CN100347298C - 鱼类肌肉生长抑素mstn基因克隆及其基因打靶载体构建 - Google Patents

Abstract

一种鱼类肌肉生长抑素MSTN基因及其基因打靶载体，它的方法是分离克隆了花鲈MSTN基因，其全长为4873bp，包括3个外显子，2个内含子，5’调控序列和非翻译区以及3’非翻译区。根据测定出的花鲈MSTN基因序列，设计引物，扩增得到该基因的一个3.2KB的长片段和一个1.5KB的短片段，将这两个片段依次连接到pBSII⁺KS载体上，获得重组载体p+MSTN3.2+MSTN1.5，然后将正选择标记基因neo片段连接到上述MSTN基因长片段和短片段的中间，形成p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo的重组载体；最后将负选择标记基因SVTK-tk片段连接到上述长片段的侧翼，最后获得p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo+tk的基因打靶载体。本发明克隆了鱼类MSTN全长基因，并首次构建了鱼类MSTN基因打靶载体，可用于各种鱼类MSTN基因克隆及基因打靶载体的构建，在鱼类基因工程育种上具有重要应用价值。

Description

鱼类肌肉生长抑素MSTN基因克隆及其基因打靶载体构建

所属技术领域：

本发明属于生物技术领域中的鱼类基因工程技术，是一种能在鱼类遗传改良中应用的鱼类肌肉生长抑制基因及其基因打靶载体。

背景技术：

肌肉生长抑素基因(myostatin，MSTN)是1997年发现的转录生长因子(TGF-β)家族的一个成员(McPherron，等，1997，美国Johns Hopkins大学)，对骨骼肌的发育和生长具有负调控作用，该基因缺失会导致骨骼肌增生(McPherron，等，1997；Grobet等，2003，比利时Liège大学)。在小鼠上研究发现，通过基因敲除使MSTN基因C端生物活性区缺失的小鼠骨骼肌比普通野生小鼠增加了2-3倍。随后，McPherron等(1997)发现双肌牛中该基因发生突变，导致双肌牛肌肉产量比普通牛增加了30％。由于MSTN基因对肌肉生长具有负调控作用，因此受到广泛关注，大量的哺乳动物特别是家畜的MSTN基因已被克隆出来，MSTN基因的功能及应用研究也在大量进行，目前，MSTN基因相关研究已成为分子生物学领域的研究热点。

在鱼类，到目前为止，仅有少数几种鱼类的MSTN基因被克隆，包括沟鲶(Kocabas等，2002，美国奥本大学)；金鲷(Maccatrozzo等，2001，意大利Padova大学)；罗非鱼(Rodgers等，2001，美国JohnsHopkins大学)和虹鳟(Rescan等，2001法国鱼类生理实验室)。研究表明，鱼类MSTN基因的结构和哺乳动物MSTN结构相似，都是由3个外显子和2个内含子所组成，外显子和内含子的边界处通过严格的AT-GC连接，C末端是该基因的功能区，具有高度的保守性，在此蛋白生物活性区域有一个4个氨基酸组成的RXXR的蛋白水解酶加工位点，MSTN基因成熟区通过其中9个保守的半胱氨基酸形成二硫键，C末端的“半胱氨酸”结构在所有TGF-β超家族中是保守的，对于MSTN基因的功能活性具有重要作用。体外表达分析显示鱼类的MSTN基因表达不同于哺乳类MSTN基因。目前在斑马鱼上通过反义核酸技术MSTN1转录本表明，敲除的胚胎发育明显加快，通过表型观察发现MSTN1敲除的斑马鱼身体尺寸增加，受精后20小时的敲除MSTN1胚胎在尺寸上和对照组受精后30小时的胚胎大小相似。通过双链RNA干涉技术沉默MSTN转录本，表型观察发现，沉默MSTN基因的斑马鱼成体肌肉含量增加了39％-45％，导致了过度生长。尽管反义核酸技术和双链RNA干涉技术都证实了MSTN基因的功能，但反义核酸技术和双链RNA干涉技术都无法产生稳定突变的鱼类品系，如果通过基因打靶技术将某种鱼类的MSTN基因定点突变，产生稳定遗传的敲除MSTN的转基因鱼，将会提高鱼的肌肉产量和品质。但有关鱼类MSTN基因同源重组载体构建及其定点突变方面，目前国内外未见报道。

发明内容：

本发明的目的是为了克隆鱼类MSTN基因组基因、弄清鱼类MSTN基因的结构以及构建鱼类MSTN基因打靶载体，为鱼类MSTN基因的功能分析及通过基因打靶途径提高鱼的肌肉含量和品质提供基因材料和技术方法。本发明其技术内容如下：

一、花鲈生长抑素(MSTN)基因的克隆：包括：1、基因组DNA序列的获得，2、蛋白氨基酸序列推测和分析，3、基因组结构的分析；二、MSTN基因打靶载体的构建：包括：1、同源长片段和短片段的扩增和连接，2、正选择标记基因neo片段的连接，3、负选择标记基因SVTK-tk基因的连接。

一、鱼类生长抑素(MSTN)全长基因的克隆

鱼类生长抑素(MSTN)基因的克隆：包括：基因组DNA序列的获得、蛋白氨基酸序列的推测和分析、基因组结构的分析。

1.基因组DNA序列的获得：用DNAStar软件对GenBank中其它几种鱼类的cDNA序列和DNA序列比对，根据其保守性很高的区域设计了三对简并引物，扩增并获得了整个MSTN基因组编码区序列，再通过已获得的花鲈MSTN序列，设计特异引物，通过基因组步移技术扩增出花鲈MSTN基因的5’和3’非编码序列，得到了全长的基因组序列。

2.蛋白氨基酸序列的推测和分析：根据外显子和内含子交界处的特征GT...AG，分析基因各外显子和内含子位置，用EditSeq软件分析ORF阅读框和推测蛋白质序列，用BioEdit软件对蛋白质序列进行比对分析。将推测的蛋白质序列与美国GENBANK序列数据库中其他物种的MSTN蛋白序列进行比对，用BLASTX程序算出同源性。

3、基因组结构的分析：将基因组DNA序列和蛋白序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，结构分析表明该基因组DNA全长4873bp，包括三个外显子(分别为378bp、366bp、381bp)，二个内含子(454bp、758bp)及1170bp的5’非翻译区，1366bp的3’非翻译区。在5’非翻译区上发现了一个TATA框和7个肌肉特异性的E框。

二、MSTN基因打靶载体的构建

MSTN基因打靶载体的构建采用正-负选择策略设计同源重组打靶载体。包括长片段和短片段的扩增、长片段和短片段的连接；正选择基因neo的连接；负选择基因tk基因的连接。最终成功的构建了花鲈MSTN同源重组基因打靶载体。

1.同源长片段和短片段的扩增和连接：

根据测定出的花鲈MSTN全长基因组的序列，设计一对含有适当酶切位点(XbaI和BamHI)的特异引物，扩增得到一个3.2KB的长片段；再设计一对含有酶切位点(BamHI和SalI)的特异引物，扩增得到一个1.5KB的短片段。这两个片段用相应的酶切，纯化后，依次连接到相应酶切的pBSII⁺KS载体上，经筛选、酶切鉴定获得重组载体p+MSTN3.2+MSTN1.5，进一步经测序证实为正确连接。

2.正选择标记基因neo片段的连接

应用SVTK-neo基因表达盒作为正选择基因引入打靶载体，即将neo基因通过BamHI酶切，连接插入到长片段和短片段之间，经筛选、酶切鉴定获得p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo的重组载体。

3.负选择标记基因SVTK-tk基因的连接：

应用SVTK-tk基因表达盒作为负选择基因引入打靶载体，即将tk基因通过XbaI酶切，连接插入到长片段的侧翼，经筛选、酶切鉴定获得p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo+tk的重组载体，如图2所示。

本发明与已有技术对比其特点是：本发明克隆了鱼类MSTN全长基因，包括5‘端调控序列和3’端序列；弄清了该基因的全部序列及结构特征，并首次构建了鱼类MSTN基因打靶载体。可以用于鱼类基因打靶实验。本发明的技术方法可在其它鱼类上进行应用。

附图说明：

图1：花鲈MSTN基因和推导的氨基酸序列

其中5’和3’非翻译区以及内含子序列用小写字母表示；外显子和推定的氨基酸用大写字母表示，氨基酸位于相应的密码子下面，下划线部分为微卫星重复序列，TATA框和肌肉特异性E-框用黑体加下划线表示。

图2：花鲈MSTN基因打靶载体

具体实施方式：

下面以花鲈MSTN基因的克隆和基因打靶载体构建为例，结合附图，对本发明的技术内容进行详细说明。

本发明其技术内容如下：一、花鲈生长抑素(MSTN)基因的克隆：基因组DNA序列的扩增、蛋白氨基酸序列的推测及比对、基因组结构的分析。二、MSTN基因打靶载体的构建：包括MSTN基因的结构分析、同源长片段和短片段的克隆和连接；正选择标记基因neo片段的连接；负选择标记基因tk基因的连接。

一、花鲈生长抑素(MSTN)基因的克隆：

1.DNA序列的扩增和克隆：用设计的三对引物(SP-MSTN1：5’-AATCCAAACCCAGTCCAGTCGC-3’，5’-ATCAGGCGGGAGATTTGCAGGA-3’；SP-MSTN2：5’-CTGCAAATCTCCCGCCTGATGCC-3’，5’-TCTTGCCGTAGATGATCTGCTC-3；SP-MSTN3：5’-TGAAGACTTTGGCTGGGACTGGAT-3’，5’-CTTGAGGATTCCTGGTTTCACT-3’)特异扩增出了花鲈MSTN基因的3个扩增片段，回收纯化后，连接测序，通过3个片段的重叠部分，将3个片段拼接起来，获得了整个编码区的序列，再根据已测序的序列，设计了一对特异性的引物AP1：5’-CGCCTCTTGGTCGCTCAAAACTACTG-3’和AP2：5’-CCACATCCTTGTTGTCATCTCCCAGCACG-3’，通过基因组步移技术扩出5’非翻译区，另一对特异性的引物S1：5’-TGGACCGTTGTGGATGCTCTTGAGTTG-3’和S2：5’-CAGAACACGGTGCAATAGAACCAGAGTAG-3’扩出了3’非翻译区，获得了一个全长为4873bp的花鲈基因组序列(图1)，具有完整的编码阅读框，起始密码子和终止密码子。

2.蛋白氨基酸序列的推测及比对：根据已经扩增的基因组序列，设计一对引物SPMSTN-5’：5’-GCATCTGTCTCAGATTGTGCTGTATC-3’和SPMSTN-3’：5’-TCAAGAGCATCCACAACGGTCCAC-3’，扩增并测序了花鲈整个编码的cDNA序列，推测出MSTN编码的蛋白氨基酸序列，同时也证实了以上克隆的基因组序列的正确性。将cDNA和基因组DNA的序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，用BLASTN和BLASTX程序计算我们获得的cDNA克隆片段与GENBANK序列数据库中已存的DNA序列的同源性。通过分析蛋白氨基酸序列，在C末端发现了9个保守的半胱氨基酸残基和一个RVRR(与RXXR相匹配)的蛋白酶解加工位点。这9个保守的半胱氨基酸残基提供二硫键形成位点，对于MSTN蛋白活性功能的形成具有重要的作用。

3.DNA序列分析：通过外显子和内含子交界处的特征GT...AG，以及GenBank中其他物种MSTN基因序列的特征，分析花鲈MSTN基因，结构分析表明该基因组DNA全长4873bp，包括三个外显子(分别为378bp、366bp、381bp)，二个内含子(454bp、758bp)及1170bp的5’非翻译区，1366bp的3’非翻译区。在5’非翻译区上发现了一个TATA框和7个肌肉特异性的E框。

二、MSTN基因打靶载体的构建：

1、同源长片段和短片段的克隆和连接：设计了二对引物，MSTN-N1：5`-ATC GGATCCATCATTGGCGGTTCATCAGTCCCT和MSTN-C1：5`-ATC

GGTGGGTGTGCGGGTACTTCTG扩增了一个3.2KB的长片段，并在5’端引入BamHI酶切位点，在3’末端引入XbaI酶切位点和一段终止序列。基因打靶载体引物设计：另一对引物MSTN-N2：5`-ATC GTCGACGTCTCCCATCAACATGCTCTAC和MSTN-C2：5`-ATC

CTCCTAATGGAAACAATGGCAT-3’扩增了一个1.5KB的长片段，在其5’端引入SalI酶切位点，在3’末端引入BamHI酶切位点和一段终止序列(引入的酶切位点用单横线表示，终止序列用双横线表示)。克隆获得了预期大小的长片段和短片段，通过相应的酶切长片段和短片段以及pBSII⁺KS，将长片段和短片段依次连接到载体上，形成了p+MSTN3.2+MSTN1.5质粒载体，并测序证实了MSTN长片段和短片段为正确的连接。

2、正选择标记基因neo片段的连接：

应用SVTK-neo基因表达盒作为正选择基因引入打靶载体，即用BamHI酶切正选择基因NEO基因以及已构建p+MSTN3.2+MSTN1.5质粒载体，将neo基因连接到p+MSTN3.2+MSTN1.5质粒载体上，形成了p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo的质粒载体，经酶切鉴定为正确插入的载体，体外扩增，提取质粒。

3、负选择标记基因SVTK-TK基因的连接：

应用SVTK-tk基因表达盒作为负选择基因引入打靶载体，即用XbaI酶切负选择基因tk基因以及已构建p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo质粒载体，将tk基因连接到p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo的质粒载体上，最终形成了完整的MSTN正-负选择同源重组基因打靶载体p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo+tk的质粒，经酶切鉴定为正确插入的载体，体外扩增，提取质粒。经纯化并用适合的酶将质粒线性化后即可用于基因打靶实验。

                            序列表

<110>中国水产科学院黄海水产研究所

<120>鱼类肌肉生长抑素(MSTN)基因

<130>PatentIn version 3.1

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>4873

<212>DNA

<213>sea perch

<221>5′UTR

<222>(1)..(1170)

<221>exon 1

<222>(1171)..(1548)

<221>Intron 1

<222>(1549)..(2002)

<221>exon 2

<222>(2003)..(2368)

<221>Intron 2

<222>(2369)..(3126)

<221>exon 3

<222>(3127)..(3507)

<221>3′UTR

<222>(3508)..(4873)

<400>1

gattactata gggcacgcgt ggtcgacggc ccgggctggt ctgtttgtcc agatgtctgt    60

ctgtctggcc tttgatcatt ggcggttcat cagtccctgt gtgggctgct gtcaccggtg    120

ttttcagact gccacgcgtg gacgtcacac gtgggggagg taaaataaaa aaaaataaaa    180

ataaacgggc tctgtaaaat gatccaactt gtcaggttca gggtcactaa catgactctt    240

ggctgactgg aaagtgtttg atttttccca gtcttcagat cgtcaggtcg ccatgtcgcc    300

gctgtgctgc aggtgatggc ctccctgacg agagtgatgt cagcttacca cacgatggca    360

ctgtcttctc atgtgctaca accagatttg accagcaagg atttggacaa gtcctggaat    420

aaggactttt ctttattttt gctgtttttt gaataataat tatttccagt tttgactgat    480

cagcttctca gaggggaacc tggtctgacg ggacgacacc tccagaagga cttgacttca    540

ctgaataaaa ctgtaactct tagggttttt ttccctcaag gattaaatgt atttccacaa    600

ccatgcagac acagttgcat ccatgtacct gtcaccacag acagttcatg tttggtgggc    660

tgcctgcagt ctcattttaa agtgtattct ttattcacag cacaaagtat acatgacacc    720

gcctatctat agcttttatt tcctaatacg caggataaat gctacattgt ttggttttaa    780

taagttgcta taaattgaag cccatcagac tgttccatag gacagacagt ctggtctgcg    840

cctctgcgct cattgcgcga tcactgtaag aaaagtgaat ttctccatct gtggacacgc    900

tcagcacatg ctcacagcct ctaccccttt atggtttgac aacgagaaaa agttttcatg    960

tcagtcggtt aaaattcatt gttccctgtc cagccaatca tagtttttga cgacacaaaa    1020

gaggctaaag ttggagtata aaaaggtgtg cgctaataaa gtatgatgcc tatcagtgtg    1080

ggacattaat ccaaacccag ttcagccgcg cacaggtcca gcacacacca agggatcttt    1140

tttcaaacca aacttcacac cttagagaca atg cgt ctg tct cag att gtg ctg     1194

                                 Met Arg Leu Ser Gln Ile Val Leu

                                 1               5

tat ctg agc ttg ctg att gct ttg ggt cca gta gtt ttg agc gac caa      1242

Tyr Leu Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Pro Val Val Leu Ser Asp Gln

    10                  15                  20

gag gcg cac cag cag ccg tcc gcc tcc agc ccc gtg gac acg gag cag      1290

Glu Ala His Gln Gln Pro Ser Ala Ser Ser Pro Val Asp Thr Glu Gln

25                  30                  35                  40

tgc gcc acc tgc gag gtc cgg cag cag atc aaa acc atg cga tta aac      1338

Cys Ala Thr Cys Glu Val Arg Gln Gln Ile Lys Thr Met Arg Leu Asn

                45                  50                  55

gcg atc aaa tct cag att ctg agc aaa ctg cgg atg aaa gaa gct ccc      1386

Ala Ile Lys Ser Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Met Lys Glu Ala Pro

            60                  65                  70

aat atc agc cga gat atc gtg aag cag ctc ctg ccc aag gcg ccg ccg      1434

Asn Ile Ser Arg Asp Ile Val Lys Gln Leu Leu Pro Lys Ala Pro Pro

        75                  80                  85

ctg cag cag ctt ctc gac cag tac gac gtg ctg gga gat gac aac aag      1482

Leu Gln Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Asp Val Leu Gly Asp Asp Asn Lys

    90                  95                  100

gat gtg gtc atg gag gag gac gac gag cac gcc atc acg gag aca ata      1530

Asp Val Val Met Glu Glu Asp Asp Glu His Ala Ile Thr Glu Thr Ile

105                 110                 115                 120

atg atg atg gcc act gaa gtaagttttt atttcgcttt gttttctgga             1578

Met Met Met Ala Thr Glu

                125

cgacgaaaag gaagcgctca gacgtctcca aactaggctt ttacgcacgg ggcagagcgc    1638

acgagagggg agggaggtgg gggggggcgc tttattttga caacatgtag ctttaccagc    1698

tcttgatatt ggaaatgtag atataccaac atcaccaaca tgtatacggt gtatgtgtgg    1758

gtcggtgcat ttcggcagat cagcgcgcct ggtgattacg cgcacggttt gtaaggtttt    1818

ctaaacgtta ttagcccact tccagagatc aaatgtcgtg tcagggatgt ttaatgacac    1878

cagtttattt cggtctgtaa atttcaatcg cacatggtca gtatacggag aacatagaga    1938

accttctctc tctctctctc tctctccctc tctctctctc cctctctctc tctctccagc    1998

cgag tcc gtc gtc cag gtg gat ggg gaa cca agc tgc tgc ttc ttc tcg     2047

     Ser Val Val Gln Val Asp Gly Glu Pro Ser Cys Cys Phe Phe Ser

                 130                 135                 140

ttc act caa aag ttc cag gcc agt cgc ata gtc cgg gct cag ctc tgg    2095

Phe Thr Gln Lys Phe Gln Ala Ser Arg Ile Val Arg Aia Gln Leu Trp

            145                 150                 155

gtg cat ctg cgc ccg tcg gag gag gcg acc acg gtg ttc ctg caa atc    2143

Val His Leu Arg Pro Ser Glu Glu Ala Thr Thr Val Phe Leu Gln Ile

        160                 165                 170

tcc cgc ctg atg ccg gtc aca gac ggg agc ggg cac ata cgc atc cgc    2191

Ser Arg Leu Met Pro Val Thr Asp Gly Ser Gly His Ile Arg Ile Arg

    175                 180                 185

tcc ctg aag atc gac gtg aat gcc ggg gtc agc tct tgg caa agt ata    2239

Ser Leu Lys Ile Asp Val Asn Ala Gly Val Ser Ser Trp Gln Ser Ile

190                 195                 200                 205

gac gtc aag caa gtg ttg act gtg tgg ctg cgg cag ccg gag acc aac    2287

Asp Val Lys Gln Val Leu Thr Val Trp Leu Arg Gln Pro Glu Thr Asn

                210                 215                 220

tgg ggc atc gag att aac gcc ttc gat tcg agg gga aat gac ttg gcc    2335

Trp Gly Ile Glu Ile Asn Ala Phe Asp Ser Arg Gly Asn Asp Leu Ala

            225                 230                 235

gtg acc tcc gcg gag cca gga gag gaa gga ctg gtgagctgaa cctttatttt    2388

Val Thr Ser Ala Glu Pro Gly Glu Glu Gly Leu

        240                 245

acattaaacc gaaaccttgt ggtcttaggg ttagttcatt atccgggact cctgtcctaa    2448

tcaatatgac tgtaagtata agatgattat aagaactgga ccatcctgta agaaacaaaa    2508

aatattttca cacccccagt gtctaattag gtttaaaaca gtattttgga ttatctgctg    2568

tactgtactg gagccttcca gaggttttag tgtgcagaga ggctttgcag agtcagcagg    2628

tggttaaaca ttcctgcaat caagatttaa gacttttgaa agcgattaat caacacagac    2688

tccatgtagg cgcacacctg catttggagc aatgcccagt ctacaataac cccaaatcaa    2748

actgcttgat tacataaaag ttcacctgcc ccacattcct taaagtattc tgtgtgactg    2808

tgcaaatcag agtaattgcc tgcacacaca cacatacaca cacactgcta ctatcaatga    2868

caagcactta tcatgcggct caaatactgg cactgggctc tgaggcaatt agaataccta    2928

gatggctgtg gttaaccaac cgtcagatga ttcaatttct gtaaaactca aagtttcata    2988

atattatcgt gccatgtttg aaaaccagct gccacaaggt cgagggcacc ggagatgtaa    3048

accgaatgct gtcatccgcc tcctttttgc aaaaccagct atttctccaa agtgttcaca    3108

cgctgtttgt cattgcag caa gcg ttc atg gag gtg aag gtc tcg gag ggc      3159

                    Gln Ala Phe Met Glu Val Lys Val Ser Glu Gly

                        250                 255

ccc aag cgt gcc agg aga gac tcg ggc ctg gac tgt gac gag aac tct      3207

Pro Lys Arg Ala Arg Arg Asp Ser Gly Leu Asp Cys Asp Glu Asn Ser

260                 265                 270                 275

cca gag tcc cgg tgc tgc cgc tat ccg ctc act gtg gac ttt gaa act      3255

Pro Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Val Asp Phe Glu Thr

                280                 285                 290

ttg gct ggg act gga tta ttg ccc caa agc ggc tac aag gcc aac tat      3303

Leu Ala Gly Thr Gly Leu Leu Pro Gln Ser Gly Tyr Lys Ala Asn Tyr

            295                 300                 305

tgc tcc ggg gag tgt gag tac atg cac ttg cag aag tac ccg cac acc      3351

Cys Ser Gly Glu Cys Glu Tyr Met His Leu Gln Lys Tyr Pro His Thr

        310                 315                 320

cac ctg gtg aac aag gcc aac ccc aga ggg acc gcg ggc ccc tgc tgt      3399

His Leu Val Asn Lys Ala Asn Pro Arg Gly Thr Ala Gly pro Cys Cys

    325                 330                 335

acc cct acc aag atg tct ccc atc aac atg ctc tac ttt aac cga aaa      3447

Thr Pro Thr Lys Met Ser pro Ile Asn Met Leu Tyr Phe Asn Arg Lys

340                 345                 350                 355

gag cag atc atc tac ggc aag atc ccc tcc atg gtg gtg gac cgt tgt      3495

Glu Gln Ile Ile Tyr Gly Lys Ile Pro Ser Met Val Val Asp Arg Cys

                360                 365                 370

gga tgc tct tga gttgggtcgg agaccctggc  gagggagagg ggaggacgga         3547

Gly Cys Ser

ggggctgcgg cccagtccgg cctccaactt cagacttttt gacacaacca atccaccagt    3607

tccagtgctt tcctgcagaa cacggtgcaa tagaaccaga gtagaggcca caaacagccc    3667

gaccttcccg cagggcagcg ctttcacaac cggcatagca cttttttttt tctctcctcc    3727

agtgaaatct tagccaaaga ggcttgaagt cagatggatg caggaacaca catacacaca    3787

catgctggac cttggagtga atgtagacag aaattatcaa agttatccaa aaactttctt    3847

tctccttttg tctcggtgtt ctgtgctctg tccatttata caaacatgcc gacagattat    3907

actcgtacgc catctactcc actccactcc attcgtagcc aacatacaag ctattacact    3967

ttctgctaag ctatatgttt gtgataatca tttttcaaga tatgttttca gagtgaaacc    4027

aggaatcctc atggactttt tgaaagggct tggaaaaaca cagctggaga ctctttggag    4087

tgatacatca cactggtgga acatgcgtta gtacacataa atttcatagg aggcgatgag    4147

gagatgaaat ctggctgcac ggggaacccc ttagtcaccg ccacttcact actgcaattt    4207

ataaaaccca gctgaaattt gcaacattaa ttcatttgga aaatctgaca cacgtcgtta    4267

tctttcctgt atcagatcaa actttaagtg ctaatttgtg gggttttttt attaacaatt    4327

ctgagagcgt gggagtaaaa tcctacatgc aggtggtgac gtggtagtcg atcactccgg    4387

agatcccatg gaggcacaaa tgttccgcca gggcgaagta ccactttagg tcttgacagg    4447

tctccatgta ctacatgcca tacattcacg caacaacata cccaaactga ggagcacttc    4507

gtgcttggtc ataatctcca ctatccaaca aaaacagcct gacctgcccg atacacttga    4567

attattctga ttgtaaattc acattactgg acagaaggac ttgaactgaa ggcacaatga    4627

atgcagccta caaatgaaaa atgtgtttaa gacagaggaa actggattgt cgaggtgaat    4687

gaatgttgag atcatgctta aactctgtct tacaaacaac acagtttgca ctatggcaca    4747

ccaatagaaa gaattggttg ctacaaaagt tgtaaaaact gattttgata tgtttgctaa    4807

tttgtattgt atacatatgc cattgtttcc attaggagtt gcctttctaa accactgttg    4867

gtaata                                                               4873

Claims (2)

1、一种鱼类花鲈肌肉生长抑素MSTN基因的克隆方法，其特征在于它的克隆方法，包括：1)、基因组DNA序列的获得，2)、蛋白氨基酸序列推测和分析，3)、基因组结构的分析；

1)、基因组DNA序列的获得：用DNAStar软件对GenBank中其它几种鱼类的cDNA序列和DNA序列比对，根据其保守性很高的区域设计了三对简并引物，从花鲈基因组DNA中扩增并获得了肌肉生长抑素MSTN编码区序列，再通过已获得的MSTN编码区序列，设计特异引物，通过基因组步移技术扩增出MSTN基因的5’和3’非编码序列，得到了MSTN基因的全长基因组序列，所述的鱼类花鲈肌肉生长抑素MSTN基因序列是：

gattactatagggcacgcgtggtcgacggcccgggctggtctgtttgtc cagatgtctgtctgtctggcctttgatcattggcggttcatcagtccctgt    100

                                                  E-box

gtgggctgctgtcaccggtgttttcagactgccacgcgtggacgtca cacgtgggggaggtaaaataaaaaaaaataaaaataaacgggctctgtaaaat    200

                                                E-box

gatccaacttgtcaggttcagggtcactaacatgactcttggctgactggaaagtgtttgatttttcccagtcttcagatcgtcaggtcgccatgtcgcc      300

gctgtgctg caggtgatggcctccctgacgagagtgatgtcagcttaccacacgatggcactgtcttct catgtgctacaaccagatttgaccagcaagg  400

          E-box                                                       E-box

atttggacaagtcctggaataaggacttttctttatttttgctgttttttgaataataattatttccagttttgactgatcagcttctcagaggggaacc      500

tggtctgacgggacgacacctccagaaggacttgacttcactgaataaaactgtaactcttagggtttttttccctcaaggattaaatgtatttccacaa      600

ccatgcagaca cagttgcatccatgtacctgtcaccacagacagttcatgtttggtgggctgcctgcagtctcattttaaagtgtattctttattcacag    700

            E-box

cacaaagtatacatgacaccgcctatctatagcttttatttcctaatacgcaggataaatgctacattgtttggttttaataagttgctataaattgaag      800

cccatcagactgttccataggacagacagtctggtctgcgcctctgcgctcattgcgcgatcactgtaagaaaagtgaatttctc catctgtggacacgc    900

                                                                                      E-box

tcag cacatgctcacagcctctacccctttatggtttgacaacgagaaaaagttttcatgtcagtcggttaaaattcattgttccctgtccagccaatca    1000

     E-box

tagtttttgacgacacaaaagaggctaaagttggag tataaaaaggtgtgcgctaataaagtatgatgcctatcagtgtgggacattaatccaaacccag    1100

                                    TATA box

ttcagccgcgcacaggtccagcacacaccaagggatcttttttcaaaccaaacttcacaccttagagacaATGCATCTGTCTCAGATTGTGCTGTATCTG      1200

                                                                     M  H  L  S  Q  I  V  L  Y  L  10

AGCTTGCTGATTGCTTTGGGTCCAGTAGTTTTGAGCGACCAAGAGGCGCACCAGCAGCCGTCCGCCTCCAGCCCCGTGGACACGGAGCAGTGCGCCACCT      1300

 S  L  L  I  A  L  G  P  V  V  L  S  D  Q  E  A  H  Q  Q  P  S  A  S  S  P  V  D  T  E  Q  C  A  T   43

GCGAGGTCCGGCAGCAGATCAAAACCATGCGATTAAACGCGATCAAATCTCAGATTCTGAGCAAACTGCGGATGAAAGAAGCTCCCAATATCAGCCGAGA      1400

C  E  V  R  Q  Q  I  K  T  M  R  L  N  A  I  K  S  Q  I  L  S  K  L  R  M  K  E  A  P  N  I  S  R  D 77

TATCGTGAAGCAGCTCCTGCCCAAGGCGCCGCCGCTGCAGCAGCTTCTCGACCAGTACGACGTGCTGGGAGATGACAACAAGGATGTGGTCATGGAGGAG      1500

  I  V  K  Q  L  L  P  K  A  P  P  L  Q  Q  L  L  D  Q  Y  D  V  L  G  D  D  N  K  D  V  V  M  E  E  110

GACGACGAGCACGCCATCACGGAGACAATAATGATGATGGCCACTGAAgtaagtttttatttcgctttgttttctggacgacgaaaaggaagcgctcaga      1600

 D  D  E  H  A  I  T  E  T  I  M  M  M  A  T  E                                                      126

cgtctccaaactaggcttttacgcacggggcagagcgcacgagaggggagggaggtgggggggggcgctttattttgacaacatgtagctttaccagctc      1700

ttgatattggaaatgtagatataccaacatcaccaacatgtatacggtgtatgtgtgggtcggtgcatttcggcagatcagcgcgcctggtgattacgcg      1800

cacggtttgtaaggttttctaaacgttattagcccacttccagagatcaaatgtcgtgtcagggatgtttaatgacaccagtttatttcggtctgtaaat      1900

ttcaatcgcacatggtcagtatacggagaacatagagaacct tctctctctctctctctctctccctctctctctctccctctctctctctctccagccg    2000

agTCCGTCGTCCAGGTGGATGGGGAACCAAGCTGCTGCTTCTTCTCGTTCACTCAAAAGTTCCAGGCCAGTCGCATAGTCCGGGCTCAGCTCTGGGTGCA      2100

   S  V  V  Q  V  D  G  E  P  S  C  C  F  F  S  F  T  Q  K  F  Q  A  S  R  I  V  R  A  Q  L  W  V  H 159

TCTGCGCCCGTCGGAGGAGGCGACCACGGTGTTCCTGCAAATCTCCCGCCTGATGCCGGTCACAGACGGGAGCGGGCACATACGCATCCGCTCCCTGAAG      2200

  L  R  P  S  E  E  A  T  T  V  F  L  Q  I  S  R  L  M  P  V  T  D  G  S  G  H  I  R  I  R  S  L  K  192

ATCGACGTGAATGCCGGGGTCAGCTCTTGGCAAAGTATAGACGTCAAGCAAGTGTTGACTGTGTGGCTGCGGCAGCCGGAGACCAACTGGGGCATCGAGA      2300

 I  D  V  N  A  G  V  S  S  W  Q  S  I  D  V  K  Q  V  L  T  V  W  L  R  Q  P  E  T  N  W  G  I  E   225

TTAACGCCTTCGATTCGAGGGGAAATGACTTGGCCGTGACCTCCGCGGAGCCAGGAGAGGAAGGACTGgtgagcgaacctttattttacattaaaccga       2400

I  N  A  F  D  S  R  G  N  D  L  A  V  T  S  A  E  P  G  E  E  G  L                                  248

aaccttgtggtcttagggatagttcattatccgggactcctgtcctaatcaatatgactgtaagtataagatgattataagaactggaccatcctgtaag    2500

aaacaaaaaatattttcacacccccagtgtctaattaggtttaaaacagtattttggattatctgctgtactgtactggagccttccagaggttttagtg    2600

tgcagagaggctttgcagagtcagcaggtggttaaacattcctgcaatcaagatttaagacttttgaaagcgattaatcaacacagactccatgtaggcg    2700

tacacctgcatttggagcaatgcccagtctacaataaccccaaatcaaactgcttgattacataaaagttcacctgccccacattccttaaagtattctg    2800

tgtgactgtgcaaatcagagtaattgcctg cacacacacacatacacacacactgctactatcaatgacaagcacttatcatgcggctcaaatatggtta  2900

ctggcactgggctctgaggcaattagaatacctagatggctgaccaaccgtcagatgattcaatttctgtaaaactcaaagtttcataatattatcgtgc    3000

catgtttgaaaaccagctgccacaaggtcgagggcaccggagatgtaaaccgaatgctgtcatccgcctcctttttgcaaaaccagctatttctccaaag    3100

tgttcacacgctgtttgtcattgcagCAAGCGTTCATGGAGGTGAAGGTCTCGGAGGGCCCCAAGCGTGCCAGGAGAGACTCGGGCCTGGACTGTGACGA    3200

                          Q  A  F  M  E  V  K  V  S  E  G  P  K  R  A  R  R  D  S  G  L  D  C  D  E  273

GAACTCTCCAGAGTCCCGGTGCTGCCGCTATCCGCTCACTGTGGACTTTGAAACTTTGGCTGGGACTGGATTATTGCCCCAAAGCGGCTACAAGGCCAAC    3300

  N  S  P  E  S  R  C  C  R  Y  P  L  T  V  D  F  E  T  L  A  G  T  G  L  L  P  Q  S  G  Y  K  A  N  306

TATTGCTCCGGGGAGTGTGAGTACATGCACTTGCAGAAGTACCCGCACACCCACCTGGTGAACAAGGCCAACCCCAGAGGGACCGCGGGCCCCTGCTGTA    3400

 Y  C  S  G  E  C  E  Y  M  H  L  Q  K  Y  P  H  T  H  L  V  N  K  A  N  P  R  G  T  A  G  P  C  C   339

CCCCTACCAAGATGTCTCCCATCAACATGCTCTACTTTAACCGAAAAGAGCAGATCATCTACGGCAAGATCCCCTCCATGGTGGTGGACCGTTGTGGATG    3500

T  P  T  K  M  S  P  I  N  M  L  Y  F  N  R  K  E  Q  I  I  Y  G  K  I  P  S  M  V  V  D  R  C  G  C 373

CTCTTGAgttgggtcggagaccctggcgagggagaggggaggacggaggggctgcggcccagtccggcctccaacttcagactttttgacacaaccaatc    3600

  S  ★                                                                                              374

caccagttccagtgctttcctgcagaacacggtgcaatagaaccagagtagaggccacaaacagcccgaccttcccgcagggcagcgctttcacaaccgg    3700

catagcacttttttttttctctcctccagtgaaatcttagccaaagaggcttgaagtcagatggatgcagga acacacatacacacacatgctggacctt  3800

ggagtgaatgtagacagaaattatcaaagttatccaaaaactttctttctccttttgtctcggtgttctgtgctctgtccatttatacaaacatgccgac    3900

agattatactcgtacgccatctactccactccactccattcgtagccaacatacaagctattacactttctgctaagctatatgtttgtgataatcattt    4000

ttcaagatatgttttcagagtgaaaccaggaatcctcatggactttttgaaagggcttggaaaaacacagctggagactctttggagtgatacatcacac    4100

tggtggaacatgcgttagtacacataaatttcataggaggcgatgaggagatgaaatctggctgcacggggaaccccttagtcaccgccacttcactact    4200

gcaatttataaaacccagctgaaatttgcaacattaattcatttggaaaatctgacacacgtcgttatctttcctgtatcagatcaaactttaagtgcta    4300

atttgtggggtttttttattaacaattctgagagcgtgggagtaaaatcctacatgcaggtggtgacgtggtagtcgatcactccggagatcccatggag    4400

gcacaaatgttccgccagggcgaagtaccactttaggtcttgacaggtctccatgtactacatgccatacattcacgcaacaacatacccaaactgagga    4500

gcacttcgtgcttggtcataatctccactatccaacaaaaacagcctgacctgcccgatacacttgaattattctgattgtaaattcacattactggaca    4600

gaaggacttgaactgaaggcacaatgaatgcagcctacaaatgaaaaatgtgtttaagacagaggaaactggattgtcgaggtgaatgaatgttgagatc    4700

ttgcttaaactctgtcttacaaacaacacagtttgcactatggcacaccaatagaaagaattggttgctacaaaagttgtaaaaactgattttgatatgt    4800

ttgctaatttgtattgtatacatatgccattgtttccattaggagttgcctttctaaaccactgttggtaata                               4873

2)、蛋白氨基酸序列的推测和分析：根据外显子和内含子交界处的特征GT...AG，分析基因各外显子和内含子位置，用EditSeq软件分析ORF阅读框和推测蛋白质序列，用BioEdit软件对蛋白质序列进行比对分析；将推测的蛋白质序列与美国GENBANK序列数据库中其他物种的MSTN蛋白序列进行比对，用BLASTX程序算出同源性；

3)、基因组结构的分析：将基因组DNA序列和蛋白序列与美国GENBANK序列数据库中已存的DNA序列进行比对，结构分析表明该基因组DNA全长4873bp，包括长度分别为378bp、366bp、381bp的三个外显子，长度分别为454bp和758bp的二个内含子及1170bp的5’非翻译区和1366bp的3’非翻译区；在5’非翻译区上发现了一个TATA框和7个肌肉特异性的E框。

2.一种构建权利要求1中所述的鱼类花鲈肌肉生长抑素MSTN基因打靶载体的方法，其特征在于它的打靶载体的构建方法，包括：1)、同源长片段和短片段的扩增和连接，2)、正选择标记基因neo片段的连接，3)、负选择标记基因SVTK-tk基因的连接；

1)、同源长片段和短片段的扩增和连接：

根据鱼类花鲈肌肉生长抑素MSTN基因的序列，设计一对含有适当酶切位点XbaI和BamHI的特异引物，扩增得到一个3.2KB的长片段，再设计一对含有酶切位点BamHI和SalI的特异引物，扩增得到一个1.5KB的短片段；这两个片段用相应的酶切，纯化后，依次连接到相应酶切的pBSII+KS载体上，经筛选、酶切鉴定获得重组载体p+MSTN3.2+MSTN1.5，进一步经测序证实为正确连接；

2)、正选择标记基因neo片段的连接：

应用SVTK-neo基因表达盒作为正选择基因引入打靶载体，即将neo基因通过BamHI酶切，连接插入到长片段和短片段之间，经筛选、酶切鉴定获得p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo的重组载体；

3)、负选择标记基因SVTK-tk基因的连接：

应用SVTK-tk基因表达盒作为负选择基因引入打靶载体，即将tk基因通过XbaI酶切，连接插入到长片段的侧翼，经筛选、酶切鉴定获得p+MSTN3.2+MSTN1.5+neo+tk的重组载体。

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