CN1854300A - 含pon基因的重组质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及携带血清对氧磷酶基因的重组质粒(pDNA/PON)、含有该重组质粒的细胞和组合物。本发明的重组质粒、细胞和组合物可用于预防和治疗有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病及其并发症。

Description

含PON基因的重组质粒及其应用

                    技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及携带血清对氧磷酶基因的重组质粒预防和治疗有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病及其并发症中的应用。

                    背景技术

血清对氧磷酶(paraoxonase，PON)是一种由肝脏分泌的钙离子依赖的芳香酯酶。PON基因家族有三个成员，包括PON1，PON2，PON3，它们定位在染色体7q21.3-22.1。PON蛋白的N端有一段疏水区域，PON通过其疏水序列与高密度脂蛋白中的载脂蛋白紧密结合，发挥多种生物效应。PON的底物为芳香酯类，有机磷酸酯类，以及氧化型低密度脂蛋白的磷脂。在高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病的患者中，血清PON水平降低，活性下降，因此补充足够的PON能预防和治疗上述疾病。

由于有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病及其并发症的防治需要大量PON，应用蛋白制剂成本较高，纯化方法复杂，工艺不成熟，高纯度大批量生产困难，临床治疗易产生不良作用。近年来兴起一种新的基因治疗和预防模式，可克服上述缺点。

基因治疗所用的基因导入系统，大致可分为非病毒载体和病毒载体两类。病毒载体在体内可获高效表达，但它们易发生突变或随机整合，引发宿主产生严重的免疫和炎症反应及其它一些难以预料的严重后果。目前质粒载体作为一种新型的基因载体受到人们的广泛关注，它是基因治疗中最简单的载体系统。质粒作为载体的优势在于廉价易得、安全、可重复注射、稳定性好、目的基因表达可以控制、使用方法简单易行，能够象常规药物一样应用。

许多有机磷化合物因其剧毒而成为化学战剂和农业杀虫剂，还能被用于恐怖活动。它们的毒性是由于对胆碱酯酶的不可逆抑制，导致中枢神经末梢乙酰胆碱大量蓄积，引起胆碱能神经功能亢进。预防有机磷中毒的有效方法是用毒剂水解酶将有机磷毒剂在其未到达中枢神经系统前在血流中清除。PON能水解杀虫剂(如对氧磷，毒死蜱)、神经毒剂(如梭曼，沙林)等剧毒化合物。本发明人发现，通过重组质粒PON可在体内得到高效表达，有效地提高动物的存活率。

随着现代社会生活条件的提高和人口老龄化，心血管病和糖尿病严重危害人类健康。目前高血脂，动脉粥样硬化和糖尿病发生率高，病程长，给社会和家庭带来沉重负担。由于高血脂和动脉粥样硬化是一类与脂质代谢异常有关的慢性疾病，患者血清中PON含量下降。本发明人发现，通过重组质粒补充足够的PON，在体内发挥抗氧化，调节血脂和保护HDL的完整性和功能，可达到预防和治疗高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病及其并发症的发生或减缓病变进程的目的。

                        发明内容

本发明一方面涉及血清对氧磷酶基因。本说明书和权利要求书中所述的血清对氧磷酶基因，包括与SEQ ID NO：1序列间至少有70％(优选80、85、90、95、96、97、98、甚至99％)同一性、并编码基本保留血清对氧磷酶活性的蛋白质的多核苷酸。所述血清对氧磷酶基因包括该基因天然发生的等位基因变异体的编码序列，或天然发生或者人工变异体的编码序列。这些变异体包括缺失变异体、置换变异体和增加或插入变异体。这些变异体还包括简并变体，例如利用目的宿主的密码子使用设计的编码相同或类似氨基酸序列的人工合成多核苷酸序列。

根据本发明的PON基因或者核酸包括但不限于，例如DNA、RNA(如mRNA)、合成核酸、多肽核酸、修饰的核苷酸或它们的混合物。DNA包括cDNA，也包括其对应的基因组DNA。DNA可是单链的也可是双链的。构成核酸的核苷酸可通过各种已知的连接方式连接起来，例如酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、氨基甲酸酯等，对这些方法的选择依赖于所要达到的目的，例如抗核酸酶(如RNaseH)、改善体内稳定性等。见例如美国专利5,378,825。

根据本文公开的PON基因序列或者其它序列，本领域技术人员通过常规技术可以从多种来源分离或者人工合成各种PON基因。例如，根据本文公开的序列，合成引物或者探针，利用扩增技术或者杂交技术，可从不同物种或者个体的遗传物质样品筛选获得各种PON基因。

本发明涉及血清对氧磷酶基因所编码的多肽，包括SEQ ID NO：1编码的成熟多肽，以及该多肽的片段，类似物和衍生物。

本发明一方面涉及重组质粒，其携带血清对氧磷酶基因。

在优选方面，本发明的重组质粒还包括与血清对氧磷酶基因可操作地连接的调节序列，例如，启动子，包括如CMV即刻早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-1等任何在真核细胞中有作用的启动子。

所述重组质粒还可以包含其它有助于在细胞中表达和分泌血清对氧磷酶的多核苷酸序列。

在一些实施方式中，本发明的重组质粒是可在宿主中复制和生存的真核表达质粒，这些质粒的例子是pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL，pcDNA；该重组质粒含有并能够在真核细胞中表达血清对氧磷酶基因。

在一个具体实施方案中，重组质粒中血清对氧磷酶基因包含：(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或者(b)与(a)至少有70％同一性、并编码基本保留血清对氧磷酶活性的蛋白质的多核苷酸。

本发明的重组质粒中可以以正向或反向插入血清对氧磷酶序列。在这一实施方案的一个优选方面，该重组质粒还包括调节序列，包括例如，与上述序列连接的启动子。以下列举质粒的例子。如pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL，pcDNA等分子生物学领域常用的载体。也可使用可在宿主中复制和生存的其它真核表达质粒。

启动子区可以选用包括CMV即刻早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-1等适合于真核细胞的启动子。

本发明还包括这样的序列和质粒，其中成熟多肽的编码序列可以在同一读框中与有助于从细胞中表达和分泌的多核苷酸序列融合，例如前导序列，其功能是作为分泌序列控制多肽从细胞中的转运。

本发明的重组质粒可以通过本领域常规技术构建。各种克隆和表达载体是已知的，并可按照需要构建用于特定目的的新克隆和表达载体。在获得本发明的PON基因后，可以进行通过常规重组技术导入任何适当的质粒载体中。

在另一方面，本发明还涉及本发明重组质粒在制备药物中的用途。所述药物可用于预防和/或治疗有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病或者其并发症。

所述药物可用于预防和/或治疗血清对氧磷酶相关疾病。所述血清对氧磷酶相关疾病是指使用血清对氧磷酶能够预防或治疗的任何疾病，包括例如有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病或者其并发症。

例如，本发明药物可用于预防有机磷化合物的中毒，能够明显降低死亡率；可用于预防和治疗高血脂，动脉粥样硬化、糖尿病及其并发症，能够用于升高血清超氧化物歧化酶水平，减少脂质过氧化产物的产生，和降低血清甘油三酯，总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，清除肝脏中的脂肪淤积，缩小甚至消除血管阻塞和斑块形成等。还可用于预防和治疗糖尿病，能显著降低高血糖，改善糖尿病肾病等并发症。

另一方面，本发明还涉及含有本发明重组质粒的细胞，包括原核细胞如大肠杆菌细胞和真核细胞如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞，特别是人细胞。

另一方面，本发明还涉及含有所述重组质粒的药物组合物，所述药物组合物能用于预防和/或治疗血清对氧磷酶相关疾病，如有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病或者其并发症等。优选药物组合物还含有可药用的载体。

所述药物组合物可被制备成注射液、喷涂剂或冻干剂等形式。

本发明还涉及预防和/或治疗血清对氧磷酶相关疾病，如有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病或者其并发症的方法，包括向有需要的个体给予本发明重组质粒或者药物组合物或者药物。

待预防或者治疗的个体可以是任何动物，如家养动物，哺乳动物。在一个优选实施方案中，所述个体是人。在另一个实施方案中，所述个体是非人动物。

本发明含重组质粒的药物可以通过多种途径给药。例如静脉注射，肌肉注射，皮下给药等。给药剂量和方案取决于多种因素，并可由本领域技术人员针对特定个体进行确定。给药剂量可以是例如20～600μg/kg，优选范围50～200μg/kg。

本发明涉及携带血清对氧磷酶基因的重组质粒(如pDNA/PON)在治疗和预防有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病及其并发症中的应用。特别地，涉及通过基因重组技术获得可以在真核细胞表达的重组质粒，如pDNA/PON。pDNA/PON配制成的注射液可用于预防有机磷化合物的中毒，能够明显降低死亡率；pDNA/PON配制成的注射液可用于预防和治疗高血脂，动脉粥样硬化、糖尿病及其并发症，能够升高血清超氧化物歧化酶水平，减少脂质过氧化产物的产生，并降低血清甘油三酯，总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，清除肝脏中的脂肪淤积，缩小甚至消除血管阻塞和斑块形成。pDNA/PON配制的注射液用于预防和治疗糖尿病，能显著降低高血糖，改善糖尿病肾病等并发症。

                        附图说明

图1：重组质粒pDNA/PON

图2：重组质粒(pDNA/PON)防治动脉粥样硬化。(A)，正常对照，(B)动脉粥样硬化模型，(C)，150μg pDNA/PON治疗组，(D)，300μgpDNA/PON治疗组，(E)600μg pDNA/PON治疗组，(F)，1200μg pDNA/PON治疗组。

在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。

实施例1：

重组质粒载体的构建

将含有人PON基因(见SEQ ID NO：1序列)的原核表达载体pBluescrip/PON(Dr.Clement E.Furlong赠送)为模板，设计引物：引物1，5′GCA GGTACCATGGCGAAGCTGATTGCG 3′；引物2，GCA GAATTCTTAGAGCTCACAGTAAAG 3′。引物1和引物2中分别插入KpnI和EcoRI酶切位点。于94 C 40秒，58 C 40秒，72 C 2.5分钟，40个循环条件下进行PCR扩增。扩增产物用KpnI和EcoRI酶切后(在T4连接酶作用下)插入至pDNA中，PCR和酶切鉴定正确后测序，得到pDNA/PON质粒(图1)。将质粒于大肠杆菌TOP10菌株中扩增，提取质粒。

此外，根据本文公开的PON基因序列或者其它序列，本领域技术人员通过常规技术可以从多种来源分离或者人工合成各种PON基因。在获得本发明的PON基因后，可以通过常规重组技术获得包含PON基因的真核表达的本发明重组质粒。

实施例2：

pDNA/PON预防梭曼中毒

有机磷化合物梭曼是一剧毒的军用毒剂，也可用于恐怖活动。其毒性主要表现为对胆碱酯酶的不可逆抑制，它使胆碱酯酶的酶活性位点的丝氨酸残基磷酰化，导致酶的失活，使乙酰胆碱在神经末梢大量蓄集。PON能够催化梭曼分子中磷酯键水解，对一定程度的梭曼中毒起保护作用(表1)。本实验直接将质粒pcDNA/PON静脉注射入小鼠体内，24h后给小鼠sc梭曼200μg/kg(1.0LD)，正常对照和注射空质粒的小鼠出现肌颤，竖尾，震颤，流涎，惊厥，约在9min内死亡，而预先注射600μg pcDNA/PON的小鼠60％存活(一周内的观察结果)，死亡小鼠的死亡时间延长(表1)。说明注射的重组质粒在体内得到高效表达，升高血清中PON水平，增强了机体对梭曼的耐受力。

实施例3

pDNA/PON预防动脉粥样硬化

正常血管内膜表面光滑，无脂质浸润。高脂饲料喂养25天后，主动脉内膜产生严重的病理改变，表面粗糙，高于内膜表面的脂质斑块生成，特别在主动脉根部更为严重，有明显的脂质斑块出现。说明已形成了动脉粥样硬化病理学改变。若同时给予(尾静脉注射)模型大鼠pcDNA/PON125天，其主动脉管壁斑块减小或消失，病变大为改善(图2)。说明重组质粒基因组在小鼠体内能有效地表达，其表达产物中的PON在血清中发挥了抗氧化作用，升高SOD水平，减少脂质过氧化产物的产生，并降低血清TG，LDL-C和TC，清除肝脏中的脂肪淤积，缩小甚至消除主动脉斑块，起到预防和治疗动脉粥样硬化的作用。

表1质粒pcDNA/PON预防小鼠梭曼中毒

组别	剂量(μg/kg)	动物数	动物存活数
				空载体重组质粒	015030060012001503006001200	101010101010101010	000000466

SEQ ID NO：1信息：

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基于本文公开的内容，本文公开和要求保护的所有组合物和方法都能够不需要过度实验而制备和实施。尽管本发明的组合物和方法已经通过优选的实施方案进行了说明，但是对本领域技术人员显而易见的是，本发明组合物和方法以及该方法的步骤和步骤顺序可以进行改动，而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体的是，很明显，可以用化学和生理学相关的某些试剂替代本文公开的试剂，同时实现相同或者类似的结果。所有这些本领域技术人员明显的替代和修改都被认为包括在权利要求书限定的本发明精神、范围和概念之内。

                            序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所

<120>含PON基因的重组质粒及其应用

<130>idc050025

<160>4

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1068

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1068)

<400>1

atg gcg aag ctg att gcg ctc acc ctc ttg ggg atg gga ctg gca ctc     48

Met Ala Lys Leu Ile Ala Leu Thr Leu Leu Gly Met Gly Leu Ala Leu

1               5                   10                  15

ttc agg aac cac cag tct tct tac caa aca cga ctt aat gct ctc cga     96

Phe Arg Asn His Gln Ser Ser Tyr Gln Thr Arg Leu Asn Ala Leu Arg

            20                  25                  30

gag gta caa ccc gta gaa ctt cct aac tgt aat tta gtt aaa gga atc    144

Glu Val Gln Pro Val Glu Leu Pro Asn Cys Asn Leu Val Lys Gly Ile

        35                  40                  45

gaa act ggc tct gaa gac ttg gag ata ctg cct aat gga ctg gct ttc    192

Glu Thr Gly Ser Glu Asp Leu Glu Ile Leu Pro Asn Gly Leu Ala Phe

    50                  55                  60

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Ile Ser Ser Gly Leu Lys Tyr Pro Gly Ile Lys Ser Phe Asn Pro Asn

65                  70                  75                  80

agt cct gga aaa ata ctt ctg atg gac ctg aat gaa gaa gat cca aca    288

Ser Pro Gly Lys Ile Leu Leu Met Asp Leu Asn Glu Glu Asp Pro Thr

                85                  90                  95

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Val Leu Glu Leu Gly Ile Thr Gly Ser Lys Phe Asp Val Ser Ser Phe

            100                 105                 110

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Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Thr Asp Glu Asp Asn Ala Met Tyr

        115                 120                 125

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Leu Leu Val Val Asn His Pro Asp Ala Lys Ser Thr Val Glu Leu Phe

    130                 135                 140

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145                 150                 155                 160

cat aaa ctt ctg cct aat ttg aat gat att gtt gct gtg gga cct gag    528

His Lys Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asp Ile Val Ala Val Gly Pro Glu

                165                 170                 175

cac ttt tat ggc aca aat gat cac tat ttt ctt gac ccc tac tta caa    576

His Phe Tyr Gly Thr Asn Asp His Tyr Phe Leu Asp Pro Tyr Leu Gln

            180                 185                 190

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Ser Trp Glu Met Tyr Leu Gly Leu Ala Trp Ser Tyr Val Val Tyr Tyr

        195                 200                 205

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Ser Pro Ser Glu Val Arg Val Val Ala Glu Gly Phe Asp Phe Ala Asn

    210                 215                 220

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Gly Ile Asn Ile Ser Pro Asp Gly Lys Tyr Val Tyr Ile Ala Glu Leu

225                 230                 235                 240

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Leu Ala His Lys Ile His Val Tyr Glu Lys His Ala Asn Trp Thr Leu

                245                 250                 255

act cca ttg aag tcc ctt gac ttt aat acc ctc gtg gat aac ata tct    816

Thr Pro Leu Lys Ser Leu Asp Phe Asn Thr Leu Val Asp Asn Ile Ser

            260                 265                 270

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Val Asp Pro Glu Thr Gly Asp Leu Trp Val Gly Cys His Pro Asn Gly

        275                 280                 285

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Met Lys Ile Phe Phe Tyr Asp Ser Glu Asn Pro Pro Ala Ser Glu Val

    290                 295                 300

ctt cga atc cag aac att cta aca gaa gaa cct aaa gtg aca cag gtt    960

Leu Arg Ile Gln Asn Ile Leu Thr Glu Glu Pro Lys Val Thr Gln Val

305                 310                 315                 320

tat gca gaa aat ggc aca gtg ttg caa ggc agt aca gtt gcc tct gtg   1008

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                325                 330                 335

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            340                 345                 350

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        355

<210>2

<211>355

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Lys Leu Ile Ala Leu Thr Leu Leu Gly Met Gly Leu Ala Leu

1               5                   10                  15

Phe Arg Asn His Gln Ser Ser Tyr Gln Thr Arg Leu Asn Ala Leu Arg

            20                  25                  30

Glu Val Gln Pro Val Glu Leu Pro Asn Cys Asn Leu Val Lys Gly Ile

        35                  40                  45

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    50                  55                  60

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65                  70                  75                  80

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                85                  90                  95

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            100                 105                 110

Asn Pro His Gly Ile Ser Thr Phe Thr Asp Glu Asp Asn Ala Met Tyr

        115                 120                 125

Leu Leu Val Val Asn His Pro Asp Ala Lys Ser Thr Val Glu Leu Phe

    130                 135                 140

Lys Phe Gln Glu Glu Glu Lys Ser Leu Leu His Leu Lys Thr Ile Arg

145                 150                 155                 160

His Lys Leu Leu Pro Asn Leu Asn Asp Ile Val Ala Val Gly Pro Glu

                165                 170                 175

His Phe Tyr Gly Thr Asn Asp His Tyr Phe Leu Asp Pro Tyr Leu Gln

            180                 185                 190

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        195                 200                 205

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    210                 215                 220

Gly Ile Asn Ile Ser Pro Asp Gly Lys Tyr Val Tyr Ile Ala Glu Leu

225                 230                 235                 240

Leu Ala His Lys Ile His Val Tyr Glu Lys His Ala Asn Trp Thr Leu

                245                 250                 255

Thr Pro Leu Lys Ser Leu Asp Phe Asn Thr Leu Val Asp Asn Ile Ser

            260                 265                 270

Val Asp Pro Glu Thr Gly Asp Leu Trp Val Gly Cys His Pro Asn Gly

        275                 280                 285

Met Lys Ile Phe Phe Tyr Asp Ser Glu Asn Pro Pro Ala Ser Glu Val

    290                 295                 300

Leu Arg Ile Gln Asn Ile Leu Thr Glu Glu Pro Lys Val Thr Gln Val

305                 310                 315                 320

Tyr Ala Glu Asn Gly Thr Val Leu Gln Gly Ser Thr Val Ala Ser Val

                325                 330                 335

Tyr Lys Gly Lys Leu Leu Ile Gly Thr Val Phe His Lys Ala Leu Tyr

            340                 345                 350

Cys Glu Leu

        355

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gcaggtacca tggcgaagct gattgcg                                       27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

gcagaattct tagagctcac agtaaag                                       27

Claims (10)

1.重组质粒，其携带血清对氧磷酶基因。

2.权利要求1的重组质粒，其还包括与血清对氧磷酶基因可操作地连接的调节序列，例如，启动子，包括如CMV即刻早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-1等任何在真核细胞中有作用的启动子；和/或所述重组质粒还包含其它有助于在细胞中表达和分泌血清对氧磷酶的多核苷酸序列。

3.权利要求1或者2的重组质粒，其是可在宿主中复制和生存的真核表达质粒，例如pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL，pcDNA；该重组质粒含有并能够在真核细胞中表达血清对氧磷酶基因。

4.权利要求1或者2或者3的重组质粒，其中血清对氧磷酶基因包含：(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或者(b)与(a)至少有70％同一性、并编码基本保留血清对氧磷酶活性的蛋白质的多核苷酸。

5.权利要求1-4任何一项的重组质粒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病或者其并发症。

6.权利要求1-4任何一项的重组质粒在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗血清对氧磷酶相关疾病。

7.含有权利要求1-4任何一项的重组质粒的细胞，包括原核细胞如大肠杆菌细胞和真核细胞如酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞，特别是人细胞。

8.含有权利要求1-4任何一项的重组质粒的药物组合物，所述药物组合物能用于预防和/或治疗有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病或者其并发症，优选还含有可药用的载体。

9.权利要求7的药物组合物，其特征是该质粒被制备成注射液、喷涂剂或冻干剂。

10.预防和/或治疗有机磷化合物中毒、高血脂、动脉粥样硬化、糖尿病或者其并发症的方法，包括向有需要的个体给予权利要求1-4的重组质粒或者权利要求8或者9的药物组合物。

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