CN101280021B

CN101280021B - 抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白vp28-cd及制备和用途

Info

Publication number: CN101280021B
Application number: CN2008100477763A
Authority: CN
Inventors: 孟小林; 徐进平; 王健; 鲁伟; 孟海洋; 王岚
Original assignee: Guangxi Tianchi Halobios Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Guangxi Tianchi Halobios Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2008-05-20
Filing date: 2008-05-20
Publication date: 2011-02-09
Anticipated expiration: 2028-05-20
Also published as: CN101280021A

Abstract

本发明公开了一种抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白VP28-CD及制备和应用，一种分离蛋白，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，菌株为重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(pET-32a-VP28-CD)，CCTCC No：M208032，从对虾体中提取WSSV并通过PCR获得VP28基因；通过大肠杆菌JM109诱导家蚕，提取其脂肪体总mRNA，通过RT-PCR得到总cDNA，再PCR获得家蚕抗菌肽Cecropin D成熟肽基因，其上游插入了酸水解位点天冬氨酸-脯氨酸；然后构建重组质粒pET-32a(+)-VP28-CD。将重组质粒pET-32a(+)-VP28-CD转化大肠杆菌BL21(DE₃)，在IPTG的诱导下，融合蛋白VP28-CD以可溶的形式得到高效表达，该融合蛋白在制备治疗或预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。

Description

抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白VP28-CD及制备和用途

技术领域

本发明涉及基因生物工程技术领域。更具体涉及一种重组融合蛋白VP28-CD亚单位疫苗，同时还涉及一种大肠杆菌基因工程菌株的制备方法，具体涉及构建和高效表达可溶对虾白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28和家蚕抗菌肽Cecropin D成熟肽(CD)融合蛋白的基因工程菌株；涉及酸水解位点天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)的插入；还涉及上述菌株所表达的一种双功能融合蛋白在对虾抗WSSV及抑杀其它病原微生物中的用途。

背景技术

20世纪80年代以来，世界沿海各国的对虾养殖业蓬勃发展，随着对虾养殖业的企业化生产，其病害也日益突出，特别是对虾病毒性传染病已成了阻碍这一产业发展的重要因素。我国是全球最大的对虾生产国之一，1993-1994年我国对虾病毒病暴发流行，年产量减少70％以上，给我国对虾养殖业造成数十亿元的经济损失(陈宪春.世界性虾病蔓延及我国虾病防治进展[J].中国饲料，1995，11：10-11.)。近年来的对虾白斑综合征病毒(W SSV)、黄头症病毒(YHV)和桃拉综合征病毒(TSV)等病毒性传染病在世界各地广泛流行，除给对虾养殖业带来严重经济损失之外，还对海洋资源的可持续发展造成巨大威胁。其中WSSV是迄今为止对对虾养殖业危害性最为严重的病原体之一。

WSSV于20世纪90年代初首发于台湾，至今已席卷世界各国的对虾养殖地区，造成了巨大的经济损失。1993年5～8月WSSV在我国大陆沿海从南到北的养殖场暴发，日本等亚洲国家的对虾养殖场也相继暴发了此病。目前，在亚洲已报道的该病毒的流行国家和地区包括朝鲜、泰国、韩国、印度尼西亚、越南、马来西亚、印度、斯里兰卡、孟加拉国、中国大陆沿海及台湾省等。1995年，美国德克萨斯州对虾养殖场出现白斑综合征病毒，并在西半球的其它地区相继暴发。至此，WSSV在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成几百亿元的经济损失，成为威胁对虾养殖业的主要疾病。1995年，国际兽疫局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。

WSSV是一种有囊膜的环状双链DNA病毒，呈螺旋状，属于Nimaviridae科，Whispovirus属，是已知最大的动物DNA病毒。其病毒粒子直径约65～70nm，长约300nm，呈现卵圆形至短杆状，无包涵体，在末端有一尾状延伸，囊膜内包裹杆状的呈垂直螺旋带条纹的核衣壳。目前，普遍认为WSSV存在水平传播(经口感染或接触感染) 及垂直传播(经卵传递给子代)两种传播途径。近年来，国内外一些学者大量投入WSSV分子水平的研究，鉴于其基因组序列与基因库中已知基因的同源性很低，国际病毒分类委员会已将WSSV确定为一种新的无脊椎动物病毒。Van等报道WSSV基因组为29 2967bp(AF369029)，其大部分基因功能都未知，目前被鉴定的结构蛋白基因至少有18个，其中已确定的囊膜蛋白有5个(VP28，VP26/P22，VP19，VP466及VP281)，而VP28是其主要结构蛋白之一，由ORF1所编码，其N端有一高度疏水的α螺旋跨膜区域，是位于病毒囊膜的主要抗原蛋白。已有研究证据表明，对虾免疫系统不仅存在非特异性免疫，而且对WSSV也存在一定的特异性免疫应答。尽管对WSSV感染引起的免疫反应分子机制研究甚少，但目前已有报道WSSV主要抗原蛋白可能在感染过程中的作用。Van等通过用WSSVVP28抗血清对斑节对虾(Penaeus monodon)的体内中和试验表明，囊膜蛋白VP28对机体具有免疫保护性，推测可能是由于VP28阻断了病毒与宿主细胞受体的结合，从而抑制病毒囊膜与细胞膜的融合；而Witteveldt等(Witteveldt J，Cifuentes C C，Vlak J M，et al.Protection of Penaeus monodon against White Spot Syndrome Virus by oral vaccination[J].JVirol，2004，78(4)：2057-2061.)实验显示VP28的免疫保护力可达3周，提示VP28可能在WSSV感染后还诱导产生类血清中和因子。龙燕等(龙燕，等。对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28的表达及其抗病毒感染作用[J]。中国病毒学，2006，21(2)：178-180.)将纯化的VP28注射和投喂螯虾均明显提高了螯虾的抗WSSV感染力的能力，这进一步证实了WSSV的结构蛋白可以被螯虾的免疫系统所识别。

WSSV的宿主非常广泛，已发现和确定的有近40种。世界上所有的人工养殖对虾种类、大部分野生虾蟹类等都是WSSV的宿主。根据虾蟹感染WSSV后的表现，这些宿主可分为两类：敏感载体(acute carriers)和可能载体(potential carriers)。主要养殖对虾斑节对虾(Penaeus monodon)、日本囊对虾(Marsupenaeus aponicus)、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)、长毛明对虾(F.penicillatus)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)、刀额新对虾(Metapenaeus ensis)及野生短钩对虾P.semisuleatus、脊尾白虾(Exoplaemon carinicauda)体内均能检出WSSV阳性，它们是WSSV的敏感载体。养殖对虾等敏感载体除自身对WSSV敏感外，其喜好残食的生活习性进一步加速了WSSV的横向传播。野生虾E.orientalis、Trachyenaeus cuvirostris、M.ensis、沼虾Macrobrachiumsp、克氏原螯虾Procambarus clarkii，野生蟹子Calappa lophos、Portunussanguinolentus、Charybdis granulata、C.feriata、Hemigrapsus sanguineus和野生龙虾Panulirus ornatus、P.longipes、P.penicillatus等虽不呈WSSV阳性，但它们可被WSSV感染，且许多被感染个体不引起疾病症状，它们是WSSV的可能载体。野生虾、蟹等WSSV的无症状携带者尽管在水产上不重要，但它们广泛分布于对虾养殖场，它们的可感染性在WSSV的水平传播中起着重要作用。关于卤虫、轮虫等生物在传播WSSV中的作用近几年也有报道。

对虾白斑综合症(white spot syndrome，WSS)是由WSSV引起的以感染对虾甲壳内侧出现白色斑点为主要特征的暴发性传染病。WSSV的感染力极强，WSS的发展分3各阶段。初期：病虾游动缓慢，拒食，偶尔浮出水面；中期：病虾静卧水底，肠胃空虚，头胸甲和腹甲被揭开，且不粘连表皮，在皮下、甲壳及附肢出现直径为0.5～2mm大小不等的白色斑点；后期：病虾对外界刺激反应迟钝，大多虾体微红，腹节肌肉略白，血淋巴稀薄不凝固，在3-7日内致死率高达90-100％。通过对感染病毒后的组织进行病理学分析发现，对虾的鳃、胃、淋巴器官等受到严重破环。病毒感染早期的特征表现为宿主的细胞核肿大，染色质边移。超薄切片观察发现大量病毒粒子集中在被感染的细胞核内。

WSSV目前尚无有效的防治方法。对虾和其它无脊椎动物一样，缺乏脊椎动物特异的抗原/抗体免疫反应机制，因此寄希望于通过免疫来控制WSS是不切实际的。提高对虾机体的抗病能力，优化虾池生态环境，改善对虾养殖环境，加强科学饲养管理，是目前防治病毒感染的最有效手段。有报道多糖、生物碱、酮类、有机酸等能激活免疫系统，增强对虾的抗病能力，如Itam i等(Itam i T.Enhancement of disease insistence of Kurumashrimp penaeu japonicus，after o ral adm inistration of pep tidoglycan derivedfrom Bifidobacterium themoph ilum[J].A quaculture，1998，164：277-288.)利用从细菌提取的肽聚糖喂对虾，发现对虾血淋巴的免疫活性和抗毒力得到明显的提高；1995年D irekbu sarakom等(D irekbusarakom S.Effect of Phyllanthus spp.against yellow-head baculovirus infection in black tiger shrimp，penaeusmondon[M].In：Diseases in A sian A quaculture II.M Shariff，J.R.A rthur R P Subasinghe(eds.)，F ish Health Section，A sian Fish-eries Society，Manila，1995：81-88.)，李春猛(李春猛.中国对虾免疫力的增强途径[D].山东青岛：青岛海洋大学，1995：26-35.)利用口服多糖或中草药能使对虾抗病力提高，王安利等也报道(王安利，王维娜.对虾病毒性流行病防治新技术研究[A].首届世界华人虾类养殖研讨会论文等.北京海洋出版社，1998：42-49.)采用免疫增强剂提高对虾苗和对虾免疫力，但均成本较高，劳动量大，技术复杂。也有报道通过转基因的方法将某种基因导入虾体，培育优质抗病的对虾新品种，如刘志毅等(刘志毅，等。用基因枪将外源DNA导入中国对虾。中国通报。2000，45(23)：2539-2544)利用基因枪的方法转移了绿色荧光蛋白基因作为报告基因的重组抗对虾WSSV核酶基因的质粒pGDNA-RZI，成功得到了转绿色荧光蛋白基因的中国对虾个体，但其技术要求高，效率较低。也有人发现，通过免疫病毒基因重组蛋白可以诱导对虾产生抗病保护效应。如Witteveldt等(Witteveldt J，Cifuentes C C，Vlak J M，et al.Protection of Penaeusmonodon against White Spot Syndrome Virus by oral vaccination[J].JVirol，2004，78(4)：2057-2061.)用E.coli表达重组WSSV囊膜蛋白VP28口服免疫斑节对虾，7天后浸浴攻毒免疫保护率达77％。

抗菌肽(antimicrobial peptides)是在诱导条件下，昆虫产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性多肽类物质的总称，具有“传统抗生素”无法比拟的优越性：不会诱导抗药菌株的产生，有希望成为新一代抗菌剂。1975年瑞典科学家G.Boman等人(STEINERHD，HULTMARKA，ENGSTR¨OMH，etal.Sequence and specificity oftwoantibacterial two antibacterial proteinsin volvedin insectimmunity[J].Nature，1981，292：246-248.)从惜古比天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名为cecropin。此后，许多抗菌肽相继被分离、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代，有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来，在继续对大型经济昆虫进行研究的同时，又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物，抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热点，其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受重视。目前已发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于生物界，包括细菌、动植物和人类。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成，在机体抵抗病原的入侵方面起着重要的作用，更被认为是缺乏特异性免疫功能生物的重要防御成分。抗菌肽具有广谱杀菌作用，大多数对革兰氏阳性菌有较强的杀灭作用，有些则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起作用。对某些真菌、原生动物，尤其对耐药性细菌有杀灭作用，并能选择杀伤肿瘤细胞，抑制乙型肝炎病毒的复制。

迄今为止从不同生物体内诱导的抗菌肽已不下200种，仅从昆虫体内分离获得的就多达170余种。根据抗菌肽的结构特点，可将其分为5类：(1)单链无半胱氨酸(Cys)的抗菌肽，或由无规则卷曲连接的两段a-螺旋组成的肽。该类包括天蚕素Cecropins，Magainins等。Magainins最初是从非洲爪蟾的皮肤中发现的，它是爪蟾的皮肤在一定的环境压力下分泌出的抗感染和促进伤口愈合的成分，由两个紧密相连的肽链组成，每一个肽链有23个氨基酸，低浓度便可抑制许多细菌和真菌生长(Zasl of M，et al.Proc Natl Acad SciUSA，1987，84：5449-5455)。(2)富含某些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸(Pro)或甘氨酸(Gly)残基的抗菌肽。如从猪肠内分离的抗菌肽PR39中Pro含量占49％[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly(BA gerberth，JYLee，etal.European Journal of Biochemistry，1991，202：849～854.)。(3)含一个二硫键的抗菌肽，该二硫键的位置通常在肽链C端。如爪蟾皮肤细胞中产生的Brevinins(陈留存，王金星.生物工程进展，1999，19(5)：55-59.)。(4)有两个或两个以上二硫键，具有β折叠结构的抗菌肽。如绿蝇防御素(Phormindefensin)，分子内有6个Cys形成3个分子内二硫键，肽链C末段是带有拟β转角的反向平行的β片层(饶贤才，胡福泉，等.生命的化学，2001，21(5)：357～359.)。实验证明，分子中的二硫键在其抗菌作用中至关重要。(5)由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具有抗菌活力的肽。

20多年来，人们对抗菌肽已进行了比较系统的理论和应用研究，其作用及机理如下：

抗菌肽的抗菌作用及其机理：抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道，造成细菌细胞膜结构破坏，引起胞内水溶性物质大量渗出，而最终导致细菌死亡。抗菌肽分子首先结合在质膜上，接着其分子中的疏水段和两亲性α-螺旋也插入到质膜中，最终通过膜内分子间的相互位移，抗菌肽分子聚集形成离子性通道，使细菌失去膜势而死亡。但是Gazit(Gazit E，et al.[J].Biochem is try，1994，33(35)：10681-10692.)等得出的实验结果表明，抗菌肽只是结合到了单位膜的表面上，并未插入膜中，更未形成通道。然而，抗菌肽的作用靶部位是细菌细胞质膜，以及抗菌肽的作用结果是导致细菌细胞质膜通透性增大等基本内容是确切无疑的，这也正是抗菌肽与青霉素等传统抗生素对细菌作用机制不同的本质所在。

抗菌肽的抗病毒作用及其机理：研究发现烟芽夜蛾幼虾的血淋巴对6种DNA、RNA病毒有明显的抑制作用，使病毒感染力迅速降低，而且这种抗病毒活性具有广谱性。Mariam(Mariam E.et al.[J].International J of Antimicrobial Agents，1999，13：57-60.)试验表明来源于爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins类抗菌肽具有抗疱疹病毒-HSV的作用，还发现人的嗜中性粒细胞防御素(HNP-1)对一种疱疹病毒有抑制作用。此外，蜂毒素和天蚕素也可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达，从而抑制减少HIV-1的增殖。这表明抗菌肽对于当今人类的顽症——艾滋病也有抑制作用。

抗菌肽的抗寄生虫作用及其机理：抗菌肽可以有效地杀灭产生人类及动物寄生虫病的寄生虫，如疟疾、Chagas氏病、莱什曼病等。目前发现一种合成的天蚕素-蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫有损伤作用，起作用的靶目标是细胞质膜，它可以快速降低H-OH+的通透性，破坏膜电势，质膜形态也受到损坏。Shahabuddin(Shahabuddin M，et al.[J].ExperimentalParasitogy，1998，89(1)：103-112.)研究发现昆虫抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的不同时期有不同的作用，主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期造成明显的损伤。

抗菌肽对肿瘤细胞作用及其机理：国内外已对抗菌肽杀伤肿瘤细胞的作用进行了广泛研究，发现抗菌肽对体外培养的癌细胞的作用主要是使癌细胞膜上形成孔洞，内容物外泄，线粒体出现空泡化，嵴脱落。核膜界限模糊不清，有的核膜破损，核染色体DNA断裂，并抑制染色体DNA的合成，细胞骨架也受到一定程度的损伤(王芳，等.[J].生物化学与生物物理进展，1998，25(1)：64-67.贾红武，等.[J].蚕业科学，1996，22(4)：62.)。通过对荷瘤小鼠的研究证明，抗菌肽能显著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的积累；对S180肉瘤和U14宫颈癌的抑瘤率亦达30％-50％(许玉澄，等.[J].动物学研究，1998，19(4)：263-268.)。抗菌肽还可以调动机体的免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌瘤的入侵。

抗菌肽的天然产量低，合成或从机体中提取步骤复杂、产率低、价格相当昂贵，利用基因工程技术生产抗菌肽具有重要意义。抗菌肽所携带的碱性氨基酸使其对蛋白酶非常敏感，必须采用融合表达策略以抵消其碱性并降低其对宿主细胞的毒性。谢维等合成了家蚕抗菌肽CMIV基因，并将其克隆到金黄色葡萄球菌A蛋白和IgG亲合的结构域ZZ的融合表达载体中，得到Pezz318-CMIVV质粒，以此质粒转化E.coliHB101，得到ZZ-CMIV融合表达的蛋白，用CNBr切割后，得到CMIV肽。李秀兰等(李秀兰等.家蚕抗菌肽CMIV基因结构改造及表达产物的研究[J].中国生物化学与分子生物学报，1999，15(3)：387-391.)对天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50％的改动，根据E.coli偏爱的密码子人工合成了肽基因片断，重组到测序载体，再将此片断重组到表达载体Pet-28上进行表达，融合蛋白经CNBr裂解后，具有与天然抗菌肽相同的生物活性。吴映雅等将柞蚕抗菌肽D基因连接在牛成纤维细胞生长因子cDNA的上游，在酵母中成功地得到了表达，表达产物具有抗菌活性和牛成纤维细胞生长因子的抗原性。Kevin等(Kevin L P，Melissa H B，Rober E W.Recombin ant DNAprocedures for producing small antimicrobial cationicpeptide inbacteria[J].Gene.1993，134：7-13.)将HNP(human neutro philpeptide 1)和CEME(synthet iccecropin/melittinhybrid)分别与GST(glutathione-S-trans ferase)、ORRF、IgG结合序列及SPA(staphylococcal protein A)在E.coli或S.aureus中融合表达，结果在S.aureus中虽实现了与SPA的融合分泌表达，但表达产量较低；Zhang等(ZhangL，Falla T，Wu M，et al.Determints of recombinant production of antimicrobialcationic peptides and creation of peptide variant inbacteria[J].Biochem Biophys.Res.Commun.1998，247：674-680.)选择RepA蛋白的序列作为抗菌肽的融合表达伴侣，并插入Histag等序列作为纯化亲和位点，实现了在E.coli中的融合表达。Christsnen B等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一个供体抗菌肽的活性都高。

抗菌肽和干扰素、补体一样是机体非特异性天然防御系统的重要组成部分。机体受损伤或病原微生物入侵时，能迅速产生抗菌肽来杀伤入侵者，它对正常真核细胞几乎没有作用，而且许多抗菌肽在100℃加热10min条件下仍能保持一定活力，且对较大的离子强度和较低或较高的pH都有较强的抗性。另外，因为抗菌肽的合成速度非常快(假定核糖体上肽键合成速率不变，抗菌肽的产生比IgM要快100多倍)，而且小肽的扩散比大的蛋白质和免疫细胞更加迅速，作用更显灵活，所以Boman曾指出，抗菌肽是机体的一种理想的一线防御物。与普通抗生素相比，抗菌肽的“抗菌谱”更广，除了抗细菌外，有的抗菌肽还能作用于真菌、原虫、有包膜的病毒及癌细胞(对癌细胞的选择性作用可能与其细胞骨架的改变有关)，同时能加速免疫和伤口愈合过程。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒、抗感染等方面具有良好的应用前景。更为重要的是，由于抗生素的滥用导致菌株产生了抗性，人们需要寻找新的抗菌药剂。抗菌肽这种从生物体中获得的物质恰巧具有独特的抗菌机理，不是像一般的抗生素那样通过阻断生物大分子的生物合成来发挥作用，因而极有希望开发成为一类新型的广谱高效抗菌药物。

然而，由于抗菌肽分子小，分离提纯存在一定的困难，故天然资源有限。化学合成和基因工程法获得抗菌肽是主要手段，但化学合成抗菌肽成本高，而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因，则可能对宿主有害而不能获取表达产物。

家蚕抗菌肽Cecropion D，最早从家蚕免疫血淋巴中分离得到的高效抗菌肽。其具有热稳定性，水溶性好，对较强的离子强度和较高或较低的PH都有较强的耐受性。家蚕抗菌肽 CD成熟肽为阳离子小蛋白，二级结构上主要含两个α-螺旋。根据文献(Zhang L，Rozek A，Hancock R E W.Interaction of cationic antimicrobial peptides with model membranes[J].J Biol Chem，2001，276：35714-35722.)报道，阳离子抗菌肽蛋白最主要的作用机制为：通过其两亲性α-螺旋上正电荷与细胞质膜磷脂分子上负电荷之间的静电吸引而结合聚集在质膜上，随后抗菌肽分子中的疏水段C端(酰胺基)α-螺旋插入到疏水的胞膜中央，双亲的α-螺旋留在质膜表面，打乱了质膜上蛋白质和脂质原有的排列秩序，使得膜外正电荷增多，超过阈值时导致膜去极化从而破坏病毒，肿瘤细胞或细菌质膜结构，引起胞内水溶性物质大量渗出，从而最终导致病毒，肿瘤细胞和细菌死亡。李伟灿等(李伟灿，等。家蚕抗菌肽CD高效表达及其抗BmNPV感染作用[J].中国病毒学，2006，21(6)：589-593)用重组家蚕抗菌肽通过抑菌实验测得其对于革兰氏阴性及阳性菌均有抑菌活性，并将其与家蚕病毒BmNPV作用混合4h后，一起投喂家蚕，发现病毒感染力有明显降低，说明其具有抗病毒感染作用。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，该菌株可以表达对虾白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28和家蚕抗菌肽成熟肽CD基因工程融合蛋白(VP28-CD)。其优点是表达量大且可溶，易于工业化生产，成本低，且安全性好。

本发明的另一个目的是在于提供了一种重组融合蛋白VP28-CD亚单位疫苗的制备方法，方法易行，操作简单，不仅能够预防对虾白斑综合征(WSS)，还能够抑杀抗其它病原微生物。

本发明的再一个目的基因工程融合蛋白在制备治疗或预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。

本发明提供的融合蛋白VP28-CD能有效的防治对虾白斑综合征(WSS)。前已述及，WSSV的主要囊膜蛋白之一VP28能阻断WSSV与宿主细胞受体结合，从而提高对虾抗WSSV感染的能力；家蚕抗菌肽能抑杀病毒和细菌等病原微生物。通过注射、口服应用于对虾养殖试验，结果证明VP28和CD共同作用可以明显提高对虾的抗WSSV感染的能力。本发明的创新之处在于，本发明利用大肠杆菌表达WSSV囊膜蛋白VP2B和家蚕抗菌肽成熟肽(CD)的融合蛋白，旨在预防并治疗WSS。通过基因工程生产的VP28-CD融合蛋白可以作为抗WSS病源微生物药物应用于对虾养殖业，能够明显提高对虾的免疫力和抗病力。本发明另一个创新之处在于，在融合蛋白之间插入了酸水解位点天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)，在酸性、高温条件下或在对虾的胃里分离开来，并保持了其各自的天然构像，能更有效地行使其各自的功能。

抗菌肽目前还没有直接应用于养殖业，但抗菌肽独特的作用机理不易产生耐药性的特性十分具有吸引力。本发明首次将家蚕抗菌肽应用于对虾中，并创造性地在VP28和将家蚕抗菌肽成熟肽之间插入酸水解位点，使可溶性融合蛋白在酸性、高温条件下或在对虾的胃里分离开来，并保持了其各自的天然构像，能更有效地行使各自的功能从而达到防治WSS的目的。而且本发明公开的基因工程菌株的构建方法可应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。

本发明的技术方案如下：

本发明的技术要点之一是表达基因工程融合蛋白VP28-CD的大肠杆菌基因工程菌株的构建及诱导表达。

本发明所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详述的请参见《精编分子生物学试验指南》F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编。

利用大肠杆菌基因工程菌株制备融合蛋白的方法步骤如下：

1.WSSV的vp28基因的制备

(1)WSSV病毒基因组的制备：在冰上取患病对虾的鳃、胃和心脏，冰浴匀浆，然后加入蛋白酶K(100ug/ml)，在沸水(100℃)中煮15分钟，立即冰浴5分钟，12000rpm离心10分钟，取其上清置4℃保存。

(2)PCR扩增vp28基因：根据GenBank中已经发表的WSSV(GenBank：EU414753)的序列设计PCR引物，以上述上清作为模板DNA，PCR扩增目的基因vp28，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体(由TIANGEN公司购置)中，转化大肠杆菌JM109(在INVITROGEN公司购置)，挑取单菌落培养，用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序得到的阳性克隆子为包含vp28基因的大肠杆菌，命名为pGEM-T-vp28。

2.家蚕抗菌肽成熟肽基因的制备

(1)家蚕抗菌肽Cecropin D成熟肽基因的制备：通过大肠杆菌JM109诱导家蚕，按照RNA提取试剂盒的方法提取其脂肪体总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，根据GenBank家蚕抗菌肽Cecropin D(GenBank：NM 001043368)的cDNA序列，设计并合成引物，以上述得到的总cDNA为模板，PCR扩增得到Cecropin D基因，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pUCm-T载体(在TIANGEN公司购置)中，挑取单克隆用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，根据Cecropin D基因的成熟肽序列，去掉信号部分和将C末端的甘氨酸突变成天冬酰胺，并插入酸水解位点Asp-Pro，重新设计引物(上游引物：AAGCTT

GGCAACTTCTTCAAGGATCT(划线处为Hind III位点，方框内为Asp-Pro酸水解位点)，下游引物： CTCGAG

GTTTTGTCCGAGAGCTTTTGCT(划线处为Xho I位点，粗体为终止密码子，将C末端甘氨酸突变成天冬酰胺)。以上述pUCm-T-cecropin D质粒为模板，PCR扩增cd基因，将PCR产物组装入pGEM-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含cd基因的大肠杆菌，用于基因的增殖和保藏；

3.融合基因的制备及表达载体的构建：首先同时双酶切含cd基因的重组质粒和含vp28 基因的重组质粒，胶回收含cd基因的片段和开环pGEM-T-vp28片段，4℃连接后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子命名为pGEM-T-vp28-cd，再同时双酶切重组质粒pGEM-T-vp28-cd和质粒pET-32a(+)(在INVITROGEN公司购置)，胶回收含vp28-cd基因的片段和开环pET-32a(+)片段，16℃连接后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子是vp28-cd融合基因的大肠杆菌，为pET-32a(+)-VP28-CD；

所述的大肠杆菌基因工程融合蛋白的分子量为47.95Kda，在VP28和CD之间插入酸水解位点天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)。

4.大肠杆菌基因工程菌的制备

将质粒pET-32a(+)-VP28-CD转化到感受态BL21(DE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达vp28基因和cd基因的重组基因工程菌株Escherichia.coli BL21(pET-32a-VP28-CD)，该菌株已保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期：2008年3月10日，保藏编号：CCTCCNO：M208032，分类命名：重组基因工程菌株Escherichia.coli BL21(pET-32a-VP28-CD)。

5.基因工程融合蛋白的表达

重组基因工程菌株Escherichia.coli BL21(pET-32a-VP28-CD)的单菌落接种到LB(含100μg/mL氨苄青霉素)培养基中，37℃培养过夜，第2天活化菌液以4％接种到新鲜的LB(含100μg/mL氨苄青霉素)培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6时(约3小时)加入终浓度为1.0mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导4h后，离心12 000g，4℃，10min收集菌体，用10mMPBS(pH8.0)重悬超声波破碎，离心收集上清和沉淀并用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。以优化后的条件扩大培养，超声波破碎后，离心(12000g，4℃，20min)收集上清。融合蛋白VP28-CD的纯化按Ni-NTA说明书进行，用SDS-PAGE检测蛋白纯化结果。

本发明的基因工程融合蛋白的活性鉴定。

在本发明的一个实施例中提供了一种基因工程融合蛋白活性鉴定的方法，即MTT法，证明本发明所涉及的基因工程融合蛋白既能阻断WSSV与宿主细胞受体的结合，从而抑制WSSV囊膜与细胞膜的融合，达到抗WSSV感染的作用，又能抑杀其它病原微生物，提高对虾对WSSV的抗病能力和免疫能力。方法如下：

(1)细菌培养，用血细胞计数板测量细胞数目。无菌条件下，用肉汤培养基倍比稀释，将菌浓度调整到2×105CFU/ml。

(2)无菌条件下，用移液枪向无菌96孔微孔板中加入50μl菌液，再向各孔中加入待测样品50μl，混匀，实验设三个平行组。同时设置阳性对照组(50μl菌液+50μl 15μg/ml氨苄青霉素)、阴性对照组(50μl菌液+50μl 20mM PBS pH7.4)。37℃下培养12h。

(3)无菌条件下，向各孔分别加入5mg/ml的噻唑蓝(MTT，称取MTT 0.5克，溶于100ml20mM的PBS，pH7.4中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存) 溶液10μl，继续培养4h。

(4)向各孔中加入90μl二甲基亚砜(DMSO，在Amresco公司购置)，混匀并使蓝色晶体充分溶解于DMSO中，用酶标仪测量各孔在570nm处的光密度OD值(OD570)，并作记录。

(6)结果分析。计算公式：细菌抑制率＝1-(待测样品组OD570/空白对照组OD570)。

本发明以枯草芽孢杆菌为例，MTT法的结果表明重组融合蛋白VP28-CD对枯草芽孢杆菌有一定的抑杀作用。

本发明与现有报道的单一VP28DNA疫苗或亚单位疫苗相比，其优势在于：(1)本发明所涉及的VP28-CD重组蛋白，不仅可以阻断病毒与宿主细胞表面受体的结合，达到阻碍病毒感染的作用，而且还具有抑杀其它病原微生物的双重功能，本发明创造性地把它应用于对虾抗wssv中，至今在国内外未见报道；(2)本发明所涉及的融合蛋白VP28-CD为可溶蛋白，便于大规模生产，成本低廉，操作工艺简单：(3)在VP28和CD之间插入酸水解位点天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)，重组蛋白经对虾口服之后能在虾胃酸性条件下水解成单独VP28和CD天然分子，能更好地发挥其阻断病毒感染和抑杀病原微生物的双重功能。

附图说明

图1重组扩增质粒pGEM-T-vp28-cd的构建过程示意图

图2重组表达质粒pET-32a(+)-VP28-CD的构建过程示意图

图3重组表达质粒pET-32a(+)-VP28-CD的酶切和PCR鉴定示意图

其中：1.Marker IV 2.pET-32a(+)-VP28-CD质粒3.pET-32a(+)-VP28-CD单切/Xho I 4.VP28-CD PCR 5.pET-32a(+)-VP28-CD双切/EcoR I、Xho I 6.D2000图4SDS-PAGE鉴定示意图

其中：1：Protein Marker；2：pET-32a-VP28-CD诱导前；3：pET-32a-VP28-CD未诱导；4：pET-32a-VP28-CD诱导后；5：pET-32a-VP28-CD破碎；6：pET-32a-VP28-CD破碎后上清

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例子对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有培养基和分子生物学操作方法为本领域技术人员所熟知。本发明中未详述的请参见《精编分子生物学试验指南》F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿，J.G.塞德曼等主编，科学出版社出版。

实施例1WSSV的VP28基因的制备

(1)WSSV病毒基因组的制备：在冰上取患病对虾的鳃、胃和心脏，冰浴匀浆，然后加入蛋白酶K(100ug/ml)，在沸水中煮15分钟，立即冰浴5分钟，12000rpm离心10分钟，取其上清置4℃保存。

(2)WSSV的vp28基因的制备

根据GenBank中已经发表的vp28的序列设计引物，vp28的上游引物primer1： GAATTC

GATCTTTCTTTCACTCT(划线处为EcoR I位点，粗体为启始密码子)，vp28的下游引物primer2：AAGCTTCTCGGTCTCAGTGCCAGA(划线处为HindIII位点)。以上述上清为模板进行PCR，PCR反应体系：10×Taq Buffer with KCl 2.5uL，MgCl2(25mM)1.5uL，dNTP Mixture(2.5mM)1uL，上下游引物各1uL(25pmol)，模板1uL，Taq DNA聚合酶(1U/uL)1uL，加无菌水至终体积25uL。PCR反应条件为：94℃30s，55℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃10min。由此得到vp28基因的PCR产物。

实施例2家蚕抗菌肽成熟肽基因(cd)的制备

(1)家蚕脂肪体总RNA的提取

取5-10条经大肠杆菌JM109(在INVETROGEN公司购置)诱导24h后的家蚕，用焦碳酸二乙酯(DEPC，在上海生工购置)水(0.1％焦碳酸二乙酯的水溶液)清洗干净后，切开起腹腔，将脂肪提挤出收集后，在液氮中研磨成粉末状，按照RNeasy^R Kit的操作说明书提取脂肪体总RNA，提取得到的总RNA放置-80℃备用。

(2)合成Cecropin D cDNA的第一条链

按照Reverse Transcription System试剂盒说明书(在TIANGEN公司购置)，以Oligo(dT)₂₀为引物合成cDNA第一链。反应体系如下，依次将以下试剂加入经DEPC水处理并灭菌过的PCR管中：

25mM MgCl₂ 12μl

Reverse Transcription 10×Buffer 6μl

dNTP Mixture 10mM 6μl

Recombinant RNasin Ribonuclease

2μl

Inhibitor

AMV Reverse Transcriptase 4μl

Oligo(dT)₂₀Primer 6μl

Total RNA 15μl

加Nuclease-free水到终体积为

60μl

反应参数为：

42℃ 1h

95℃ 5min

3℃ 5min

将反应后的产物放置于-20℃以作为目的基因克隆的模板。

(3)家蚕抗菌肽Cecropin D的制备

依据GenBank中已发表的家蚕抗菌肽CecropinD cDNA序列，综合分析后设计PCR引物。上游引物primer3：ATGAAATTCTCGAAAATTTTCGTT，下游引物primer 4：TCCTTGTCCGAGAGCTTTTGC。引物由上海生物工程有限公司合成。以cDNA第一链为模板，按照以下反应体系和反应参数进行目的基因的扩增：

逆转录反应体系：

cDNA第一链 2μl

25mM MgCl₂ 4μl

Reverse Transcription 10× 2μl

Buffer

dNTP Mixture 10mM 4μl

Upstream primer(20μM/L) 2μl

Downstream primer(20μM/L) 2μl

Taq DNA Polymerase 0.5μl

DEPC处理的去离子水 3.5μl

总反应体积 20μl

应用降落式PCR的形式进行反应，其反应参数为：95℃预变性4min，94℃变性30sec，60-50℃退火30min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，10个循环，72℃再延伸10min。将反应后的产物置于-20℃备用。

将上述PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳并回收纯化，方法见实施例3。

将纯化的PCR产物与pUCm-T载体(在INVETROGEN公司购置)连接。连接体系如下：

10×Ligation Buffer 1μl

PEG 4000 1μl

pUCm-T载体 1μl

纯化后的PCR产物 5μl

ddH₂O 1μl

T4DNA Ligase 1μl

总反应体积 10μl

连接反应液16℃水浴放置过夜后，转化感受态大肠杆菌JM109，方法见实施例4。从LB平板上挑取4个单菌落于500ul新鲜液体LB培养基(含终浓度 100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3小时，以此菌液为模板，primer3、primer4为引物进行PCR初步鉴定，并送上海生工有限公司测序。将阳性克隆的菌液转接5ul于20ml新鲜液体LB培养基(含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量提取质粒，置于-80℃备用。重组质粒命名为pUCm-T-cecropin D。

(4)家蚕抗菌肽Cecropin D成熟肽基因(以下简称cd)

根据GenBank中已经发表的Cecropin D成熟肽的序列设计引物。cd的上游引物primer5：AAGCTT

GGCAACTTCTTCAAGGATCT(划线处为HindIII位点，方框内为Asp-Pro酸水解位点)，cd的下游引物primer6：_ CTCGAG GTTTTGTCCGAGAGCTTTTGCT(划线处为Xho I位点，粗体为终止密码子，将C末端甘氨酸突变成天冬酰胺)。以pUCm-T-cecropin D为模板进行PCR，PCR反应体系：10×Taq Buffer with KCl 2.5uL，MgCl2(25mM)1.5uL，dNTP Mixture 1uL，上下游引物各1uL(25pmol)，模板1uL，Taq DNA聚合酶(1U/uL)1uL，加无菌水至终体积25uL。PCR反应条件为：；94℃30s，50℃30s，72℃20s(30个循环)；72℃10min。由此得到cd的PCR产物。

实施例3PCR产物的回收、纯化和亚克隆

将实施例1中得到的vp28的PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，通过凝胶加样缓冲液显示的颜色判断要回收的目的带与其它带完全分离时，停止电泳。在紫外灯下迅速切下欲回收的条带，用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化，将单一的目的DNA条带放入干净的Eppendorf管中，称取重量。向胶块中加入3倍体积的溶胶液(凝胶重为0.1g，其体积可视为100uL，以此类推)。50℃水浴10分钟，其间每2分钟温和上下翻转Eppendorf管，以确保胶块充分溶解。将所得溶液取750uL加入到一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，室温(20-25℃，以下相同)放置2分钟，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入700uL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。再向吸附柱中加入500uL漂洗液，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。空柱12000rpm离心2分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱放入一个干净的Eppendorf管中，室温放置2分钟，彻底晾干，防止残留的漂洗液影响下一步的实验。向吸附膜中间位置悬空滴加30uL洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。将回收到的PCR产物取5uL电泳检测定量，其余贮于-20℃备用。

PCR产物的亚克隆：

将回收、纯化的PCR产物与pGEM-T(在INVITROGEN公司购置)连接，连接体系如下：

2×Ligation Buffer	5ul
		pGEM-T载体	0.5ul
纯化后的PCR产物	3.5ul
		T4DNA Ligase	1ul
总反应体系	10ul

连接反应液4℃水浴放置过夜。

同样的方法回收、纯化和亚克隆实施例2中得到的cd的PCR产物，分别得到vp28基因和cd基因与pGEM-T载体的连接产物。

实施例4质粒pGEMT-cd和质粒pGEMT-vp28的构建

氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞：

(1)用接种环挑取固体LB平板上新活化的大肠杆菌JM109单菌落，接种到20ml液体LB培养基(将1g蛋白胨、0.5g酵母粉、1g NaCl溶解在75ml ddH₂O中，调整pH值至7.0，最后加ddH₂O定容至100ml，分装于5个三角瓶里，15磅灭菌处理20min后备用)中，37℃，250rpm摇床活化过夜。

(2)无菌条件下取60ul上述活化的大肠杆菌于新鲜的20ml液体LB培养基中，37℃，250rpm摇床培养3小时左右至OD₆₀₀值为0.4-0.6。(下述所有步骤均需无菌操作)

(3)无菌条件下取1.5ul上述菌液于无菌Eppendorf管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0℃。4000rpm，4℃离心10分钟，用移液枪吸干上清。

(4)加入300ul冰预冷的0.1MCaCl₂溶液重悬菌体沉淀，冰浴30分钟，4000rpm，4℃离心10分钟，用移液枪吸干上清。

(5)加入100ul冰预冷的0.1MCaCl₂溶液重悬沉淀，即得感受态细胞，置于4℃保存，24小时内使用为宜。

将实施例3中得到的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞：

(1)无菌条件下取连接反应液10ul，加入到100ul大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。(下述所有步骤均需无菌操作)

(2)42℃水浴中热激90秒，迅速移至冰中冰浴2分钟。

(3)加入800ul液体LB培养基，37℃，150rpm轻摇45分钟使细菌复苏。

(4)4000rpm离心10分钟，吸取800ul上清弃去，将剩余菌液用移液枪轻轻混匀。

(5)将上述菌液用无菌三角玻棒均匀涂布在含10ul 1M IPTG，40ul20mg/ml X-gal，10ul 200mg/ml Amp的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被全部吸收，倒置平板于37℃培养箱中培养过夜。由此法可分别制备得到E.coli JM109 pGEM-T-cd和E.coli JM109 pGEM-T-vp28的菌落。

阳性正向重组子pGEM-T-cd和pGEM-T-vp28的酶切鉴定

用碱裂解法小量提取E.coli JM109 pGEM-T-cd的质粒pGEMT-cd，和E.coli JM109pGEM-T-vp28的质粒pGEMT-vp28，对所提质粒进行双酶切，酶切体系如下：

(1)重组质粒pGEMT-cd的双酶切

质粒pGEMT-cd 8ul

10×M Buffer 2ul

HindIII 1ul

Pst I 1ul

加无菌水至终体积20ul。

(2)重组质粒pGEMT-vp28的双酶切

质粒pGEMT-vp28 8ul

10×M Buffer 2ul

Pst I 1ul

HindIII 1ul

加无菌水至终体积20ul。

酶切反应条件均为37℃，反应时间3-4个小时，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分析结果。

实施例5融合基因的制备和表达质粒的构建

(1)重组扩增质粒pGEM-T-vp28-cd的构建

用HindIII和Pst I双酶切质粒pGEMT-vp28和质粒pGEMT-cd，目的片段开环质粒pGEMT-p28和含cd基因的片段进行胶回收后4℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，方法同实施例4。

挑取单克隆E.coli JM109 pGEM-T-vp28-cd于500ul新鲜液体LB培养基(含终浓度100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3小时，以此菌液为模板，primer1、primer6为引物进行PCR初步鉴定，其产物为vp28-cd，大小约为750bp。将PCR鉴定所得阳性克隆的菌液转接5ul于20ml新鲜液体LB培养基(含终浓度为100ug/ml氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量提取质粒，用HindIII和Xho I双酶切进一步鉴定阳性重组子，并送上海生工有限公司测序。重组质粒命名为pGEM-T-vp28-cd。

(2)重组表达质粒pET-32a(+)-VP28-CD的构建

用EcoR I和HindIII双酶切质粒pGEMT-VP28-CD和质粒pET-32a(+)(在INVITROGEN公司购置)，目的片段VP28-CD和开环pET-32a(+)胶回收后16℃连接过夜，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，方法如下：

①无菌条件下取连接反应液10ul，加入到100ul大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。(下述所有步骤均需无菌操作)

②42℃水浴中热激90秒，迅速移至冰中冰浴2分钟。

③将上述菌液用无菌三角玻棒均匀涂布在含10ul 200mg/ml Amp的LB平板上，正向放置1-2小时，直至液体被全部吸收，倒置平板于37℃培养箱中培养过夜。

挑取单克隆E.coli JM109 pET-32a(+)-VP28-CD于500ul新鲜液体LB培养基(含终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3小时，以此菌液为模板，primer1、primer6为引物进行PCR初步鉴定，其产物为VP28-CD全长融合基因，大小约为750bp。将PCR鉴定所得阳性克隆的菌液转接5ul于20ml新鲜液体LB培养基(含终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养过夜，碱裂解法小量提取质粒，用EcoR I和Xho I双酶切鉴定阳性重组子，重组质粒命名为pET-32a(+)-VP28-CD，并送上海生工有限公司测序，测序结果见一种基因工程融合蛋白，其序列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，核苷酸序列与预期的完全一致，符合翻译阅读框。

实施例4和实施例5中所述重组表达质粒pET-32a(+)-VP28-CD的构建过程见附图1，酶切及PCR鉴定见附图2。

实施例6基因工程菌的构建及融合蛋白的诱导表达

(1)基因工程菌的构建

将质粒pET-32a(+)-VP28-CD(1ul)转化大肠杆菌BL21(DE₃)(在INVITROGEN公司购置)感受态细胞。挑取转化平板上的单克隆于500ul新鲜液体LB培养基(含终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养3小时，以此菌液为模板，primer1、primer6为引物进行PCR鉴定，其产物为VP28-CD全长融合基因，大小约为750bp。

(2)融合蛋白VP28-CD的诱导表达

将PCR鉴定所得阳性克隆的菌液转接5ul于20ml新鲜液体LB培养基(含终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养过夜。将500ul过夜培养物分别同时接种到两瓶新鲜2×YT培养基(将1.6g蛋白胨、1g酵母粉、0.5g NaCl溶解在75ml ddH₂O中，调整pH值至7.0，最后加ddH₂O定容至100ml，分装于5个三角瓶中，15磅灭菌处理20min后备用，临用前加入终浓度为100ug/ml的氨苄青霉素)中，37℃，300rpm摇床培养，一瓶作诱导，一瓶作对照。3小时后，取欲诱导的2×YT培养物在无菌条件下用移液枪吸取1ml于一个干净的Eppendorf管中，再向上述2×YT培养物中加入20ul 1M IPTG，37℃，300rpm摇床继续培养。4小时后，停止诱导，同时取出经诱导和未经诱导的培养物，用移液枪分别吸取600ul诱导后的培养物和500ul未诱导的培养物于两个干净的Eppendorf管中。

(3)融合蛋白VP28-CD的SDS-PAGE鉴定

将诱导前、未诱导和诱导后小量取样的Eppendorf管于室温以12000rpm离心1分钟，弃去上清，加100ul无菌水重悬菌体沉淀。分别取上述样品各20ul于20ul 2×SDS凝胶加样缓冲液(100mM Tris-C1、200mM β-巯基乙醇、4％SDS、0.2％溴酚蓝、20％甘油)中，100℃加热10分钟，样品可贮存于-4℃，以备在凝胶上加样。融化样品，于室温以12000rpm离心1分钟。取20ul加样到10％SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。

电泳结束后，卸下凝胶，在考马斯亮蓝染色液(1g考马斯亮蓝R-250，450ml甲醇，450ml ddH2O，100ml冰醋酸)中染色2个小时，然后用脱色液(40ml甲醇，10ml乙酸，50ml ddH2O)脱色，每隔30分钟换液一次，直至背景脱干净为止。通过观察凝胶可知：在Protein Marker的45.0kDa指示偏上处，经过诱导的样品有大量目的蛋白表达，且80％为可溶蛋白。融合蛋白VP28-CD的SDS-PAGE鉴定见附图3，一种基因工程融合蛋白VP28-CD的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，并命名为重组基因工程菌株Escherichia.coli BL21(pET-32a-VP28-CD)。

实施例7融合蛋白VP28-CD的纯化

(1)融合蛋白VP28-CD的提取

按照实施例6(1)的诱导方法发酵1L重组基因工程菌Escherichia.coliBL21(pET-32a-VP28-CD)，于室温4200rpm离心20分钟，收集并称量湿菌体。取1g湿菌体加入30ml lysis Buffer(10mM咪唑，20mM Tris-HCl，500mM NaCl溶解于400ml ddH₂O，调整PH至7.9，最后加ddH₂O定容至500ml)，-20℃反复冻融3次，再进行超声波破碎(4℃，工作3秒，间歇3秒)，待菌液破碎至清亮，取样20ul以备作SDS-PAGE鉴定。将破碎后的菌液于4℃，10000rpm离心20分钟，分别收集菌体沉淀和上清液。分别取诱导前、未诱导、诱导后、破碎后、破碎后上清各20ul于20ul 2×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热10分钟，于室温以12000rpm离心1分钟。取20ul加样到10％SDS聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。SDS-PAGE结果表明：80％融合蛋白VP28-CD为可溶蛋白(见附图3)。

(2)Ni-NTA Superflow柱亲和层析法纯化融合蛋白VP28-CD

①将上述30ml上清液用滤头(微孔滤膜尺寸：Φ25mm，孔径：0.45ul)过滤，然后加入到平衡好的柱子中，用蠕动泵以1ml/min的速率，4℃循环上样过夜(12小时)，使融合蛋白前端的6×His与Ni²⁺充分结合。收集流出液，即穿漏液。(下述所有步骤均在4℃下进行)

②用50ml lysis Buffer以1ml/min的速率洗柱，以洗脱下柱内未与Ni²⁺结合的蛋白。

③用50ml含20mM咪唑的Wash Buffer(20mM咪唑，20mM Tris-HCl，500mM NaCl溶解于400ml ddH₂O，调整PH至7.9，最后加ddH₂O定容至500ml)以1ml/min的速率洗柱，以洗脱下Ni²⁺柱上的非目的蛋白。

④用Elute Buffer(250mM咪唑，20mM Tris-HCl，500mM NaCl溶解于400mlddH₂O，调整PH至7.9，最后加ddH₂O定容至500ml)以1ml/4min的速率洗柱，收集目的蛋白VP28-CD。一个Eppendorf管1ml，收集10管。

⑤取收集的蛋白进行10％SDS-PAGE检测纯化效果，并与纯化前和穿漏液作对照。

(3)超滤浓缩纯化后的融合蛋白VP28-CD并置换Elute Buffer

①将纯化后的蛋白用移液枪转移至超滤管(截留分子量为10KD)中，4℃，4700g离心20分钟，弃去收集管中的废液。

②加入20mM PBS(3.12gNaH₂PO₄，NaOH调pH值至7.4，加水定容至1000ml，15磅20min灭菌处理后备用)至原体积，4℃，4700g离心20分钟，弃去收集管中的废液。重复次步骤3次。

④不加PBS，4℃，4700g离心20分钟，弃去收集管中的废液，用200ul的移液枪小心地收集样品。由此即得到浓缩的融合蛋白VP28-CD，融合蛋白的浓度可用Bradford法测定。

实施例8Bradford法测定融合蛋白的浓度

(1)将Bradford试剂工作液平衡至室温并颠倒混匀，将酶标仪预热。

(2)将0、1、2、4、8、12、16、20ul牛血清蛋白(BSA)标准溶液(1mg/ml) 依次加入酶标微孔板中，用10mMPBS补足至20ul。

(3)向每孔中加入200ulBradford试剂工作液(0.1％考马斯亮蓝G250，5％乙醇，8.5％磷酸)振荡混匀后室温放置2分钟。

(4)用酶标仪测BSA蛋白各浓度的OD₅₇₀值。

(5)以BSA蛋白浓度为横坐标，BSA蛋白各浓度的OD₅₇₀值为纵坐标制作标准曲线。

(6)按照(1)至(4)所述的方法测定样品的OD₅₇₀值，从标准曲线中确定样品的浓度。

实施例9基因工程蛋白的抑菌活性测定

本发明采用MTT法测定重组融合蛋白的抑菌活性。MTT法测定抑菌效果步骤：

(1)细菌培养，用血细胞计数板测量细胞数目。无菌条件下，用肉汤培养基倍比稀释，将菌浓度调整到2×10⁵CFU/ml。

(2)无菌条件下，用移液枪向无菌96孔微孔板中加入50μl菌液，再向各孔中加入待测样品50μl，混匀，实验设三个平行组。同时设置阳性对照组(50μl菌液+50μl 15mg/ml氨苄青霉素)、阴性对照组(50μl菌液+50μl 20mM PBSpH7.4)。37℃下培养12h。

(3)无菌条件下，向各孔分别加入5mg/ml的噻唑蓝(MTT，称取MTT 0.5克，溶于100ml 20mM的PBS，pH7.4中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存)溶液10μl，继续培养4h。

(4)向各孔中加入90μl二甲基亚砜(DMSO，由Amresco公司提供)，混匀并使蓝色晶体充分溶解于DMSO中，用酶标仪测量各孔在570nm处的光密度OD值(OD570)，并作记录。

(5)结果分析。计算公式：细菌抑制率＝1-(待测样品组OD570/空白对照组OD570)。

本发明以枯草芽孢杆菌为例：

(1)按照实施例8的方法测得浓缩后融合蛋白的浓度约为908μg/ml。

(2)酸水解融合蛋白.用盐酸将融合蛋白的pH值调至3.0，50℃温浴20小时，然后用200mM PBS pH9.0将pH调至7.0。

(3)按照上述(1)至(5)所述的方法测定融合蛋白的抑菌活性，并作记录。数据见下表：

表1MTT法测定重组融合蛋白的抑菌活性

表中数据说明，重组融合蛋白VP28-CD对枯草芽孢杆菌的抑制率达56％以上，经水解后对枯草芽孢杆菌的抑制率达63％以上。结果表明重组融合蛋白VP28-CD对枯草芽孢杆菌有一定的抑杀作用，且经水解后其抑杀活性增强。

实施例10基因工程融合蛋白抗WSSV感染作用的实际应用

(1)试验样品及来源

VP28-CD融合蛋白亚单位疫苗预混粉剂，武汉大学生科院病毒学国家重点实验室基因工程药物及昆虫病毒分子生物学研究室研制提供并购置。制备方法如下：本发明所涉及的基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21pET-32a-VP28-CD经30L大罐发酵，发酵液4000rpm离心20分钟，弃去上清，收集湿菌体。称取湿菌体5g，加5ml、5mM PBS PH 7.4，重悬于冰箱-20℃反复冻融二次，于超声波破碎仪，冰浴破碎，经显微镜检测破碎良好，加入19g玉米淀粉吸附，35℃烘干，研钵研磨，过120目筛，备用。

WSSV悬浮液，武汉大学生科院病毒学国家重点实验室基因工程药物及昆虫病毒分子生物学研究室制备提供并购置。

海水，从湛江市开发区海湾大桥处抽取，兑淡用的自来水系一般自来水。

(2)试验条件

每个养殖箱装320升的海水，并用自来水兑成比重为1.011kg/L。

从湛江市水产局对虾原种场的对虾精养池捕捞健康南美白对虾(体长4-5cm，平均体重1.5g)，水体充氧运输至试验地，每箱投放50-60尾，室内暂养，以备试验用。

试验期间水温平均23℃-25℃，试验塑料箱内养殖水体水质指标：氨氮0.2-0.3mg/L，亚硝酸盐0.25-0.30mg/L，PH值7.5-8.0，溶氧3-4mg/L。主要通过更换适量兑淡后比重为1.009-1.011kg/L的海水和增氧泵不间断通气来调控。

(3)试验设计、调查及统计

①各处理样品预混粉剂分别包被对虾饲料的方法：用电子天平分别称取VP28-CD融合蛋白亚单位疫苗预混粉剂及预混粉剂辅料(19克的玉米淀粉)各0.500克的样品，分别加20ml淡水，搅拌均匀后，加入100克的粤海牌对虾饲料2号料拌匀，凉干备用。

②试验设有阴性对照组，阳性对照组，以及VP28-CD融合蛋白亚单位疫苗(样品组)共3组处理，每组处理各设二个重复。各处理养殖箱贴上相应标签，具体实施方法如下：

第一组(阴性对照组)：喂食正常对虾饲料，每日分三餐喂食。

第二组(阳性对照组)：每三天喂食一次上述包被预混粉剂辅料的饲料4g，一周后喂食包裹有对虾白斑综合症病毒的饲料一次(在包被WSSV之前进行WSSV口服侵染的预试验，以便确定WSSV悬液的感染力和病毒浓度，下同)。其余时间喂食正常对虾饲料，每日分三餐喂食。

第三组(样品组)：每三天喂食一次上述包被VP28-CD融合蛋白亚单位疫苗组的饲料4g，一周后喂食包裹有对虾白斑综合症病毒的饲料一次。其余时间喂食正常对虾饲料，每日分三餐喂食。

③调查及统计：逐日早晚观察记录(并打捞)各处理项目养殖箱内的死虾，统计累计死亡头数。实验结束后，统计各处理养殖箱内剩余的活虾，计算最后的存活率。保护效率见表1所示。

从表2中可以看出，VP28-CD融合蛋白亚单位疫苗预混粉剂喂食南美白对虾后，经WSSV口服侵染21天后存活率可达100％，而未经服用VP28-CD融合蛋白亚单位疫苗预混粉剂的阳性对照的经WSSV口服侵染21天后平均存活率仅为1.94％。这表明服用VP28-CD融合蛋白亚单位疫苗预混粉剂的南美白对虾能有效地预防WSSV的侵染。

表2重组融合蛋白VP28-CD亚单位疫苗的保护效果

实验头数＞100

序列表

<110>广西天池海洋生物药业有限公司

<120>抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白VP28-CD及制备和应用

<130>抗对虾白斑综合症病毒工程蛋白VP28-CD及制备和应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>744

<212>DNA

<213>融合蛋白

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(744)

<223>

<400>1

gaa ttc atg gat ctt tct ttc act ctt tcg gtc gtg tcg gcc atc ctc 48

Glu Phe Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu

1 5 10 15

gcc atc act gct gtg att gct gta ttt att gtg att ttt agg tat cac 96

Ala Ile Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His

20 25 30

aac act gtg acc aag acc atc gaa acc cac aca gac aat atc gag aca 144

Asn Thr Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr

35 40 45

aac atg gat gaa aac ctc cgc att cct gtg act gct gag gtt gga tca 192

Ash Met Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser

50 55 60

ggc tac ttc aag atg act gat gtg tcc ttt gac agc gac acc ttg ggc 240

Gly Tyr Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly

65 70 75 80

aaa atc aag atc cgc aat gga aag tct gat gca cag atg aag gaa gaa 288

Lys Ile Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu

85 90 95

gat gcg gat ctt gtc atc act ccc gtg gag ggc cga gca ctc gaa gtg 336

Asp Ala Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val

100 105 110

act gtg ggg cag aat ctc acc ttt gag gga aca ttc aag gtg tgg aac 384

Thr Val Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn

115 120 125

aac aca tca aga aag atc aac atc act ggt atg cag atg gtg cca aag 432

Asn Thr Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys

130 135 140

att aac cca tca aag gcc ttt gtc ggt agc tcc aac acc tcc tcc ttc 480

Ile Ash Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe

145 150 155 160

acc ccc gtc tct att gat gag gat gaa gtt ggc acc ttt gtg tgt ggt 528

Thr Pro Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly

165 170 175

acc acc ttt ggc gca cca att gca gct acc gcc ggt gga aat ctt ttc 576

Thr Thr Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe

180 185 190

gac atg tac gtg cac gtc acc tac tct ggc act gag acc gag aag ctt 624

Asp Met Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu Lys Leu

195 200 205

gat cca ggc aac ttc ttc aag gat ctt gaa aaa atg ggt cag agg gtt 672

Asp Pro Gly Asn Phe Phe Lys Asp Leu Glu Lys Met Gly Gln Arg Val

210 215 220

cga gac gcc gtc atc agc gcg gct cca gca gtc gac acc ctg gca aaa 720

Arg Asp Ala Val Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Asp Thr Leu Ala Lys

225 230 235 240

gca aaa gct ctc gga caa aac tag 744

Ala Lys Ala Leu Gly Gln Asn

245

<210>2

<211>247

<212>PRT

<213>融合蛋白

<400>2

Glu Phe Met Asp Leu Ser Phe Thr Leu Ser Val Val Ser Ala Ile Leu

1 5 10 15

Ala Ile Thr Ala Val Ile Ala Val Phe Ile Val Ile Phe Arg Tyr His

20 25 30

Asn Thr Val Thr Lys Thr Ile Glu Thr His Thr Asp Asn Ile Glu Thr

35 40 45

Asn Met Asp Glu Asn Leu Arg Ile Pro Val Thr Ala Glu Val Gly Ser

50 55 60

Gly Tyr Phe Lys Met Thr Asp Val Ser Phe Asp Ser Asp Thr Leu Gly

65 70 75 80

Lys Ile Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Asp Ala Gln Met Lys Glu Glu

85 90 95

Asp Ala Asp Leu Val Ile Thr Pro Val Glu Gly Arg Ala Leu Glu Val

100 105 110

Thr Val Gly Gln Asn Leu Thr Phe Glu Gly Thr Phe Lys Val Trp Asn

115 120 125

Asn Thr Ser Arg Lys Ile Asn Ile Thr Gly Met Gln Met Val Pro Lys

130 135 140

Ile Asn Pro Ser Lys Ala Phe Val Gly Ser Ser Asn Thr Ser Ser Phe

145 150 155 160

Thr Pro Val Ser Ile Asp Glu Asp Glu Val Gly Thr Phe Val Cys Gly

165 170 175

Thr Thr Phe Gly Ala Pro Ile Ala Ala Thr Ala Gly Gly Asn Leu Phe

180 185 190

Asp Met Tyr Val His Val Thr Tyr Ser Gly Thr Glu Thr Glu Lys Leu

195 200 205

Asp Pro Gly Asn Phe Phe Lys Asp Leu Glu Lys Met Gly Gln Arg Val

210 215 220

Arg Asp Ala Val Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Asp Thr Leu Ala Lys

225 230 235 240

Ala Lys Ala Leu Gly Gln Asn

245

Claims

1.一种分离的基因工程融合蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸，其序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.一种基因工程菌株，其特征在于，该菌株为重组基因工程菌株Escherichia coli BL21(pET-32a-VP28-CD)，CCTCC No：M208032。

4.权利要求3所述的一种基因工程菌株的制备方法，它包括下列步骤：

A.WSSV的VP28基因的制备：首先在冰上取对虾的鳃、胃和心脏，冰浴匀浆，然后加入蛋白酶K100ug/ml，在沸水中煮15分钟，冰浴5分钟，12000rpm离心10分钟，取其上清置4℃保存，其次是设计PCR引物，以上述上清作为模板DNA，PCR扩增目的基因VP28，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pGEM-T载体中，挑取单菌落培养，用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含VP28基因的大肠杆菌，为pGEM-T-VP28，用于基因的增殖和保藏；

B.家蚕抗菌肽Cecropin D成熟肽基因的制备：通过大肠杆菌JM109诱导家蚕，按照RNA提取试剂盒的方法提取其脂肪体总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，根据家蚕抗菌肽Cecropin D的cDNA序列，设计并合成引物，以上述得到的总cDNA为模板，PCR扩增得到Cecropin D基因，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pUCm-T载体中，挑取单克隆用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，根据Cecropin D基因的成熟肽序列，去掉信号部分和将C末端的甘氨酸突变成天冬酰胺，并插入酸水解位点Asp-Pro，重新设计引物，上游引物：AAGCTTGATCCAGGCAACTTCTTCAAGGATCT，下游引物：CTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGCTTTTGCT，以上述pUCm-T-cecropin D质粒为模板，PCR扩增CD基因，将PCR产物组装入pGEM-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含CD的大肠杆菌，为pGEM-T-CD，用于基因的增殖和保藏；

C.融合基因的制备及表达载体的构建：首先同时双酶切含CD基因的重组质粒和含VP28基因的重组质粒，胶回收含CD基因的片段和开环pGEM-T-VP28片段，4℃连接后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子命名为pGEM-T-VP28-CD，再同时双酶切重组质粒pGEM-T-VP28-CD和质粒pET-32a(+)，胶回收含VP28-CD基因的片段和开环pET-32a(+)片段，16℃连接后转化到感受态E.coli中，所得到的阳性克隆子是VP28-CD融合基因的大肠杆菌，为pET-32a(+)-VP28-CD；

D.大肠杆菌基因工程菌的制备：将质粒pET-32a(+)-VP28-CD转化到感受态BL21中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够融合表达VP28基因和CD基因的大肠杆菌基因工程菌株。

5.权利要求1所述的一种基因工程融合蛋白在制备预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。

6.权利要求2所述的一种核酸在制备预防对虾白斑综合症病毒的药物中的应用。