝胶上在还原条件下电泳。凝胶用考马斯蓝染色。
实施例5：加入聚乙二醇
尿酸酶用PEG-5,000加入聚乙二醇
柱缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH8.5)中的纯化尿酸酶用甲氧基-SS-聚乙二醇MW 5,000加入聚乙二醇，PEG与尿酸酶比例为30∶1(wt/wt)。PEG 5000加入尿酸酶溶液并室温搅拌1小时。结合的尿酸酶-PEG 5000通过渗滤浓缩到约1/10体积，然后对10体积制剂缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH6.8、130mM氯化钠)渗滤。
尿酸酶用PEG-20,000加入聚乙二醇
柱缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH8.5)中的纯化尿酸酶用甲氧基-SS-聚乙二醇MW 20,000加入聚乙二醇，PEG与尿酸酶比例为30∶1(wt/wt)。PEG-20000加入尿酸酶溶液并室温搅拌2小时。结合的尿酸酶-PEG 20000通过渗滤浓缩到约1/10体积，然后对10体积制剂缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液，pH6.8、130mM氯化钠)渗滤。
实施例6：加入聚乙二醇的蛋白质的鉴定
SDS-PAGE
加入聚乙二醇的尿酸酶的纯度和加入聚乙二醇的程度由SDS-PAGE检测。来自加入聚乙二醇反应的样品在10-20％SDS-PAGE凝胶上在还原条件下电泳。凝胶用考马斯蓝染色。
尿酸酶分析
加入聚乙二醇的尿酸酶的酶活性用实施例4中所述尿酸酶分析来确定。酶比活性分析中＝nmol产生的过氧化氢/min/mg的蛋白质。酶活性以IU/mL表达。1IU定义为产生1nmol过氧化氢/分钟的酶的量。
PEG数量
三硝基苯磺酸(TNBS)分析(Habeeb，A.F.S.A.Analyt.Biochem.14，328-336(1966))用于确定聚乙二醇分子的平均数量，聚乙二醇分子共价附着各尿酸酶蛋白质中的伯胺(PEG数量)。TNBS与伯胺基反应且导致颜色变化。加入聚乙二醇的蛋白质与未加入聚乙二醇的蛋白质相比。
各蛋白质样品在三个不同蛋白质浓度分析。各浓度重复两次分析。各样品的蛋白质浓度用毫微纯水调节至0.2、0.4和0.8mg/mL并涡动3到5秒。0.25mL的各蛋白质样品加入10×75mm玻璃管.0.25ml 4％碳酸氢钠加入各管，接着加入0.25mL0.1％TNBS。管在40℃孵育2小时。然后管从加热块中取出且0.25mL 10％十二烷基硫酸钠(SDS)加入各管，接着加入0.125mL 1N HCl。各反应的吸光率在335nm测量。绘出蛋白质样品的吸光率并进行线性回归以确定线的斜率。加入聚乙二醇的伯胺残基的数量由下列公式确定：
加入聚乙二醇的伯胺残基的数量＝1-(加入聚乙二醇的蛋白质的斜率/未加入聚乙二醇的蛋白质的斜率)×蛋白质中伯胺残基的总数量
表1.比较天然尿酸酶和尿酸酶-PEG制剂
  天然尿酸酶   尿酸酶-PEG 5   尿酸酶-PEG 20方法B
    纯度     ＞98％     ＞98％     ＞98％
    比活性     10.4IU/mg     5.8IU/mg     7.8IU/mg
    循环半衰期     ～4小时     6小时     3天
    PEG数量     不可应用     19     19
比较不同尿酸酶PEG制剂(表1)显示尿酸酶-PEG-20,000保持高于尿酸酶-PEG-50,000的比活性，尽管相同平均数量的PEG分子附着蛋白质。尿酸酶-PEG-20,000保持75％天然酶的比活性，而尿酸酶-PEG-5,000仅保持56％天然酶活性。这意味着可使用比尿酸酶-PEG 5,000所需更少的尿酸酶-PEG 20,000以产生特定的酶活性。然而，当大于20,000的PEGs共价结合尿酸酶时，相对于PEG-20,000的尿酸酶-PEG的酶活性未能增加。
此外，共价结合尿酸酶的PEG平均分子量也在确定循环半衰期和产量中发挥重要作用。尿酸酶-PEG的产量随着结合的聚乙二醇平均分子量增加而上升，PEGs平均分子量增加至PEG-20,000。然而，当使用平均分子量超过20,000的PEG时，尿酸酶-PEG的产量显著降低。例如，当尿酸酶结合PEG-20,000时，相对产量为1.0。当尿酸酶结合PEG-5,000时，相对产量约为0.5。当尿酸酶结合PEG-10,000时，相对产量约为0.66。当尿酸酶结合PEG-40,000时，相对产量下降到约0.1。
实施例9：应用于人
结合尿酸酶的PEG的循环半衰期比小鼠中相同制剂长5到10倍。这意味着过去人剂量通常为小鼠中所用的1/5到1/10。因此，人中PEG-尿酸酶的循环半衰期循环应比小鼠长。
本文所述各专利、专利应用和出版物全部纳入本文供参考。
考虑到前面描述，除了本文所述，发明的不同修饰对于本领域技术人员是显而易见的。这种修饰也属于附加的权利要求范围内。
                           序列表
<110>菲尼克斯药物股份有限公司(Phoenix Pharmacologics，Inc.)
<120>PEG修饰的尿酸酶
<130>PHOE-0190(UWWK-0062)
<150>PCT/US02/13265
<151>2002-04-26
<150>US 09/921,380
<151>2001-08-02
<160>6
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
gtgtacgtaa tgtcaacaac gctctcatca                                      30
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
agaaagcttt taccacttgg tcttctcctt a                                    31
<210>3
<211>5740
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>质粒
<400>3
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gagaatccaa gctagcttgg cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa     1200
aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc     1260
atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt     1320
tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc acattcttgc     1380
ccgcctgatg aatgctcatc cggaatttcg tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat     1440
atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc     1500
gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt     1560
ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt     1620
cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga     1680
caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct     1740
gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat     1800
gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg     1860
cagttattgg tgcccttaaa cgcctggggt aatgactctc tagcttgagg catcaaataa     1920
aacgaaaggc tcagtcgaaa gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg     1980
ctctcctgag taggacaaat ccgccgctct agaattctca tgtttgacag cttatcatcg     2040
ataagcttta atgcggtagt ttatcacagt taaattgcta acgcagtcag gcaccgtgta     2100
tgaaatctaa caatgcgctc atcgtcatcc tcggcaccgt caccctggat gctgtaggca     2160
taggcttggt tatgccggta ctgccgggcc tcttgcggga tatcgtccat tccgacagca     2220
tcgccagtca ctatggcgtg ctgctagcgc tatatgcgtt gatgcaattt ctatgcgcac     2280
ccgttctcgg agcactgtcc gaccgctttg gccgccgccc agtcctgctc gcttcgctac     2340
ttggagccac tatcgactac gcgatcatgg cgaccacacc cgtcctgtgg atcctctacg     2400
ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg     2460
ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg     2520
gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg     2580
caccattcct tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa     2640
tgcaggagtc gcataaggga gagcgtcgac cgatgccctt gagagccttc aacccagtca     2700
gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc acttatgact gtcttcttta     2760
tcatgcaact cgtaggacag gtgccggcag cgctctgggt cattttcggc gaggaccgct     2820
ttcgctggag cgcgacgatg atcggcctgt cgcttgcggt attcggaatc ttgcacgccc     2880
tcgctcaagc cttcgtcact ggtcccgcca ccaaacgttt cggcgagaag caggccatta     2940
tcgccggcat ggcggccgac gcgctgggct acgtcttgct ggcgttcgcg acgcgaggct     3000
ggatggcctt ccccattatg attcttctcg cttccggcgg catcgggatg cccgcgttgc     3060
aggccatgct gtccaggcag gtagatgacg accatcaggg acagcttcaa ggatcgctcg     3120
cggctcttac cagcctaact tcgatcactg gaccgctgat cgtcacggcg atttatgccg     3180
cctcggcgag cacatggaac gggttggcat ggattgtagg cgccgcccta taccttgtct     3240
gcctccccgc gttgcgtcgc ggtgcatgga gccgggccac ctcgacctga atggaagccg     3300
gcggcacctc gctaacggat tcaccactcc aagaattgga gccaatcaat tcttgcggag     3360
aactgtgaat gcgcaaacca acccttggca gaacatatcc atcgcgtccg ccatctccag     3420
cagccgcacg cggcgcatct cgctagagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa     3480
acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga     3540
gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga     3600
cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat     3660
tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata     3720
ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tctgtcggct     3780
gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga     3840
taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc     3900
cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg     3960
ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg     4020
aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt     4080
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt     4140
gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg     4200
cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact     4260
ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt     4320
cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct     4380
gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac     4440
cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc     4500
tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg     4560
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta     4620
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca     4680
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagctgc     4740
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc     4800
tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc     4860
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat     4920
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt     4980
tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc     5040
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag     5100
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt     5160
tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac     5220
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg     5280
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat     5340
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc     5400
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc     5460
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa     5520
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg     5580
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg     5640
cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac     5700
ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcac                           5740
<210>4
<211>912
<212>DNA
<213>产朊假丝酵母(Candida utilis)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(909)
<400>4
atg tca aca acg ctc tca tca tcc act tac ggc aag gac aac gtc aag       48
Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys
1               5                   10                  15
ttc ctc aag gtc aag aag gat ccg cag aac cca aag aag cag gag gtt       96
Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val
            20                  25                  30
atg gag gcc acc gtc acg tgt ctg ctt gaa ggt ggg ttc gac acc tcc       144
Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser
        35                  40                  45
tac acg gag gct gac aac tcg tcc atc gtg cca aca gac acc gtg aag        192
Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys
    50                  55                  60
aac acc att ctc gtg ttg gca aag acc acg gag att tgg cca att gag        240
Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu
65                  70                  75                  80
aga ttt gca gcc aag ctg gct acg cac ttt gtt gag aag tac tcg cac        288
Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His
                85                  90                  95
gtc tct ggt gtc tcc gtc aag att gtc cag gac aga tgg gtc aag tac        336
Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr
            100                 105                 110
gcc gtt gat ggc aag cca cac gac cac tct ttt atc cac gaa ggt ggt        384
Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly
        115                 120                 125
gag aag aga atc act gac ctg tac tac aag aga tcc ggt gat tac aag        432
Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys
    130                 135                 140
ctg tca tct gcc atc aag gac ttg acg gtg ctg aag tcc acc ggc tcg        480
Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser
145                 150                 155                 160
atg ttc tac ggc tac aac aag tgt gac ttc acc acc ttg caa cca acc        528
Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr
                165                 170                 175
act gac aga atc ttg tcc acc gac gtc gat gcc acc tgg gtt tgg gat        576
Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp
            180                 185                 190
aac aag aag att ggc act gtc tac gac atc gcc aag gct gca gac aag        624
Asn Lys Lys Ile Gly Thr Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys
        195                 200                 205
ggg atc ttt gac aac gtt tac aac cag gct aga gag atc acc ttg acc        672
Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr
    210                 215                 220
acc ttc gcc ctg gag aac tct cca tct gtg cag gcc acg atg ttc aac       720
Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn
225                 230                 235                 240
atg gct act cag atc ttg gaa aag gca tgc tct gtc tac tcg gtt tca       768
Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser
                245                 250                 255
tac gcc ttg cca aac aag cac tac ttc ctc att gac ttg aaa tgg aaa       816
Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys
            260                 265                 270
ggt ttg gag aac gac aac gag ttg ttc tac cca tct cca cat cca aat       864
Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn
        275                 280                 285
ggt ttg atc aag tgt act gtt gtc cgt aag gag aag acc aag ttg taa       912
Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu
    290                 295                 300
<210>5
<211>303
<212>PRT
<213>产朊假丝酵母(Candida utilis)
<400>5
Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys
1               5                   10                  15
Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val
            20                  25                  30
Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser
        35                  40                  45
Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys
    50                  55                  60
Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His
                85                  90                  95
Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly
        115                 120                 125
Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys
    130                 135                 140
Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser
145                 150                155                  160
Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr
                165                 170                 175
Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp
            180                 185                 190
Asn Lys Lys Ile Gly Thr Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys
        195                 200                 205
Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr
    210                 215                 220
Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn
225                 230                 235                 240
Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser
                245                 250                 255
Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys
            260                 265                 270
Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn
        275                 280                 285
Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu
    290                 295                 300
<210>6
<211>303
<212>PRT
<213>产朊假丝酵母(Candida utilis)
<400>6
Met Ser Thr Thr Leu Ser Ser Ser Thr Tyr Gly Lys Asp Asn Val Lys
1               5                   10                  15
Phe Leu Lys Val Lys Lys Asp Pro Gln Asn Pro Lys Lys Gln Glu Val
            20                  25                  30
Met Glu Ala Thr Val Thr Cys Leu Leu Glu Gly Gly Phe Asp Thr Ser
        35                  40                  45
Tyr Thr Glu Ala Asp Asn Ser Ser Ile Val Pro Thr Asp Thr Val Lys
    50                  55                  60
Asn Thr Ile Leu Val Leu Ala Lys Thr Thr Glu Ile Trp Pro Ile Glu
65                  70                  75                  80
Arg Phe Ala Ala Lys Leu Ala Thr His Phe Val Glu Lys Tyr Ser His
                85                  90                  95
Val Ser Gly Val Ser Val Lys Ile Val Gln Asp Arg Trp Val Lys Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Asp Gly Lys Pro His Asp His Ser Phe Ile His Glu Gly Gly
        115                 120                 125
Glu Lys Arg Ile Thr Asp Leu Tyr Tyr Lys Arg Ser Gly Asp Tyr Lys
    130                 135                 140
Leu Ser Ser Ala Ile Lys Asp Leu Thr Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser
145                 150                 155                 160
Met Phe Tyr Gly Tyr Asn Lys Cys Asp Phe Thr Thr Leu Gln Pro Thr
                165                 170                 175
Thr Asp Arg Ile Leu Ser Thr Asp Val Asp Ala Thr Trp Val Trp Asp
            180                 185                 190
Asn Lys Lys Ile Gly Thr Val Tyr Asp Ile Ala Lys Ala Ala Asp Lys
        195                 200                 205
Gly Ile Phe Asp Asn Val Tyr Asn Gln Ala Arg Glu Ile Thr Leu Thr
    210                 215                 220
Thr Phe Ala Leu Glu Asn Ser Pro Ser Val Gln Ala Thr Met Phe Asn
225                 230                 235                 240
Met Ala Thr Gln Ile Leu Glu Lys Ala Cys Ser Val Tyr Ser Val Ser
                245                 250                 255
Tyr Ala Leu Pro Asn Lys His Tyr Phe Leu Ile Asp Leu Lys Trp Lys
            260                 265                 270
Gly Leu Glu Asn Asp Asn Glu Leu Phe Tyr Pro Ser Pro His Pro Asn
        275                 280                 285
Gly Leu Ile Lys Cys Thr Val Val Arg Lys Glu Lys Thr Lys Leu
    290                 295                 300

Claims (47)

1.一种含经连接基团共价结合聚乙二醇的尿酸酶的化合物，其特征在于，聚乙二醇总平均分子量从约10,000到约30,000，其中连接基团选自琥珀酰亚胺基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团和它们的组合。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述连接基团是琥珀酰亚胺基。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述琥珀酰亚胺基是琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基化物、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基-琥珀酰亚胺或它们的组合。
4.如权利要求3所述的化合物，其特征在于，所述琥珀酰亚胺基是琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯或它们的组合。
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述尿酸酶不源于微生物，微生物选自黄曲霉、产朊假丝酵母、原玻璃蝇节杆菌和它们的组合。
6.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述微生物是黄曲霉。
7.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述微生物是产朊假丝酵母。
8.如权利要求5所述的化合物，其特征在于，所述微生物是原玻璃蝇节杆菌。
9.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇的平均分子量约为20,000。
10.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约10到约25个聚乙二醇分子。
11.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约18到约22个聚乙二醇分子。
12.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约20个聚乙二醇分子。
13.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys156外的残基共价附着尿酸酶。
14.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys167外的残基共价附着尿酸酶。
15.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys12外的残基共价附着尿酸酶。
16.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys64外的残基共价附着尿酸酶。
17.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys262外的残基共价附着尿酸酶。
18.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys117外的残基共价附着尿酸酶。
19.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQID NO：6的Lys16、Lys28和Lys72外的残基共价附着尿酸酶。
20.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167和Lys262外的残基共价附着尿酸酶。
21.如权利要求1或13-20中任一项所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇在一个或更多赖氨酸残基共价附着尿酸酶。
22.一种提高尿酸酶的循环半衰期的方法，包括经连接基团共价结合所述尿酸酶到聚乙二醇来修饰所述尿酸酶，其特征在于，聚乙二醇的总平均分子量从约10,000到约30,000，其中连接基团选自琥珀酰亚胺基、酰胺基、二酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团和它们的组合。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，聚乙二醇的平均分子量约为20,000。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约10到约25个聚乙二醇分子。
25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约18到约22个聚乙二醇分子。
26.一种提高尿酸酶的抗尿酸活性的方法，包括经连接基团共价结合所述尿酸酶到聚乙二醇来修饰所述尿酸酶，其特征在于，聚乙二醇的总平均分子量从约10,000到约30,000，其中连接基团选自琥珀酰亚胺基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、酯基、环氧基、羧基、羟基、碳水化合物、酪氨酸基团、半胱氨酸基团、组氨酸基团和它们的组合。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，聚乙二醇的均分子量约为20,000。
28.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约10到约25个聚乙二醇分子。
29.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约18到约22个聚乙二醇分子。
30.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约20个聚乙二醇分子。
31.一种降低病人中尿酸水平的方法，其特征在于，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1所述化合物给所述病人。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述病人患有低尿酸血症。
33.如权利要求31所述的方法，其特征在于，聚乙二醇的平均分子量约为20,000。
34.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述连接基团是琥珀酰亚胺基。
35.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述琥珀酰亚胺基团是琥珀酰亚胺基琥珀酸酯、琥珀酰亚胺基丙酸酯、琥珀酰亚胺基羧甲基化物、琥珀酰亚胺基琥珀酰胺、N-羟基-琥珀酰亚胺或它们的组合。
36.一种治疗病人中尿酸相关疾病的方法，其特征在于，所述方法包括施用治疗有效量的权利要求1所述化合物给所述病人。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，聚乙二醇的平均分子量约为20,000。
38.如权利要求36所述的方法，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167和Lys262外的残基共价附着尿酸酶。
39.一种含偶联聚乙二醇的尿酸酶的化合物，其特征在于，聚乙二醇的总平均分子量从约10,000到约30,000。
40.如权利要求39所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇的平均分子量约为20,000。
41.如权利要求39所述的化合物，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约10到约25个聚乙二醇分子。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约18到约22个聚乙二醇分子。
43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约20个聚乙二醇分子。
44.如权利要求39所述的方法，其特征在于，聚乙二醇在除了SEQ ID NO：6的Lys12、Lys16、Lys28、Lys64、Lys72、Lys117、Lys156、Lys167和Lys262外的残基偶联尿酸酶。
45.一种提高尿酸酶的抗尿酸活性的方法，包括通过共价结合所述尿酸酶到聚乙二醇来修饰所述尿酸酶，其特征在于，聚乙二醇的总平均分子量从约10,000到约30,000。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述尿酸酶共价结合约20个聚乙二醇分子。
47.如权利要求45所述的化合物，其特征在于，聚乙二醇的平均分子量约为20,000。
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