CN101063131A

CN101063131A - 花鲈凝集素基因序列

Info

Publication number: CN101063131A
Application number: CN 200710088881
Authority: CN
Inventors: 江世贵; 邱丽华; 张汉华
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2006-05-15
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2007-10-31

Abstract

本发明以近源物种凝集素同源基因CDS序列的保守区设计兼并引物，从花鲈鱼的脾脏中提取总RNA，用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到花鲈凝集素基因的全表达序列。该基因不仅为研究鱼类凝集素在炎症反应中的作用，为进一步探讨鱼类炎症反应的发生机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。

Description

花鲈凝集素基因序列

技术领域

本发明涉及分子生物学中基因领域，特别是关于花鲈凝集素的基因。

背景技术

凝集素(lectin)是一种非免疫来源的能凝集细胞或沉淀含糖大分子的蛋白质或糖蛋白，一般具有糖结合专一性，能与糖蛋白或糖脂的糖相结合，其功能涉及细胞生长、分化、发育和免疫等，特别是在凝集外来细胞，参与吞噬、包囊、凝固、止血及创伤修复等方面发挥着重要的作用。

随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，一般的抗生素药物极易引起环境污染，因此从鱼体自身入手，提高鱼体免疫力是病害防治的趋势。非特异性防御机制在水生动物防止感染中扮演重要角色，潜在的非特异性防御机制可以在微生物入侵时发生作用，能更有效地清除、降解病原微生物和其它有害物质。大量研究表明，水生动物非特异性免疫系统在其自身抗病作用中较特异性免疫系统发挥更大作用。

发明内容

本发明的目的是通过以近源物种凝集素的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到花鲈凝集素的基因的全表达序列。该基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。

本发明的目的通过以下技术措施实现：

1、总RNA的提取

解剖鱼体取出脾脏，使用Trizol进行匀浆，按照使用说明提取花鲈总RNA。

2、cDNA第一链的合成

花鲈总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录。

3、引物设计依据，引物合成的方法

从GenBank中下载近源物种(如人、牛、虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)凝集素同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为260bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。

引物序列为：

F：5’GCAHATCCACATAGYCAACTC 3’

R：5’CGAAYCTCCGCCATCG 3’

4、凝集素基因PCR扩增、克隆

以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。

根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。

在3′端的RACE中，利用基因引物和接头引物进行PCR扩增。

基因引物：5’CAGGAAGAGAAGAGTTCCTG 3’

接头引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。

经过3′端的扩增后的序列再进行5′端的RACE扩增，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用基因特异性引物和oligodG进行PCR扩增。

oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’

基因外侧引物：5’TGCATGATCCAGAGTGGAAG 3’

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接。

5、对花鲈凝集素的基因的测定

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈凝集素基因同源序列。

本发明的优点：本基因的获得不仅为研究鱼类凝集素在炎症反应中的作用，为进一步探讨鱼类炎症反应的发生机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。

附图说明

图1是注射LPS刺激前后体内的不同组织器官的花鲈凝集素的表达量；

No Injected：注射LPS刺激前表达量；Injected with LPS：注射LPS刺激后表达量；liver：肝脏；spleen：脾脏；gill：腮；brain：脑；HK：头肾；heart：心脏；lectin：凝集素；β-actin：β-肌动蛋白。

具体实施方式

1.总RNA的提取

取鲜活健康花鲈(体重约400g)在实验室内暂养2d后(水温约24℃，气泵充气)，从胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖鱼体取出脾脏约100mg，分别放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。

2.cDNA第一链的合成

取花鲈总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃15min，最后放入-80℃保存备用。

3.引物设计依据，引物合成的方法

引物序列为：

F：5’GCAHATCCACATAGYCAACTC 3’

R：5’CGAAYCTCCGCCATCG 3’

4.凝集素基因cDNA全序列的克隆

以近源物种凝集素基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为260bp。

以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl₂ 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。

根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。

在3′端的RACE中，利用基因特异性引物和接头引物进行PCR扩增。

反应体系为：10×PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl₂ 3μL，2.5mmol/L dNTP2μL，10nmol/L正反向引物各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。

反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸50s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。

基因引物：5’CAGGAAGAGAAGAGTTCCTG 3’

接头引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。

经过3′端扩增后的序列再进行5′端的RACE扩增，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用基因特异性引物和oligodG进行PCR扩增。反应体系及反应条件同3′RACE。

oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’

基因引物：5’TGCATGATCCAGAGTGGAAG 3’

5.对花鲈凝集素基因的测定

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈凝集素基因同源序列。比对结果：

Sequences producing significant alignments： (Bits) Value

gi|78191594|gb|ABB29992.1| FBP32II precursor[Morone chrysops] 474 3e-132

gi|78191592|gb|ABB29991.1| FBP32II precursor[Morone saxatilis] 474 3e-132

gi|78191604|gb|ABB29997.1| FBP32 [Morone saxatilis] 451 2e-125

gi|78191588|gb|ABB29989.1| FBP32 precursor[Morone saxatilis] 451 2e-125

gi|78191590|gb|ABB29990.1| FBP32 precursor[Morone chrysops] 449 5e-125

gi|78191607|gb|ABB29999.1| FBP32 [Morone chrysops] 428 1e-118

6.花鲈凝集素基因在不同组织内的表达

按上述方法提取LPS(脂多糖)刺激前后体内的不同组织器官中的凝集素来检测该基因在机体受到外界刺激应激反应时，是否直接发挥作用。

β-actin作为内参照物来调节各个阶段模板即cDNA的量，使其所含的模板数一致，从而进行PCR反应，将所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测基因的表达量的高低。所用的引物序列为：

β-actin：

F：5’ATCGTGGGGCGCCCCAGGCACC 3’

R：5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3’

基因特异性引物：

F：5’TGACTTTGGTTCTGCCTGGTT 3’

R：5’GGACTGTGTGGCTTTTCCTTG 3’

从图1所示的结果可以看出经LPS刺激后，基因在体内组织的表达明显增加，尤其在免疫器官头肾、脾脏及肝脏中表现极为明显。结果说明花鲈凝集素基因在机体免疫防御过程中发挥了作用，参与了免疫防御反应。

序列表

<110>中国水产科学研究院南海水产研究所

<120>花鲈凝集素基因序列

<150>CN200610035461.8

<151>2006-05-15

<160>2

<210>1

<211>1304

<212>RNA

<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)

<220>

<221>3’UTP

<222>(973)...(1304)

<220>

<221>5’UTP

<222>(1)...(39)

<220>

<221>CDS

<222>(40)...(972)

<220>

<221>PolyA site

<222>(1283)...(1304)

<220>

<221>PolyA signal

<222>(1263)...(1267)

<400>1

acattgagtc atccgtctcc aggaagaaag cagtccaga atg atg aga ctc agt 54

Met Met Arg Leu Ser

1 5

gtt ttc ctt gtg ctc ctc ctc tcg gag acg tgc tca gct tcc act tat 102

Val Phe Leu Val Leu Leu Leu Ser Glu Thr Cys Ser Ala Ser Thr Tyr

6 12 18

gaa aat gtg gcc ttg cgt gga aaa gcg acc cag tcg agc cgt tat ttg 150

Glu Asn Val Ala Leu Arg Gly Lys Ala Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu

22 28 34

cat gcg ttt gga ggt gcc tac aat gct att gat gga aac aga gag tct 198

His Ala Phe Gly Gly Ala Tyr Asn Ala Ile Asp Gly Asn Arg Glu Ser

38 44 50

cac ttc cac tct gga tca tgc acc cac tct gct gaa gag acc acc ccc 246

His Phe His Ser Gly Ser Cys Thr His Ser Ala Glu Glu Thr Asn Pro

54 60 66

tgg tgg aga gtg gac ctg ctg gac tcc tat gtc gtc acc tcc atc acc 294

Trp Trp Arg Val Asp Leu Leu Asp Ser Tyr Val Val Thr Ser Ile Thr

70 76 82

atc acc acc aga ggg gac tgc tgt gaa caa agg atc agc ggg ctg cag 342

Ieu Thr Asn Arg Gly Asp Cys Cys Glu Gln Arg Ile Ser Gly Leu Glu

86 92 98

atc cac ata ggc aac tct tta aag gac aac ggt gcc agt aac cca atg 390

Ile His Ile Gly Asn Ser Leu Lys Asp Asn Gly Ala Ser Asn Pro Met

102 108 114

gtt ggc aca atc tct gaa att ggt gca gct aag tcg ttc tct ctg cct 438

Val Gly Thr Ile Ser Glu Ile Gly Ala Ala Lys Ser Phe Ser Leu Pro

118 124 130

ttc acc gat cgt gtg gag gga cgc tat gtg act ttg gtt ctg cct ggt 486

Phe Thr Asp Arg Val Glu Gly Arg Tyr Val Thr Leu Val Leu Pro Gly

134 140 146

tca gga aag tac ctc aca ctc tgc gaa gtg gag gtc tat ggg tac cgt 534

Ser Gly Lys Tyr Leu Thr Leu Cys Glu Val Glu Val Tyr Gly Tyr Arg

150 156 162

gcc cca act gga gag aac ctg gcc atc caa gga aaa gcc aca cag tcc 582

Ala Pro Thr Gly Glu Asn Leu Ala Ile Glu Gly Lys Ala Thr Gln Ser

166 172 178

tca ttg ttt caa ttt ggc act gca tat aat gcc att gac ggg aat cat 630

Ser Leu Phe Glu Phe Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Ile Asp Gly Asn His

182 188 194

gcc agc aag tgg gaa gac ggc tcc tgt agt cac aca ata aac aac gtc 678

Ala Ser Lys Trp Glu Asp Gly Ser Cys Ser His Thr Ile Asn Asn Val

198 204 210

aac ccc tgg tgg cga ttg gat ctg ggc aaa acc cat aaa gtg ttt tct 726

Asn Pro Trp Trp Arg Leu Asp Leu Gly Lys Thr His Lys Val Phe Ser

214 220 226

gtt aag ata acc aac aca gat gaa aac cca gaa cga ctc gat gga gcg 774

Val Lys Ile Thr Asn Thr Asp Glu Asn Pro Glu Arg Leu Asp Gly Ala

230 236 242

gag att cga atc gga gat tct ctt gaa aca atg gca aca cac ata cca 822

Glu Ile Arg Ile Gly Asp Ser Leu Glu Thr Met Ala Thr Thr Ile Pro

246 252 258

cat gtg ctg tgg atc aca aat atc ccc ggc ggt gct gtt gaa ttc cag 870

His Val Leu Trp Ile Thr Asn Ile Pro Gly Gly Ala Val Glu Phe Gln

262 268 274

tgt aac ggg atg gac ggc cgc tac gtt acc gta gtc atc cca gga aga 918

Cys Asn Gly Met Asp Gly Arg Tyr Val Thr Val Val Ile Pro Gly Arg

278 284 290

gaa gag ttc ctg aca ctt tgt gag gtg gag gtg tat ggc tcc aga ctg 966

Glu Glu Phe Leu Thr Leu Cys Glu Val Glu Val Tyr Gly Ser Arg Leu

294 300 306

gat tag 972

Asp

310

gtctgaagaa gttcaaaatg cataagaaca tttggctttt actaactact catacaactg 1032

gaattacaac ttaagcttca atatagtccg aaaaaaagca tccaaaatca ttcctcgtga 1092

atcctagtat gacagtaatt gcattgtggg atttttttac ggaactattt agtgcataaa 1152

tataatcttt agccatgttt tgatttctaa tgcttttgtt gtattttctt ttttaatact 1212

aaacttttgt tgtactgtaa ccaactgctt cagctgaaaa actgaaatac aataaaatca 1272

ttgcaaaacc caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa

<210>2

<211>310

<212>PRT

<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)

<400>2

Met Met Arg Leu Ser Val Phe Leu Val Leu Leu Leu Ser Glu Thr Cys

1 7 13

Ser Ala Ser Thr Tyr Glu Asn Val Ala Leu Arg Gly Lys Ala Thr Gln

17 23 29

Ser Ser Arg Tyr Leu His Ala Phe Gly Gly Ala Tyr Asn Ala Ile Asp

33 39 45

Gly Asn Arg Glu Ser His Phe His Ser Gly Ser Cys Thr His Ser Ala

49 55 61

Glu Glu Thr Asn Pro Trp Trp Arg Val Asp Leu Leu Asp Ser Tyr Val

65 71 77

Val Thr Ser Ile Thr Ieu Thr Asn Arg Gly Asp Cys Cys Glu Gln Arg

81 87 93

Ile Ser Gly Leu Glu le His Ile Gly Asn Ser Leu Lys Asp Asn Gly

97 103 109

Ala Ser Asn Pro Met Val Gly Thr Ile Ser Glu Ile Gly Ala Ala Lys

113 119 125

Ser Phe Ser Leu Pro Phe Thr Asp Arg Val Glu Gly Arg Tyr Val Thr

129 135 141

Leu Val Leu Pro Gly Ser Gly Lys Tyr Leu Thr Leu Cys Glu Val Glu

145 151 157

Val Tyr Gly Tyr Arg Ala Pro Thr Gly Glu Asn Leu Ala Ile Glu Gly

161 167 173

Lys Ala Thr Gln Ser Ser Leu Phe Glu Phe Gly Thr Ala Tyr Asn Ala

177 183 189

Ile Asp Gly Asn His Ala Ser Lys Trp Glu Asp Gly Ser Cys Ser His

193 199 205

Thr Ile Asn Asn Val Asn Pro Trp Trp Arg Leu Asp Leu Gly Lys Thr

209 215 221

His Lys Val Phe Ser Val Lys Ile Thr Asn Thr Asp Glu Asn Pro Glu

225 231 237

Arg Leu Asp Gly Ala Glu Ile Arg Ile Gly Asp Ser Leu Glu Thr Met

241 247 253

Ala Thr Thr Ile Pro His Val Leu Trp Ile Thr Asn Ile Pro Gly Gly

257 263 269

Ala Val Glu Phe Gln Cys Asn Gly Met Asp Gly Arg Tyr Val Thr Val

273 279 285

Val Ile Pro Gly Arg Glu Glu Phe Leu Thr Leu Cys Glu Val Glu Val

289 295 301

Tyr Gly Ser Arg Leu Asp

305 310

Claims

1、一种花鲈凝集素基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。

2、一种花鲈凝集素基因，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。