CN1041535C

CN1041535C - 编码氨甲酰磷酸合成酶ⅱ的核苷酸序列

Info

Publication number: CN1041535C
Application number: CN93121697A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·斯坦利·斯图尔特; 玛丽亚·维加·弗洛里斯; 威廉·詹姆斯·O·沙利文
Original assignee: Unisearch Ltd
Current assignee: Unisearch Ltd
Priority date: 1992-12-03
Filing date: 1993-12-03
Publication date: 1999-01-06
Anticipated expiration: 2013-12-03
Also published as: FI952697A0; AP429A; MY109022A; FI952697A; AP9400607A0; HU9501583D0; IL107845A0; BR9307584A; CN1090327A; HUT71930A; MX9307662A; WO1994012643A1; EP0675958A4; US5849573A; PL309261A1; KR950704495A; EP0675958A1; HU211526A9; NO952175L; NO952175D0

Abstract

本发明提供了编码恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶II的核苷酸序列。氨甲酰磷酸合成酶II催化嘧啶从头生物合成途径的第一步定型和限速步骤。恶性疟原虫仅仅依赖于嘧啶从头生物合成，因为它不能补救嘧啶。而且认为成熟的人血红细胞不需要嘧啶核酸。因此，该酶代表主要的化学治疗位点。本发明涉及编码氨甲酰磷酸合成酶II的序列在重组制备氨甲酰磷酸合成酶II中的用途，还涉及由该序列设计的反义分子、核糖酶及其他基因失活剂。

Description

编码氨甲酰磷酸合成酶Ⅱ的核苷酸序列

本发明涉及编码恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的氨甲酰磷酸合成酶II的核苷酸序列，用重组DNA技术生产该酶的方法，以及该序列和酶在治疗学上的用途。

由于对传统药物具有抗性的人疟原虫、主要是恶性疟原虫的演化，目前迫切需要开发新的治疗疟疾的化学治疗剂。对疫苗进行研究似乎是非常可能的替代方法。但是经过多年研究之后，到目前为止尚未有临床可接受的产品。而与此同时，抗蚊媒介昆虫的杀虫剂效力的下降却在增长。目前，多于三分之二的世界人口—约5亿人—被认为生活在疟区(Miller，1989)。在世界卫生组织(WHO)所列世界10种最流行疾病中它排在第8位(每年感染2亿7千万人口)，在10种最致命疾病中排在第9位，每年夺取2百万以上生命(Cox；1991；Marshall，1991)。尽管主要限于贫困国家，但是目前在美国(Marshall，1991)和澳大利亚(Johnson，1991)都有报道，而且旅行者疟疾病例不断增加(Steffen和Behrens，1992)。

疟原虫、恶性疟原虫及其宿主的比较生物化学研究表明许多代谢途径不同。这些区别之一就是该寄生虫仅仅依赖于嘧啶从头合成，因为它不能补救预先形成的嘧啶(Sherman，1979)。而且认为成熟的人血红细胞不需要嘧啶核苷酸(Gero和O′Sullivan，1990)。主要努力方向是开发嘧啶生物合成途径的抑制剂(Hammond等人，1985；Scott等人，1986；Prapunwattana等人，1988；Queen等人，1990；Krunhkrai等人，1992)，进一步证实该途径作为化学治疗位置的可能性。可以预期目前对关键嘧啶酶的分子生物学研究不仅可以作为更好地理解寄生虫生物化学的有效工具，也可以作为探察寄生虫与哺乳动物酶之间具体差异的有效工具。

谷氨酰胺依赖性氨甲酰磷酸合成酶(CSPII，EC 6.3.5.5)催化真核生物的嘧啶从头生物合成途径的第一步定型和限速步骤(Jones，1980)。而且由于它催化涉及三个催化单元和七种底物及中间体这样一个复杂的反应，从生物化学观点来看它是一种非常值得研究的酶。CPSII与其他嘧啶酶的结构关系随不同生物体而改变，这使其成为进行研究的一个好的主题。

可以从疟疾培养物得到的少量原料阻碍了分离足以进行分析量的纯蛋白质。而其固有的不稳定性更增加了纯化CPS的困难。用P.berghei(一种啮齿动物疟疾)粗提物进行研究显示了具有CPS活性的一种高分子量蛋白，据推测它与ATCase有关(Hill等人，1981)，这种状况也发现于酵母中(Makoff和Radford，1978)。然而，Krungkrai及其同事目前的分析(1990)测定了CPSII和ATCase各自在P.berghai中的活性。尽管到目前的研究为止已经在恶性疟原虫中测得了CPS活性(Reyes等人，1982)，但是未指出其大小，也没有指出其在该途径中与其他酶键合。

CPSII的谷氨酰胺依赖性活性可以分成两步：(1)谷氨酰胺酶(GLNase)反应，使谷氨酰胺(Gln)水解并将氨转移至氨甲酰磷酸合成酶的位点；和(2)合成酶反应，在该反应中从两分子三磷酸腺苷(ATP)、碳酸氢盐和氨合成氨甲酰磷酸。第二种活性涉及三部分反应：(a)碳酸氢盐被ATP活化；(b)活化的羧基磷酸与氨反应形成氨甲酸盐；和(c)氨甲酸盐的ATP依赖性磷酰化作用形成氨甲酰磷酸(Powers和Meister，1978)。因此，在CPSII中有两个主要的区，谷氨酰胺的酰胺转移酶区(GAT)和氨甲酰磷酸合成酶区(CPS)或简单合成酶区。谷氨酰胺酶区(GLNase)是GAT的亚区，而在合成酶区中有两个ATP-结合亚区。

考虑到CPS谷氨酰胺的酰胺转移酶区与其他酰胺转移酶之间的相似性，已经提出这些亚单位由表示GLNase区的共同祖代基因(＝20kDa)趋异进化而产生，而且CPS GAT区(＝42kDa，它包括仅存在于CPS中的推断结构区)的特殊进化一定包括其他序列的融合和/或插入(Werner等人，1985)。已经提出该哺乳动物CPSI基因的GAT可以通过在该祖代基因的5’末端与未知基因的简单基因融合来形成(Nyunoya等人，1985)。

假定各种生物体较大合成酶区的基因进行了祖代激酶基因的基因复制，得到具有相应两半的多肽(Simmer等人，1990)。与大肠杆菌的亚单位结构和酵母的精氨酸特异性CPS不同，有人提出编码GAT和合成酶区的基因进一步融合形成了对高级真核生物嘧啶生物合成具有特异性的单基因。相反，Simmer及其同事(1990)提出精氨酸特异性CPS(象酵母中的cpal和cpa2一样)以及大鼠线粒体CPSI是由嘧啶嵌合体消融而产生的。

本发明人已经分离出了编码恶性疟原虫CPSII酶(pfCPSII)的完整基因，并确定了其特征。本文报道的是包括5’和3’未转译区的CDNA序列。如此，本发明人已经识别了各个谷氨酰胺酶和合成酶区。与酵母、D.discoideum和哺乳动物中的CPSII基因不同，没有证据表明与随后的酶，精氨酸转氨甲酰酶(ATCase)键合。这与Hill等人(1981)有关P.berghei酶的报告形成对照。然而本发明人已经发现了在天然恶性疟原虫基因中的两种大插入物，而这在从前未描述过。

因此，本发明第一方面在于编码恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶II的核酸分子，该核酸分子包括实质上如表1中1-7176、或1-750、或751-1446、或1447-2070、或20713762、或3763-5571、或5572-7173、或1-3360、或2071-6666、或2071-7173所示序列，或功能等同序列。

在本发明优选的具体方案中，该核酸分子包括表1中-1225-7695所示的序列或功能等同序列。

本发明第二方面在于分离的多肽，该多肽包括实质上如表1中1-2391、483-690、691-1254、1858-2391、1-1120、691-2222或691-2391所示的氨基酸序列。

本文所用术语“功能等同序列”是指该核酸序列中包括了少数变化，这种变化因密码简并所引起，而不会导致该序列编码不同的多肽。

本发明第三方面在于生产恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶II的方法，该方法包括在本发明第一方面的核酸序列能够表达的条件下培养用该核酸分子转化的细胞，并回收该表达的氨甲酰磷酸合成酶II。

该细胞可以是细菌或真核细胞。优选细胞的例子包括大肠杆菌、酵母和Dictyosteliumdiscoideum。

正如本领域专业人员所容易理解的，阐明CPSII的核苷酸序列使得产生一系列治疗剂成为可能。这些包括反义核苷酸、核酶以及用其他途径使RNA和DNA序列成为靶向，例如形成三联体。

正如可以从表1中所列序列看出的，该恶性疟原虫CPSII基因包括在其他氨甲酰磷酸合成酶基因中未发现的两个插入序列。第一个插入序列分离出了推断结构区和谷氨酰胺酶区，而第二个插入序列分离出了两个该合成酶亚单位的ATP结合亚区CPSa和CPSb。表1.恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶II基因的核苷酸与推断的氨基酸序列

. . . . . .-1225 GAATTCCTTCAGCCAAAAAAAATGACAACGCAAATTTTAAGAAAAGAAAAACAATCGACT -1166

. . . . . .-1165 CGTCTTTGAATGAGGTTAGAAATTCGATACGTGAAAGGGACTTAAGAAGGCTTAACAGAG -1106

. . . . . .-1105 AAAAGAGTAAAATCTTATAAGCATTTGAAGGAAAAAATAATAAAATAAAAAAATAAAAAG -1046

. . . . . .-1045 ATAAAAAATATTTATATTTGATATGTAGTATATATAATGATTATTCATATTAATAACATA -986

. . . . . .-985 GATAAAAAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTATATTTATTAACAATACATTTAAGTTA -926

. . . . . .-925 TTTTATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATGTTTGTGTGTTCAT -866

. . . . . .-865 TTGTTTATAAAATTACTTGAAATATAAAACTTATTAATATATTTCCAATTAATATGAATA -806

. . . . . .-805 CAATTATTAATATTTTGATGTGTACACATTAATATAGTTTTACACTTCTTATAATAAAAC -746

. . . . . .-745 CATCCTATATATTATACACAATATATAATACTCCCCAATATTGTGGTTCCTATAATTTTA -686

. . . . . .-685 TTTATATATTTATTTATTAATTTATTCATTTATTTATTTTTTTTCTTAGTTTATAAAATA -626

. . . . . .-625 GTAATTCTACTAATTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAAAAAATT -566

. . . . . .-565 TACATATGAAAAATGAACTTGTATATGTAAATTTATAAATATTTTAAACATAAATATAAA -506

. . . . . .-505 TGTATAAAAAAAAAAAAGAAAAATGGGAAAAAATAATATAGATATATATATAAATATATA -446

. . . . . .-445 TATATATATAATTATTGGGGATATTCTCTGAATCATAGGTCTTAAACAGTTTTATTCTTT -386

. . . . . .-385 TAACATCACAAAGTTGTTATTAAAAGTATATATATCTTATTGGTTCCTATATAAAACTAT -326

. . . . . .-325 AGTATTCTATAATATATTCTGTATATTTCATTTTATCATTTGTAAGCAATCCCTATTTAT -266

. . . . . .-265 TATAATTATTATTTTTTTTTTTATAAAAGAGGTATAAAACAGTTTATTCAATTTTTTTCC -206

. . . . . .-205 TAAAGGAGCAACCTTCAGTCAATTTACATTTTCCACCGGTTGGTTGGCACAACATAATGT -146

. . . . . .-145 TACAGCTAAAAAAAGAAAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATATATAT -86

. . . . . .-85 ATATATATATATATACATAATATGTACAATGCTACCATACAAGTATATAAATTTTTCAAC -26

. .-25 ATTGTTGTGATGTTGCATTTTTCTT -1

表1(续)

. . . . . .1 ATGTATATTTCTTTTAAATATAATTTATATATATATATATATATATATATATATATATTT 601 M Y I S F K Y N L Y I Y I Y I Y I Y I F 20

. . . . . .61 GTTCTTATAGATTTTAAAACAGTTGGGAGGTTAATTCTTGAAGATGGTAACGAATTTGTA 12021 V L I D F K T V G R L I L E D G N E F V 40

. . . . . .121 GGGTACAGTGTAGGTTACGAAGGGTGTAAAGGAAATAATAGTATATCATGTCATAAGGAG 18041 G Y S V G Y E G C K G N N S I S C H K E 60

. . . . . .181 TATAGAAATATTATTAATAATGATAATAGCAAGAATAGTAATAATTCATTTTGTAATAAT 24061 Y R N I I N N D N S K N S N N S F C N N 80

. . . . . .241 GAAGAAAACAATTTGAAAGATGATTTATTATATAAAAATAGTCGATTAGAAAATGAAGAT 30081 E E N N L K D D L L Y K N S R L E N E D 100

. . . . . .301 TTTATTGTTACAGGTGAAGTTATATTTAATACAGCTATGGTTGGATATCCTGAAGCTTTA 360101 F I V T G E V I F N T A M V G Y P E A L 120

. . . . . .361 ACGGACCCAAGTTATTTTGGTCAAATATTAGTTTTAACATTTCCTTCTATTGGTAATTAT 420121 T D P S Y F G Q I L V L T F P S I G N Y 140

. . . . . .421 GGTATTGAAAAAGTAAAACATGATGAAACGTTTGGATTAGTACAAAATTTTGAAAGTAAT 480141 G I E K V K H D E T F G L V Q N F E S N 160

. . . . . .481 AAAATTCAAGTACAAGGTTTAGTTATTTGTGAATATTCGAAGCAATCATATCATTACAAT 540161 K I Q V Q G L V I C E Y S K Q S Y H Y N 180

. . . . . .541 TCTTATATTACCTTAAGTGAATGGTTAAAGATTTATAAAATTCCATGTATAGGTGGTATA 600181 S Y I T L S E W L K I Y K I P C I G G I 200

. . . . . .601 GATACAAGAGCCTTAACAAAACTTTTAAGAGAAAAAGGTAGTATGTTAGGTAAAATAGTT 660201 D T R A L T K L L R E K G S M L G K I V 220

. . . . . .661 ATATATAAAAACAGACAACATATTAATAAATTATATAAAGAAATTAATCTTTTTGATCCT 720221 I Y K N R Q H I N K L Y K E I N L F D P 240

. . . . . .721 GGTAATATAGATACTCTAAAATATGTATGTAATCATTTTATACGTGTTATTAAGTTGAAT 780241 G N I D T L K Y V C N H F I R V I K L N 260

表1(续)

. . . . . .781 AATATTACATATAATTATAAAAATAAGGAAGAATTTAATTATACCAATGAAATGATTACT 840261 N I T Y N Y K N K E E F N Y T N E M I I 280

. . . . . .841 AATGATTCTTCAATGGAAGATCATGATAATGAAATTAATGGTAGTATTTCTAATTTTAAT 900281 N D S S M E D H D N E I N G S I S N F N 300

. . . . . .901 AATTGTCCAAGTATCTCTAGTTTTGATAAAAGTGAATGGAAAAATGTTATTAATCATACA 960301 N C P S I S S F D K S E S K N V I N H T 320

. . . . . .961 TTGTTAAGAGATAAAATGAACCTAATAACTTCATCTGAAGAATATCTGAAAGATCTTCAT 1020321 L L R D K M N L I T S S E E Y L K D L H 340

. . . . . .1021 AATTGTAATTTTAGTAATAGTAGTGATAAAAATGATTCTTTTTTTAAGTTATATGGTATA 1080341 N C N F S N S S D K N D S F F K L Y G I 360

. . . . . .1081 TGTGAATATGATAAATATTTAATTGACCTTGAAGAAAATGCTAGCTTTCATTATAATAAT 1140361 C E Y D K Y L I D L E E N A S F H Y N N 380

. . . . . .1141 GTAGATGAATATGGATATTATGATGTTAATAAAAATACAAATATTCTATCTAATAATAAA 1200381 V D E Y G Y Y D V N K N T N I L S N N K 400

. . . . . .1201 ATAGAACAAAACAACAATAACGAAAATAACAAAAATAACAAAAATAACAACAATAACGAG 1260401 I E Q N N N N E N N K N N K N N N N N E 420

. . . . . .1261 GTTGATTATATAAAGAAAGATGAGGATAATAATGTCAATAGTAAGGTCTTTTATAGCCAA 1320421 V D Y I K K D E D N N V N S K V F Y S Q 440

. . . . . .1321 TATAATAATAATGCACAAAATAATGAACATACCGAATTTAATTTAAATAATGATTATTCT 1380441 Y N N N A Q N N E H T E F N L N N D Y S 460

. . . . . .1381 ACTTATATTAGAAAGAAAATGAAAAATGAAGAATTCCTTAATTTGGTAAACAAAAGAAAA 1440461 T Y I R K K M K N E E F L N L V N K R K 480

. . . . . .1441 GTAGACCATAAAGAAAAAATTATTGTTATTGTTGATTGTGGTATTAAAAATAGTATAATC 1500481 V D H K E K I I V I V D C G I K N S I I 500

. . . . . .1501 AAAAATTTAATAAGACACGGTATGGATCTTCCATTAACATATATTATTGTACCTTATTAT 1560501 K N L I R H G M D L P L T Y I I V P Y Y 520

表1(续)

. . . . . .1561 TACAATTTTAATCATATAGATTATGATGCAGTTCTTTTATCTAATGGTCCTGGAGATCCT 1620521 Y N F N H I D Y D A V L L S N G P G D P 540

. . . . . .1621 AAAAAGTGTGATTTCCTTATAAAAAATTTGAAAGATAGTTTAACAAAAAATAAAATTATA 1680541 K K C D F L I K N L K D S L T K N K I I 560

. . . . . .1681 TTTGGTATTTGTTTAGGTAATCAACTATTAGGTATATCATTAGGTTGTGACACATATAAA 1740561 F G I C L G N Q L L G I S L G C D T Y K 580

. . . . . .1741 ATGAAATATGGTAATAGAGGTGTTAATCAACCCGTAATACAATTAGTAGATAATATATGT 1800581 M K Y G N R G V N Q P V I Q L V D N I C 600

. . . . . .1801 TACATTACCTCACAAAATCATGGATACTGTTTAAAGAAAAAATCAATTTTAAAAAGAAAA 1860601 Y I T S Q N H G Y C L K K K S I L K R K 620

. . . . . .1861 GAGCTTGCGATTAGTTATATAAATGCTAATGATAAATCTATAGAAGGTATTTCACATAAA 1920621 E L A I S Y I N A N D K S I E G I S H K 640

. . . . . .1921 AATGGAAGATTTTATAGTGTCCAGTTTCATCCTGAGGGTAATAATGGTCCTGAAGATACA 1980641 N G R F Y S V Q F H P E G N N G P E D T 660

. . . . . .1981 TCATTTTTATTTAAGAATTTTCTTTTAGATATCTTTAATAAGAAAAAACAATATAGAGAA 2040661 S F L F K N F L L D I F N K K K Q Y R E 680

. . . . . .2041 TATTTAGGATATAATATTATTTATATAAAAAAGAAAGTGCTTCTTTTAGGTAGTGGTGGT 2100681 Y L G Y N I I Y I K K K V L L L G S G G 700

. . . . . .2101 TTATGTATAGGACAAGCAGGAGAATTCGATTATTCAGGAACACAAGCAATTAAAAGTTTA 2160701 L C I G Q A G E F D Y S G T Q A I K S L 720

. . . . . .2161 AAAGAATGTGGTATATATGTTATATTAGTTAATGCTAACATAGCAACTGTTCAAACATCA 2220721 K E C G I Y V I L V N P N I A T V Q T S 740

. . . . . .2221 AAAGGTTTGGCAGATAAGGTATACTTTTTACCAGTTAATTGTGAATTTGTAGAAAAAATT 2280741 K G L A D K V Y F L P V N C E F V E K I 760

. . . . . .2281 ATTAAAAAGGAAAAACCTGATTTTATTTTATGTACATTTGGTGGTCAGACAGCTTTAAAT 2340761 I K K E K P D F I L C T F G G Q T A L N 780

表1(续)

. . . . . .2341 TGTGCTTTAATGTTAGATCAAAAAAAAGTATTGAAAAAGAATAATTGTCAATGTTTAGGT 2400781 C A L M L D Q K K V L K K N N C Q C L G 800

. . . . . .2401 ACATCTTTAGAATCTATAAGAATAACAGAAAATAGAACATTATTTGCTGAAAAATTAAAA 2460801 T S L E S I R I T E N R T L F A E K L K 820

. . . . . .2461 GAAATTAATGAAAGAATAGCTCCATATGGTAGTGCAAAAAATGTTAATCAAGCTATTGAT 2520821 E I N E K I A P Y G S A K N V N Q A I D 840

. . . . . .2521 ATAGGTAATAAAATAGGATATCCAATATTAGTACGTACAACATTTTCGTTAGGAGGATTA 2580841 I A N K I G Y P I L V R T T F S L G G L 860

. . . . . .2581 AATAGTAGTTTCATAAATAATGAAGAAGAACTTATCGAAAAATGTAATAAAATATTTTTA 2640861 N S S F I N N E E E L I E K C N K I F L 880

. . . . . .2641 CAAACTGATAATGAAATATTTATAGATAAATCATTACAAGGATGGAAAGAAATAGAATAT 2700881 Q T D N E I F I D K S L Q G W K E I E Y 900

. . . . . .2701 GAATTATTAAGAGATAATAAAAATAATTGTATAGCTATATGTAATATGGAAAATATAGAT 2760901 E L L R D N K N N C I A I C N M E N I D 920

. . . . . .2761 CCATTAGGTATACATACAGGAGATAGTATAGTTGTTGCACCTTCACAAACATTAAGTAAT 2820921 P L G I H T G D S I V V A P S Q T L S N 940

. . . . . .2821 TATGAATATTATAAATTTAGAGAAATAGCATTAAAGGTAATTAGACATTTAAATATTATA 2880941 Y E Y Y K F R E I A L K V I T H L N I I 960

. . . . . .2881 GGAGAATGTAATATACAATTTGGTATAAATCCACAAACAGGAGAATATTGTATTATTGAA 2940961 G E C N I Q F G I N P Q T G E Y C I I E 980

. . . . . .2941 GTTAATGCTAGGCTTAGTAGAAGTTCAGCATTAGCTTCTAAAGCTACTGGTTATCCACTT 3000981 V N A R L S R S S A L A S K A T G Y P L 1000

. . . . . .3001 GCTTATATATCAGCAAAAATAGCCTTGGGATATGATTTGATAAGTTTAAAAAATAGCATA 30601001 A Y I S A K I A L G Y D L I S L K N S I 1020

. . . . . .3061 ACTAAAAAAACAACTGCCTGTTTTGAACCCTCTCTAGATTACATTACAACAAAAATACCA 31201021 T K K T T A C F E P S L D Y I T T K I P 1040

表1(续)

. . . . . .3121 CGATGGGATTTAAATAAATTTGAGTTTGCTTCTAATACAATGAATAGTAGTATGAAAAGT 31801041 R W D L N K F E F A S N T M N S S M K S 1060

. . . . . .3181 GTAGGAGAAGTTATGTCTATAGGTAGAACCTTTGAAGAATCTATACAAAAATCTTTAAGA 32401061 V G E V M S I G R T F E E S I Q K S L R 1080

. . . . . .3241 TGTATTGATGATAATTATTTAGGATTTAGTAATACGTATTGTATAGATTGGGATGAAAAG 33001081 C I D D N Y L G F S N T Y C I D W D E K 1100

. . . . . .3301 AAAATTATTGAAGAATTAAAAAATCCATCACCAAAAAGAATTGATGCTATACATCAAGCT 33601101 K I I E E L K N P S P K R I D A I H Q A 1120

. . . . . .3361 TTCCATTTAAATATGCCTATGGATAAAATACATGAGCTGACACATATTGATTATTGGTTC 34201121 F H L N M P M D K I H E L T H I D Y W F 1140

. . . . . .3421 TTACATAAATTTTATAATATATATAATTTACAAAATAAGTTGAAAACGTTAAAATTAGAG 34801141 L H K F Y N I Y N L Q N K L K T L K L E 1160

. . . . . .3481 CAATTATCTTTTAATGATTTGAAGTATTTTAAGAAGCATGGTTTTAGTGATAAGCAAATA 35401161 Q L S F N D L K Y F K K H G F S D K Q I 1180

. . . . . .3541 GCTCACTACTTATCCTTCAACACAAGCGATAATAATAATAATAATAATAATATTAGCTCA 36001181 A H Y L S F N T S D N N N N N N N I S S 1200

. . . . . .3601 TGTAGGGTTACAGAAAATGATGTTATGAAATATAGAGAAAAGCTAGGATTATTTCCACAT 36601201 C R V T E N D V M K Y R E K L G L F P H 1220

. . . . . .3661 ATTAAAGTTATTGATACCTTATCAGCCGAATTTCCGGCTTTAACTAATTATTTATATTTA 37201221 I K V I D T L S A E F P A L T N Y L Y L 1240

. . . . . .3721 ACTTATCAAGGTCAAGAACATGATGTTCTCCCATTAAATATGAAAAGGAAAAAGATATGC 37801241 T Y Q G Q E H D V L P L N M K R K K I C 1260

. . . . . .3781 ACGCTTAATAATAAACGAAATGCAAATAAGAAAAAAGTCCATGTCAAGAACCACTTATAT 38401261 T L N N K R N A N K K K V H V K N H L Y 1280

. . . . . .3841 AATGAAGTAGTTGATGATAAGGATACACAATTACACAAAGAAAATAATAATAATAATAAT 39001281 N E V V D D K D T Q L H K E N N N N N N 1300

表1(续)

. . . . . .3901 ATGAATTCTGGAAATGTAGAAAATAAATGTAAATTGAATAAAGAATCCTATGGGTATAAT 39601301 M N S G N V E N K C K L N K E S Y G Y N 1320

. . . . . .3961 AATTCTTCTAATTGTATCAATACAAATAATATTAATATAGAAAATAATATTTGTCATGAT 40201321 N S S N C I N T N N I N I E N N I C H D 1340

. . . . . .4021 ATATCTATAAACAAAAATATAAAAGTTACAATAAACAATTCCAATAATTCTATATCGAAT 40801341 I S I N K N I K V T I N N S N N S I S N 1360

. . . . . .4081 AATGAAAATGTTGAAACAAACTTAAATTGTGTATCTGAAAGGGCCGGTAGCCATCATATA 41401361 N E N V E T N L N C V S E R A G S H H I 1380

. . . . . .4141 TATGGTAAAGAAGAAAAGAGTATAGGATCTGATGATACAAATATTTTAAGTGCACAAAAT 42001381 Y G K E E K S I G S D D T N I L S A Q N 1400

. . . . . .4201 TCAAATAATAACTTTTCATGTAATAATGAGAATATGAATAAAGCAAACGTTGATGTTAAT 42601401 S N N N F S C N N E N M N K A N V D V N 1420

. . . . . .4261 GTACTAGAAAATGATACGAAAAAACGAGAAGATATAAATACTACAACAGTATTTATGGAA 43201421 V L E N D T K K R E D I N T T T V F M E 1440

. . . . . .4321 GGTCAAAATAGTGTTATTAATAATAAGAATAAAGAGAATAGTTCTTTATTGAAAGGTGAT 43801441 G Q N S V I N N K N K E N S S L L K G D 1460

. . . . . .4381 GAAGAAGATATTGTGATGGTAAATTTAAAAAAGGAAAATAATTATAATAGTGTAATTAAT 44401461 E E D I V M V N L K K E N N Y N S V I N 1480

. . . . . .4441 AATGTAGATTGTAGGAAAAAGGATATGGATGGAAAAAATATAAATGATGAATGTAAAACA 45001481 N V D C R K K D M D G K N I N D E C K T 1500

. . . . . .4501 TATAAGAAAAATAAATATAAAGATATGGGATTAAATAATAATATAGTAGATGAGTTATCC 45601501 Y K K N K Y K D M G L N N N I V D E L S 1520

. . . . . .4561 AATGGAACATCACATTCAACTAATGATCATTTATATTTAGATAATTTTAATACATCAGAT 46201521 N G T S H S T N D H L Y L D N F N T S D 1540

. . . . . .4621 GAAGAAATAGGGAATAATAAAAATATGGATATGTATTTATCTAAGGAAAAAAGTATATCT 46801541 E E I G N N K N M D M Y L S K E K S I S 1560

表1(续)

. . . . . .4681 AATAAAAACCCTGGTAATTCTTATTATGTTGTAGATTCCGTATATAATAATGAATACAAA 47401561 N K N P G N S Y Y V V D S V Y N N E Y K 1580

. . . . . .4741 ATTAATAAGATGAAAGAGTTAATAGATAACCAAAATTTAAATGATGAATATAATAATAAT 48001581 I N K M K E L I D N E N L N D E Y N N N 1600

. . . . . .4801 GTTAATATGAATTGTTCTAATTATAATAATGCTAGTGCATTTGTAAATGGAAAGGATAGA 48601601 V N M N C S N Y N N A S A F V N G K D R 1620

. . . . . .4861 AATGATAATTTAGAAAATGATTGTATTGAAAAAAATATGGATCATACATACAAACATTAT 49201621 N D N L E N D C I E K N M D H T Y K H Y 1640

. . . . . .4921 AATCGTTTAAACAATCGTAGAAGTACAAATGAGAGGATGATGCTTATGGTAAACAATGAA 49801641 N R L N N R R S T N E R M M L M V N N E 1660

. . . . . .4981 AAAGAGAGCAATCATGAGAAGGGCCATAGAAGAAATGGTTTAAATAAAAAAAATAAAGAA 50401661 K E S N H E K G H R R N G L N K K N K E 1680

. . . . . .5041 AAAAATATGGAAAAAAATAAGGGAAAAAATAAAGACAAAAAGAATTATCATTATGTTAAT 51001681 K N M E K N K G K N K D K K N Y H Y V N 1700

. . . . . .5101 CATAAAAGGAATAATGAATATAATAGTAACAATATTGAATCGAAGTTTAATAATTATGTT 51601701 H K R N N E Y N S N N I E S K F N N Y V 1720

. . . . . .5161 GATGATATAAATAAAAAAGAATATTATGAAGATGAAAATGATATATATTATTTTACACAT 52201721 D D I N K K E Y Y E D E N D I Y Y F T H 1740

. . . . . .5221 TCGTCACAAGGTAACAATGACGATTTAAGTAATGATAATTATTTAAGTAGTGAAGAATTG 52801741 S S Q G N N D D L S N D N Y L S S E E L 1760

. . . . . .5281 AATACTGATGAGTATGATGATGATTATTATTATGATGAAGATGAAGAAGATGACTATGAC 53401761 N T D E Y D D D Y Y Y D E D E E D D Y D 1780

. . . . . .5341 GATGATAATGATGATGATGATGATGATGATGATGATGGGGAGGATGAGGAGGATAATGAT 54001781 D D N D D D D D D D D D G E D E E D N D 1800

. . . . . .5401 TATTATAATGATGATGGTTATGATAGCTATAATTCTTTATCATCTTCAAGAATATCAGAT 54601801 Y Y N D D G Y D S Y N S L S S S R I S D 1820

表1(续)

. . . . . .5461 GTATCATCTGTTATATATTCAGGGAACGAAAATATATTTAATGAAAAATATAATGATATA 55201821 V S S V I Y S G N E N I F N E K Y N D I 1840

. . . . . .5521 GGTTTTAAAATAATCGATAATAGGAATGAAAAAGAGAAAGAGAAAAAGAAATGTTTTATT 55801841 G F K I I D N R N E K E K E K K K C F I 1860

. . . . . .5581 GTATTAGGTTGTGGTTGTTATCGTATTGGTAGTTCTGTAGAATTTGATTGGAGTGCTATA 56401861 V L G C G C Y R I G S S V E F D W S A I 1880

. . . . . .5641 CATTGTGTAAAGACCATAAGAAAATTAAACCATAAAGCTATATTAATAAATTGTAACCCA 57001881 H C V K T I R K L N H K A I L I N C N P 1900

. . . . . .5701 GAAACTGTAAGTACAGATTATGATGAAAGTGATCGTCTATATTTTGATGAAATAACAACA 57601901 E T V S T D Y D E S D R L Y F D E I T T 1920

. . . . . .5761 GAAGTTATAAAATTTATATATAACTTTGAAAATAGTAATGGTGTGATTATAGCTTTTGGT 58201921 E V I K F I Y N F E N S N G V I I A F G 1940

. . . . . .5821 GGACAAACATCAAATAATTTAGTATTTAGTTTATATAAAAATAATGTAAATATATTAGGA 58801941 G Q T S N N L V F S L Y K N N V N I L G 1960

. . . . . .5881 TCAGTGCACAAAGTGTTGATTGTTGTGAAAATAGGAATAAATTTTCGCACTTATGTGATT 59401961 S V H K V L I V V K I G I N F R T Y V I 1980

. . . . . .5941 CTTAAAATTGATCAACCGAAATGGAATAAATTTACAAAATTATCCAAGGCTATACAATTT 60001981 L K I D Q P K W N K F T K L S K A I Q F 2000

. . . . . .6001 GCTAATGAGGTAAAATTTCCTGTATTAGTAAGACCATCGTATGTATTATCTGGTGCAGCT 60602001 A N E V K F P V L V R P S Y V L S G A A 2020

. . . . . .6061 ATGAGAGTTGTAAATTGTTTTGAAGAATTAAAAAACTTTTTAATGAAGGCAGCTATTGTT 61202021 M R V V N C F E E L K N F L M K A A I V 2040

. . . . . .6121 AGTAAAGATAATCCTGTTGTAATATCAAAATTTATTGAGAATGCTAAAGAAATAGAAATA 61802041 S K D N P V V I S K F I E N A K E I E I 2060

. . . . . .6181 GATTGTGTTAGTAAAAATGGTAAAATAATTAATTATGCTATATCTGAACATGTTGAAAAT 62402061 D C V S K N G K I I N Y A I S E H V E N 2080

表1(续)

. . . . . .6241 GCTGGTGTACATTCAGGTGATGCAACATTAATATTACCTGCACAAAATATATATGTTGAA 63002081 A G V H S G D A T L I L P A Q N I Y V E 2100

. . . . . .6301 ACACATAGGAAAATAAAGAAAATATCCGAAAAGATTTCAAAATCATTAAATATATCTGGT 63602101 T H R K I K K I S E K I S K S L N I S G 2120

. . . . . .6361 CCATTTAATATACAATTTATATGTCATCAAAATGAAATAAAAATTATTGAATGTAATTTA 64202121 P F N I Q F I C H Q N E I K I I E C N L 2140

. . . . . .6421 AGAGCATCTAGAACTTTTCCATTTATATCAAAAGCTCTAAATCTAAACTTTATAGATTTA 64802141 R A S R T F P F I S K A L N L N F I D L 2160

. . . . . .6481 GCTACAAGGATATTAATGGGTTATGACGTCAAACCAATTAATATATCATTAATTGATTTA 65402161 A T R I L M G Y D V K P I N T S L I D L 2180

. . . . . .6541 GAATAIACAGCTGTAAAAGCACCGATTTTCTCATTTAATAGATTACATGGATCAGATTG 66002181 E Y T A V K A P I F S F N R L H G S D C 2200

. . . . . .6601 ATACTAGGTGTAGAAATGAAATCTACAGGTGAAGTAGCATGTTTTGGTTTAAATAAATAT 66602201 I L G V E M K S T G E V A C F G L N K Y 2220

. . . . . .6661 GAAGCTTTATTAAAATCATTAATAGCTACAGGTATGAAGTTACCCAAAAAATCAATACTT 67202221 E A L L K S L I A T G M K L P K K S I L 2240

. . . . . .6721 ATAAGTATTAAAAATTTAAATAATAAATTAGCTTTTGAAGAACCGTTCCAATTATTATTT 67802241 I S I K N L N N K L A F E E P F Q L L F 2260

. . . . . .6781 TTAATGGGATTTACAATATATGCGACTGAAGGTACGTATGATTTCTACTCTAAATTTTTA 68402261 L M G F T I Y A T E G T Y D F Y S K F L 2280

. . . . . .6841 GAATCTTTTAATGTTAATAAAGGTTCTAAATTTCATCAAAGACTTATTAAAGTTCATAAT 69002281 E S F N V N K G S K F H Q R L I K V H N 2300

. . . . . .6901 AAAAATGCAGAAAATATATCACCAAATACAACAGATTTAATTATGAATCATAAAGTTGAA 69602301 K N A E N I S P N T T D L I M N H K V E 2320

. . . . . .6961 ATGGTTATTAATATAACTGATACATTAAAAACAAAGGTTAGTTCAAATGGTTATAAAATT 70202321 M V I N I T D T L K T K V S S N G Y K I 2340

表1(续)

. . . . . .7021 AGAAGATTAGCATCAGATTTCCAGGTTCCTTTAATAACTAATATGAAACTTTGTTCTCTT 70802341 R R L A S D F Q V P L I T N M K L G S L 2360

. . . . . .7081 TTTATTGACTCATTATATAGAAAATTCTCAAGACAAAAGGAAAGAAAATCATTCTATACC 71402361 F I D S L Y R K F S R Q K E R K S F Y T 2380

. . .7141 ATAAAGAGTTATGACGAATATATAAGTTTGGTATAA 71762381 I K S Y D E Y I S L V * 2392

. . . . . .7177 GCAAGAAATTATTCAATAAATTCGATTTAACATTACTTATTTATGTATTTATTAACTTTC 7236

. . . . . .7237 ATTCCATAACAACATGAAAAGTATAAATATATAAATAGTAATATATAATATATAATATAT 7296

. . . . . .7297 ATATATATATATATATATATATTTATTTATTTAATTATATTTACGTTTAAATATTAATAA 7356

. . . . . .7357 ATGTTTTTATTAAATATGATCATTAATTTATATTGATTTATTTTTTTATAAATTTTTGTT 7416

. . . . . .7417 ATATATACAAATTTTATTTATTCACTCATATGTATAAACCAAAATGGTTTTTTCAATTTA 7476

. . . . . .7477 CAAATAATTTTATAATTTTAATAAATTTATTAATTATAAAAAAAATAAAAATATATAAAC 7536

. . . . . .7537 ATTAAAATGTATAAATTCTTTTAATTATATAATAATTTATAAATGTTATGATTTTTTTAA 7596

. . . . . .7597 AAAATTCAACGAAAAAAAAGAGGAACTGTATATACAAAAGGGACTATATATATGTATATA 7656

. . .7657 TATATATATATATATATGTTTTTTTTTCCTTATTCTAGA 7695

GAT区由两个亚区组成：推断的结构区(1-750)和谷氨酰胺酶区(1447-2070)。这两个亚区被第一个插入序列(751-1446，有下划线的)分开。合成酶亚单位的两个ATP结合亚区CPSa(2071-3762)和CPSb(5572-7173)被第二个插入序列(3763-5571，有下划线的)分开。

由于在其他氨甲酰磷酸合成酶基因中未发现这些插入序列，因此它们代表治疗的主要目标，包括但不限于反义核苷酸、核酶和形成核苷酸的三联体，因为降低了与基因宿主同源染色体进行有害反应的可能性。

已知反义RNA分子适用于调节细胞内的基因表达。与部分CPSII互补的反义RNA分子可以从CPSII序列产生。这些反义分子可以用作检测是否细胞中存在CPSII基因的诊断探针，也可以用作调节CPSII基因表达的治疗剂。用CPSII序列制备的反义核苷酸包括与CPSII m RNA互补并能干扰其体内功能的核苷酸和含有恰好能在活细胞内转录以产生反义核苷酸的CPSII序列成分的基因。该基因可以包括细胞、病毒、病原体信使m RNA(聚合酶II)或结构RNA基因(聚合酶I和III)的启动子成分或合成启动子成分。在“基因调节：反义RNA和DNA的生物学”(R.P.Erickson和J.G.Izant，Raven Press 1992)中回顾了反义设计。还可参见US5208149，其中包括有关反义核苷酸设计的更多例子。这些参考文献的说明书均引入本文作为参考。

本文所用术语“核苷酸”包括但不限于所有天然产生的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸以及任何核苷酸类似物的寡聚物。核苷酸类似物包括所有能与另一个核苷酸形成序列特异性复合物(例如双链核酸分子或异源双链核酸分子)的化合物(包括甲基膦酸类或硫代磷酸类)，而且它可以具有有利的扩散或稳定性质。该核苷酸的定义包括通过磷酸二酯键、肽键或任何其他共价键连接的天然碱基或类似碱基。这些核苷酸可以通过在活细胞中活体内的任何结合来合成、体外酶促合成或化学合成。

适用于调节CPSII基因表达的核酶包括具有专一性和催化区的CPSII序列以促使CPSIIm RNA体外或体内分裂的核苷酸。该催化区包括锤头、发夹、δ-病毒成分、核糖体RNA基因内区及其衍生物。有关核酶设计的更多资料可见于下列文献：Haseloff，J.& Gerlach，W.L.(1988)Nature334，585；Kruger，K，Grabowski，P.J，Zaug，A.J，Sands，J，Gottschling，D.E.& Cech，T.R(1982)Cell 31，147；国际专利申请WO 88/04300，US4987071和US5254678。这些参考文献的说明书均引入本文作为参考。该催化成分可以增强通过促进降解或一些其他机理进行的CPSII靶mRNA的人工调节。

三螺旋寡核苷酸可以用于抑制从基因组转录。本文对CPSII基因提出的给定序列将能够设计寡核苷酸，它们将形成三联体，因而抑制CPSII基因的转录。有关适用于三联体形成的寡核苷酸产生的资料可见于Griffin等人的Science 245：967_971(1989)，该参考文献的说明书引入本文作为参考。

三联体剂包括所有能够通过与DNA或染色质形成复合物与CPSII基因结合的核苷酸。该相互反应可以实现三链Hoogsteen结构的形成或其他机理，例如依赖于CPSII序列信息的链侵入。

因此，本发明第四方面在于能够分裂氨甲酰磷酸合成酶II mRNA的核酶，该核酶包括从本发明第一方面的核酸分子得到的mRNA部分互补的序列。

在本发明此方面优选的具体方案中，该核酶包括从本发明第一方面的核酸分子的第一或第二种插入序列得到的mRNA部分互补的序列。

本发明的第五方面在于能够阻碍本发明第一方面的核酸分子表达的反义寡核苷酸。

如上所述，本发明一方面涉及通过重组技术生产CPSII的方法。通过该方法产生的蛋白质和本发明的多肽适用于尝试体外药物结合研究，以开发其他的抗疟疗法。

为了更清楚地理解本发明的性质，将参照下列实施例和图对克隆恶性疟原虫CPSII基因的方法进行说明。实施例

筛选基因(其中的氨基酸序列先前未检测出)的常规方法是通过异源探测，即使用密切相关生物体目的酶的基因片段。这已经被7位工作者用恶性疟原虫证明是不成功的，主要是因为其基因组的高A-T含量。经过用酵母ura2基因片段分离恶性疟原虫CPSII基因的最初无效尝试之后(Souciet等人，1989)，本发明人选择了用聚合酶链反应(PCR)(Saiki等人，1988)放大部分CPSII基因，以使用放大的产物作为筛选用探针。

本发明人使用从保存的CPS基因的氨基端GAT区和第一半合成酶区序列设计的寡核苷酸分离并克隆了PCR产物。核苷酸测序证实已经得到了部分CPSII基因。用限制性酶使全部寄生虫DNA分裂，并用CPSII特异性基因探针进行Southern分析。测定与基因探针杂交的DNA片段大小，然后用相应带的DNA构建“小文库”。用这种方法筛选pfCPSII基因的较小克隆群。

为了分离全长pfCPSII基因，使用已知序列的不同片段构建一系列小文库，以使用“基因巡察”获得该基因5’和3’末端的未知侧面区信息。所使用的策略总结于图1中。

在首先的Southern分析中，用Hind III和EcoRI消化全部恶性疟原虫DNA，并用pfCPS II 453bp PCR产物进行杂交。3.0kb HindIII和较小的EcoRI片段与该探针进行杂交。随后筛选Hind III pTZ18U小基因库导致含有3.0kb pfCPSII基因片段CPS2的重组体分离。将453bp PCR产物定位于该片段的中间。

用CPS2的5’和3’末端的两个区分离每端邻近的序列，以得到更多的基因序列。CPS2的5’端Hind III/EcoRI片段是分离进一步的1.5kb片段CPS1的工具，该CPS1由基因的全部5’区和一些非编码序列组成。

借助于CPS2 3’端的已知序列，得到550b p逆PCR(IPCR；Triglia等人，1988)产物。

该IPCR产物用于筛选3’区侧CPS2。通过小文库技术分离含有CPS3的3.3kb Hind III重组体和相关的3.3kbXbaI克隆(未示于图1中)。使用CPS3 3’端的200bpXbaI/Hind III片段进行1.3kb XbaI片段CPS4的克隆，该CPS4含有推测的终止密码子和一些3’非编码区。

这四种基因片段(CPS1、CPS2、CPS3和CPS4)结合(除去其重叠部分)得到总共8.8kb的序列，它由约7.0kb的编码序列和1.8kb的侧面序列组成。

该恶性疟原虫CPSII基因的完整核苷酸序列与其5’和3’侧面序列一起示于表1中。

对于本领域专业人员来说显而易见的是，由本发明人分离的该基因及其侧序展现了一系列治疗恶性疟原虫感染的新途径。本发明利用重组DNA技术能够产生一定量的恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶II。该酶的特征使其能够用作化学治疗位点。

该基因的分离还使得能够产生反义分子、核酶或其他基因失活剂，它可用于防止寄生虫在感染个体中的增殖。

对于本领域专业人员显而易见的是，在不背离本发明广义描述的精神和范围条件下，对如具体实施方案所示的本发明可以进行各种改变和/或修改。因此，本发明的具体实施方案将被认为是对所有方面的说明，而非限制。

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Claims

1、编码恶性疟原虫氨甲酰磷酸合成酶II的核酸分子，该核酸分子包括如表1中残基1-7176、或1-750、或751-1446、或1447-2070、或2071-3762、或3763-5571、或5572-7173、或1-3360、或2071-6666、或2071-7173所示序列或由于密码子简并而与上述序列有所不同的序列。

2、如权利要求1所述的核酸分子，其中该核酸分子包括如表1中-1225-7695所示序列或由于密码子简并而与上述序列有所不同的序列。

3、分离的多肽，该多肽包括如表1中1-2391、483-690、691-1254、1858-2391、1-1120、691-2222或691-2391所示的氨基酸序列。

4、一种根据权利要求1或2的核酸分子的mRNA序列设计的核酶。

5、如权利要求4所述的核酶，其根据表1中残基751-1446或3763-5571所示核酸序列的mRNA序列设计而成。

6、如权利要求1或2的核酸分子的反义寡核苷酸。