CN102925448A - 一种文昌鱼类凝集素及其表达基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种文昌鱼类凝集素及其表达基因与应用，文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的类凝集素AmphiITLN239631可以结合多糖，制备细菌-多糖-凝集素识别的芯片，为快速鉴别和防治由细菌感染引起的海水养殖疾病提供理论依据。

Description

一种文昌鱼类凝集素及其表达基因与应用

技术领域

本发明涉及一种文昌鱼类凝集素及其表达基因与应用，特别是一种海洋模式生物文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

凝集素是一类能专一识别细菌表面多糖的蛋白，能通过凝集、包埋、调理吞噬等方式参与宿主中由病原菌引起的免疫防御反应。类凝集素（Intelectin）是一类新发现的凝集素，与传统的凝集素相比，类凝集素在结构上虽然并不具有传统的carbohydrate recognition domain(CRD)结构域,但在N末端具备fibrinogen βchain and γchain（FReD）的结构域，在C端有Intelectin结构域。最早被发现的成员是非洲爪蟾的XL35。单糖特异结合实验表明XL35在Ca²⁺存在的情况下特异性地结合D-呋喃半乳糖。小鼠有两个同源基因（intelectin 1/2），Northern blotting分析显示小鼠的intelectin1特异地表达在整个肠道，原位杂交结果显示其mRNA定位于小肠的潘氏细胞(paneth cell)。因此推测小鼠的intelectin1可能参与肠道的黏膜屏障，起着抵御微生物入侵或调节粘液物质等作用。而小鼠intelectin 2是诱导性表达，在正常情况下表达在回肠部位，但是感染后会扩展到空肠、回肠、盲肠、结肠。

迄今为止，在人中发现了两个intelectin的同源基因,HL-1和HL-2(Lee et al.,2001)。HL-1主要表达于心脏、小肠、胸腺，同时在卵巢、精巢、脾脏中也有少量表达，而HL-2则特异表达于小肠。HL-1能特异地识别一些重要的病原菌如分支杆菌(Mycobacterium)和诺卡氏菌(Nocardia)表面的呋喃半乳糖，因此推测HL-1可能参与机体对含呋喃半乳糖细菌的免疫反应。鲶鱼中也发现了两个intelectin同源基因，二者的表达模式差异很大：intelectin 1表达于鳃、肠道、头肾、肝脏、表皮、脾脏、胃和肌肉中，而intelectin 2主要表达于肝脏，在肠道和肾中表达量较低。两个基因在大肠杆菌的刺激下表达量都会上调，这也暗示了intelectins参与鲶鱼的免疫防御。此外，草鱼中也发现了intelectin同源基因，其中intelectin2分布于除肝脏之外的所有组织。另外，在海鞘(Halocynthia roretzi)，虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和七鳃鳗(Lethenteron japonicum)中也都发现了XL35的同源基因。研究证明intelectin基因家族在很多物种中广泛存在，而其序列上的保守性又暗示了它们在动物体内行使着某些很重要的功能。

我国拥有漫长的海岸线，海水养殖业的发展对于国民经济的可持续发展具有重要意义。然而，多年来病害严重地妨碍着海水养殖业的迅速发展。由于文昌鱼既具有脊椎动物的基本特征，又具有许多无脊椎动物的特征。研究文昌鱼的免疫防御机制和对病原感染应答的规律，能够为阐明海水养殖动物免疫防御机制提供资料，为开发海水养殖控制病害提供新方法、新思路，也为养殖水产动物病害的免疫防治技术提供理论依据。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋模式生物文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631及其表达基因与应用。

术语说明

1.PCR技术：链式聚合酶反应，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTPs进行体外扩增特定DNA片段的技术。

2.CDD分析软件：NCBI网站上提供的一种用来推测和分析特定氨基酸序列形成的结构域信息的软件。

本发明技术方案如下：

一种海洋模式生物文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631的表达基因，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

一种海洋模式生物文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组载体，插入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。该重组载体由pET-29b载体插入SEQ ID NO.1所示核苷酸序列获得。pET-29b载体购自德国Novagen公司。

一种重组细胞，转入了上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或上述重组载体。

上述在文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631的表达基因在凝集细菌中的应用。

本发明的文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631的表达基因，取材于青岛沙子口的成年文昌鱼（Branchiostoma belcheri tsingtauense），提取总RNA后，用TIANGEN的第一链反转试剂盒反转出第一链cDNA当做模板，以佛罗里达文昌鱼同源序列设计引物，利用PCR技术从青岛文昌鱼转录组中克隆得到的。对该基因的核苷酸序列进行了测定，测序结果表明所获DNA片段含有1334个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架即是编码类凝集素的表达基因，共编码396个氨基酸，命名为AmphiITLN239631。其在N末端具备一个collagenhefibrinogen βchain andγchain（FReD）的结构域，在C端具有类凝集素结构域，是文昌鱼类凝集素基因家族尚未报道的一条基因序列。

有益效果

1、本发明获得的海洋模式生物文昌鱼类凝集素的表达基因可以表达类凝集素AmphiITLN239631，有助于从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平生产开发新的细菌防治药物奠定基础。

2、本发明所述的类凝集素AmphiITLN239631可以凝集细菌，可以为海水养殖的病害控制提供新的方法和思路，尤其是在防治细菌类方面的浸染提供理论依据。

3、本发明所述的类凝集素AmphiITLN239631可以结合多糖，制备细菌-多糖-凝集素识别的芯片，为快速鉴别和防治由细菌感染引起的海水养殖疾病提供理论依据。

附图说明

图1、青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtauense成体总RNA提取的电泳图；

其中：1、DNA分子量标记(marker)，2、3、4、5青岛文昌鱼成体总RNA

图2、通过PCR扩增克隆的编码的AmphiITLN239631基因片段的电泳图；

其中：1、扩增的DNA片段；2、DNA分子量标记(marker)

图3、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的AmphiITLN239631电泳图；

其中：M、蛋白质分子量标记(marker)；1、含表达质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导前的总裂解液；2、IPTG诱导后的细菌总裂解液；3、镍柱亲和层析纯化后的蛋白图。

图4、荧光显微镜观察FITC标记的AmphiITLN239631的细菌凝集效应；

图5、Western blotting验证AmphiITLN239631结合细菌的结果图；

图6、AmphiITLN239631和细菌表面多糖结合的曲线图；

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

青岛文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631编码基因的克隆:

1.1青岛文昌鱼总RNA的的提取以及第一链cDNA的合成，提取合成步骤参照Takara和TIANGEN公司的相关试剂盒说明书。

1）将100mg新鲜组织（文昌鱼成体）尽量剪碎放入预1.5mlep管中。

2）加入1mlTrizol（Invitrogen），用研磨杵快速研磨组织至无大的组织块，室温静置5min，使组织充分裂解。此时样品可放入-80℃长期保存。

3)每1mlTrizol加入0.2ml的三氯甲烷（氯仿），加盖封严，剧烈震荡15s，室温静置15分钟。

4）4℃，1000g,离心15min。此时样品分为三层：下层的红色有机相，中间层及上层水相，RNA即留在上层水相中。

5）将上层水相转移入一干净的离心管中。

6）在水相中按0.5ml异丙醇/1mlTrinzol加入异丙醇，混匀，室温放置5min-10min。

7）4℃，12000g,离心10min,弃上清。RNA沉淀在管底呈凝胶状。

8)按1ml75%乙醇（DEPC水配制）/1mlTrizol试剂加入75%乙醇，温和振荡，悬浮沉淀。

9)4℃，8000g,离心5min，弃上清。

10)室温晾干或真空干燥5-10min。

11)用50μL DEPC水或TE缓冲液溶解RNA，进行下一步实验或在-70℃冰箱。

cDNA第一链反转：

以文昌鱼组织中提取的RNA为模板反转cDNA第一链，按以下顺序及量加入200μlEP管中：25mM MgCl₂,4μl；10×buffer，2μl；dNTP，2μl；RNase inhibitor，0.5μl；AMV反转录酶0.6μl；OligoT primer，1μl；模板，8μl；ddH₂O 2μl；共20μl，42℃，50min。

1.2引物设计与合成

根据数据库中已有的Branchiostoma floridae的AmphiITLN239631基因序列设计两条特异性引物：

AmphiITLN239631-F:5'GAAGGAATTGGTGTACTGGAGAGAG 3'

Amphi239631ITLN-R:5'ACGGTAAAAGAAGAGAACTGCTGAC 3’，

上述引物由上海博尚生物技术公司合成；

1.3利用PCR进行基因序列扩增

1）以AmphiITLN239631-F和AmphiITLN239631-R为引物，第一链cDNA为模板，做PCR扩增。

PCR反应条件为：95℃，5分钟；95℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，35个循环后；72℃，延伸10分钟。

2）对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1400bp的DNA片段。然后用TIANGEN公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增的DNA片段。

实施例2

基因序列测定

2.1．DNA片段与克隆载体连接

将回收DNA片段连接到Transgene公司的pEASY-T3载体上。连接反应体系：连接载体酶混合物1μl,外源DNA片段4μl，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2秒，把样品集中在管底，37℃连接5分钟。

2.2．按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

2.3．按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组载体pEASY-T3转至大肠杆菌DH5α感受态。

2.4．转化的大肠杆菌DH5α涂于含100μg/L氨苄青霉素的麦康凯培养基，37℃过夜培养，挑选白色转化子作为模板，用T7和SP6作为引物，通过菌落PCR验证白色转化子中质粒是否含有PCR扩增的DNA片段；T7和SP6的引物序列如下：

T7：TAATACGACTCACTATAGGG

SP6:ATTTAGGTGACACTATAG

2.5.将含有PCR扩增的DNA片段的转化子送上海博尚生物技术公司测序。因此，获得文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631的序列1334bp。序列如SEQ ID NO.1所示。通过NCBI网站的blastX软件分析发现其中含有一个1188bp的编码类凝集素AmphiITLN239631的开放阅读框架，共编码396个氨基酸。

实施例3

类凝集素AmphiITLN239631异源表达与纯化

3.1表达载体pET29b-AmphiITLN239631的构建

1)利用小剂量质粒提取试剂盒，按照说明书的步骤，从含有重组质粒pEASY-T3的转化子中提取重组质粒pEASY-T3-AmphiITLN239631.

2)根据测序结果设计两条特异性引物：

pET29b-Amphi239631-F：5'GAATTCCATATGACGCCCGAGG 3'和

pET29b-Amphi239631-R：5’CCGCTCGAGACGGTAAAAGAAG，

上述引物由上海博尚生物技术公司合成。

3)利用PCR进行基因序列扩增，以pET29bAmphiITLN239631-F和pET29b-AmphiITLN239631-R为引物，以重组质粒pEASY-T3-AmphiITLN239631为模板，做PCR扩增。PCR反应条件为：95℃，5分钟；95℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，35个循环后，72℃，延伸10分钟。

4)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1400bp的DNA片段。

5)用限制性内切酶NdeI和XhoI对回收片段和质粒pET29b进行双酶切。酶切反应体系如下：酶切缓冲液2μl；内切酶BamHI 1μl；内切酶XhoI 1μl；回收DNA片段10μl；补加ddH2O至20μl。酶切缓冲液2μl内切酶BamHI 1μl内切酶XhoI1μl；pET29b 6μl；补加ddH2O至20μl。放在37℃水浴中反应2个小时。对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用TIANGEN公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

6)将经过双酶切的AmphiITLN239631基因片段连接到pET29b载体上。连接反应体系：连接酶Buffer 4μ；载体pET29b 5μl；AmphiITLN239631基因片段10μl，T4连接酶1μl，补加ddH2O至20μl。盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2秒，把样品集中在管底，16℃摇床中连接过夜。

7)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态；

8)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组载体pET29b转至大肠杆菌DH5α感受态；

9)将转化后的大肠杆菌DH5α涂于含100μg/mL卡纳青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

10)在平板上挑取单菌落，接于5mL含100μg/mL卡纳青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

11)收集3mL菌液，12000g离心2min，得到菌体，用试剂盒提取重组质粒pET29b-AmphiITLN239631。置于-20℃保存。

3.2表达载体pET29b-AmphiITLN239631转化到大肠杆菌BL21(DE3)中

1)按《分子克隆实验指南》中制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

2)按《分子克隆实验指南》中的热激转化方法将连接好的重组载体pET29b-AmphiITLN239631转至大肠杆菌BL21感受态；

3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/mL卡纳青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

3.3AmphiITLN239631基因在大肠杆菌中诱导表达与纯化

1)在平板上挑取单菌落，接于20mL含100μg/mL卡纳青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

2)1％接种量转接到含100μg/mL氨苄青霉素的新鲜LB培养基中，37℃培养至菌浓度OD0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，继续在15℃摇床培养20h；

3)收集经过IPTG诱导表达的500mL LB培养液，12000g离心10min，收集菌体；

4）用50ml重悬缓冲液重悬菌体，在冰浴中超声破碎（超声3s，间歇6s，共51次，电压为560V）。

5）破碎好的液体经14000rpm,4℃，离心50分钟，收集到的上清即为蛋白粗提液。

6）包涵体复性：

Buffer A：50mM Tris·HCl(pH8.0),5mM EDTA

Buffer B：50mM Tris·HCl(pH8.0),5mM EDTA，2M脲

变性液：0.1M Tris·HCl(pH8.0),10mM DTT，8M脲

复性液：0.1M Tris·HCl(pH8.0),5mM EDTA，5mM Cysteine

（ⅰ）包涵体使用20mL buffer A悬起，10000rpm 20min 4oC离心去上清，重复一次。

(ⅱ)包涵体使用20mL buffer B悬起，10000rpm 20min 4oC离心去上清，重复一次。

(ⅲ)添加20mL变性液溶解，37℃快摇1hr，10000rpm  20min 4oC取上清。

(ⅳ)上清液在50倍体积的透析液中4℃透析16hr以上，重复一次。

(ⅴ)复性液410000rpm离心10min去除沉淀，复性液与沉淀使用SDS-PAGE检测。

7)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

8)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得的AmphiITLN239631(图3)。

用20mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液透析3-4次。最后置于-20℃保存，备用。

实施例4

文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631的性质测定

4.1细菌凝集作用

1)取过夜培养的细菌（Escherichia coli，大肠杆菌和Staphylococcus aureus金黄色葡萄球菌）约5ml，10000g，离心1分钟；

2)弃上清，用重悬液悬起细菌，每毫升细菌加入50μlFITC溶液（10mg/ml,DMSO）；

3)混匀后在37℃避光孵育1小时，每隔15分钟上下颠倒混匀一次；

4)1000g,离心1分钟；

5)弃上清，用TBS溶液清洗，重复四次，直至上清液无色即可；

6)按照所需浓度稀释细菌，加入适量蛋白，37℃孵育过夜；

7)观察统计分析结果。

4.2细菌结合作用

1)1×10⁷各种不同的细菌与以目的蛋白在含有10mMβ-ME的超声缓冲液4℃振荡孵育l h；

2）用孵育所用的缓冲液洗涤3～5次，6000rpm离心2分钟；

3）尽量除去上清液，加入20μL的缓冲液和适量的SDS蛋白上样缓冲液，煮沸10min，离心，上清点样进行后用HIS标签抗体进行Western blot分析。

4.3多糖结合

1）包被：用PBS溶液(pH7．4)溶解两种不同的细胞壁多糖组分（肽聚糖，来源于枯草芽孢杆菌；脂多糖，来源于大肠杆菌）。然后在每一个聚苯乙烯微量滴定板的反应孔中加入100μl溶有终含量为20μg各组分的PBS溶液(pH7.4)，4℃过夜。同时用不加入糖组分的PBS溶液做阴性对照；

2)洗涤：次日，弃去孔内溶液，刚开始用100μl洗涤缓冲液洗1次，然后用200μl洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；

3)封闭：加入200pl 5％BSA(牛血清白蛋白)4℃封闭过夜。次日洗涤；

4)加样：在反应孔中加入不同浓度的纯化的融合蛋，4℃孵育过夜或者置于湿盒中于37℃孵育1h。然后洗涤(同时做空白孔)；

5)加酶标一抗：于各反应孔中，加入100新鲜的用5％的BSA稀释的小鼠His单克隆抗体(1：50，000)，置于湿盒中于37℃下孵育1h，洗涤；

6)加酶标二抗：于各反应孔中，加入100μl新鲜的用5％的BSA稀释的羊抗小鼠HRP(活化辣根过氧化物酶)标记的二抗(1：20000)，置于湿盒中于37℃孵育1h，洗涤；

7)加底物液显色：于各反应孔中，加入50μlTMB显色液，从加入第一个孔开始记时。全部加完后避光37℃孵育10分钟；

8)终止反应：从第一孔开始计时后10分钟，每孔按照加入底物缓冲液的顺序加入50μl终止液；

9)结果判定：在酶标仪上于450nm处，以空白对照孔调“0”后测各孔的OD值。

5.结果分析

利用Trizol法提取青岛文昌鱼Branchiostoma belcheri tsingtauense成体总RNA提取（图1）。通过PCR扩增类凝集素AmphiITLN239631的表达基因片段（图2）。经过测序获得编码类凝集素AmphiITLN239631基因的核酸序列。类凝集素AmphiITLN239631的表达基因含有一个1188bp的开放阅读框架，共编码396个氨基酸。利用生物信息学软件分析，在N末端具备一个collagenhe fibrinogen βchain and γchain（FReD）的结构域，在C端具有Intelectin结构域。将类凝集素AmphiITLN239631的表达基因在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的类凝集素AmphiITLN239631（图3）。研究发现重组蛋白只有在钙离子存在的情况下，可以凝集金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，且二者凝集程度类似，这些揭示了类凝集素AmphiITLN239631可以作为一种钙离子依赖的凝集素发挥细菌凝集效应（图4）。为了深入探讨细菌凝集的机制，我们设置了重组蛋白和细菌的结合实验。发现在钙离子存在或者缺失的条件下，类凝集素AmphiITLN239631都可以结合金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，且二者并无明显差异(图5)。对类凝集素AmphiITLN239631和细菌细胞壁表面多糖成分（肽聚糖和脂多糖）结合进行了非线性分析，结果表明类凝集素AmphiITLN239631对PGN的亲和度和反应速率和LPS并无明显差异（图6）。这和以上结果相对应，暗示了文昌鱼类凝集素可能通过识别细菌细胞壁表面的多糖分子，从而引发细菌的凝集，并参与文昌鱼的免疫防御。因此类凝集素AmphiITLN239631是文昌鱼Intelectin基因家族尚未报道的一条类凝集素基因序列。

Claims (6)

1.一种海洋模式生物文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种海洋模式生物文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体，插入了SEQ ID NO.1所示核苷酸序列。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，该重组载体由pET-29b载体插入SEQID NO.1所示核苷酸序列获得。

5.一种重组细胞，转入了上述SEQ ID NO.1所示核苷酸序列或上述重组载体。

6.权利要求1所述文昌鱼类凝集素AmphiITLN239631的表达基因在凝集细菌中的应用。

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