CN109828117B - 一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法，包括以下步骤：步骤一、在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样，对纳克级蛋白进行标准定量，得到每个蛋白点灰度面积值后绘制标准的定量曲线；步骤二、将待测样本按照步骤一的方式，在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样和定量，得到待测样本每个蛋白点灰度面积值；步骤三、将待测样本每个蛋白点灰度面积值代入步骤一的标准定量曲线进行计算，得出待测样本蛋白含量；本发明灵敏度更高，最小检测蛋白量达到50ng，待测样品体积为1μl；在50‑1000ng范围内蛋白有较好的线性关系。
Description
技术领域
本发明涉及微量样品的蛋白定量技术领域，特别涉及一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法。
背景技术
蛋白质组学是后基因组时代标志性的热点科学，在疾病诊断和药靶筛选、细胞信号转导、代谢调控网络研究等方面扮演着越来越重要的角色。同时，蛋白质组学也是一个技术依赖性的新兴学科，不断的拓展分离分析技术手段，以更高的通量、敏度和准确性得到海量的数据是蛋白质组学研究的基础。蛋白质组学主要包含定量蛋白质组学和比较蛋白质组学。比较蛋白质组学在系统生物学研究领域得到了广泛的应用，对细胞信号转导、代谢调控网络的研究中发挥着越来越重要的作用。其中，定量蛋白质组学技术是蛋白质组学研究的核心，通过高通量的检测不同样本或状态下蛋白表达量的变化，筛选到起关键作用的蛋白，从而对疾病发展机理做出更准确的解释。定量蛋白组学研究的主要技术策略有基于二维凝胶电泳的方法，稳定同位素标记结合质谱定量的方法以及非标记定量的方法等。基于2DE的定量蛋白质组学技术是通过比较不同胶上蛋白质点染色强度来寻找差异蛋白，这一过程繁琐费时，且筛选差异蛋白点的通量和可靠性都受到极大的限制；稳定同位素标记结合鸟枪法蛋白质组学是定量蛋白质组学的另一种重要手段，主要是通过不同同位素组成的试剂标记蛋白或肽段，然后进行LC/MS/MS分析，该技术降低了分析复杂度，但同时可能会丢失部分信息；基于鸟枪法蛋白质组学体系的非标定量技术可以分为两类:基于鉴定蛋白肽段数目的方法和基于质谱峰强度的方法，该方法需要的样本量很大。
准确可靠的蛋白含量测定技术是蛋白质科学的重要基础。对于组织或细胞裂解后得到的蛋白提取液，一般采用Lowry法，Bradford法或BCA法对蛋白量进行测定。这些方法利用标准蛋白(牛血清白蛋白最为常见)制作标准曲线，然后测定样品的蛋白浓度。Lowry法的灵敏度可达5-100μg/ml，对不同蛋白的差别较小，但干扰物质较多(如巯基化合物或糖类等还原性物质)，反应较慢，有时会出现标准曲线非线性等问题。Bradford法的灵敏度是Lowry法的4-5倍，灵敏度为1-100μg/ml。反应重复性好，线性关系好，精确度高。缺点在于不同蛋白与染料结合量不同，测定与标准蛋白质组成有较大差异的样品时，有一定误差。BCA标准检测方法的灵敏度为0.5-1200μg/ml。上述方法都是比较常用的蛋白定量方法，但是对微量蛋白样本(纳克级蛋白样品)却没办法准确定量。因此，发明一种对纳克级蛋白样品的定量快速有效的方法具有十分重要的意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法，采用与待测样品组成类似、简单易得的复杂体系蛋白(如组织提取液与细胞提取的蛋白组成类似、血浆蛋白与脑脊液等体液的组成类似)，利用BCA法测定其蛋白浓度；然后以该复杂体系作为标准，利用0.45μm水系滤膜作为载体制作标准曲线，进而实现对待测样本微量蛋白的定量；和原有的蛋白定量方法相比，灵敏度更高，最小检测蛋白量达到50ng，待测样品体积为1μl；在50-1000ng范围内蛋白有较好的线性关系。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法，包括以下步骤：
步骤一、在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样，对纳克级蛋白进行标准定量，得到每个蛋白点灰度面积值后绘制标准的定量曲线；
步骤二、将待测样本按照步骤一的方式，在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样和定量，得到待测样本每个蛋白点灰度面积值；
步骤三、将待测样本每个蛋白点灰度面积值代入步骤一的标准定量曲线进行计算，得出待测样本蛋白含量。
所述的步骤一具体过程如下：
(1)在0.45μm孔径的水系微孔滤膜上用铅笔画出方格，将标准品样本设置多个梯度溶液，每个方格点1μl样品，每个样品重复点三次；
(2)点样结束后，使滤膜自然干燥，或用电吹风吹干，避免滤纸出现褶皱；
(3)将滤膜置于考染液中浸泡5分钟；水洗3min；再用脱色液脱色10分钟；
(4)扫描仪进行灰度扫描；得到每个蛋白点灰度面积值(Volume值)后绘制定量曲线。
所述的考染液为：1.0g考马斯亮蓝R-250溶于450ml甲醇、450ml超纯水以及100ml冰醋酸溶液中得到的混合液。
所述的脱色液为：甲醇100mL、冰醋酸100ml和超纯水800ml的混合液。
本发明提出了一种基于滤膜结合考染法的纳克级微量蛋白定量的新方法。采用0.45μm的水系微孔滤膜可以对50-1000ng的蛋白准确定量，具有以下优点：
1、与可以进行纳克级蛋白定量的其他方法相比，采用0.45μm的水系微孔滤膜成本更低。
2、所需要的待测样本量少，可以对纳克级蛋白样本量进行定量。
3、采用不同的标准品所得到的标准品曲线方程是有差异的，因此本发明可以选择和待测样本组成相似的复杂样本来制作标准曲线，对待测样本的定量更准确。
附图说明
图1是实施例一中50-1000ng BSA在0.45μm水系微孔滤膜载体上的考染效果图与定量曲线；其中图1a是考染效果图，图1b是定量曲线。
图2是实施例二中100-1000ng LYS在滤膜载体上的考染效果图与定量曲线；其中图2a是考染效果图，图2b是定量曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下实施例中所使用到的考马斯亮蓝、牛血清白蛋白(BSA)、鸡蛋清溶菌酶(LYS)等试剂均可通过商业购买获得；超纯水可通过超纯水机得到。
实施例一
本实施例包括以下步骤：
步骤一、在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样，对纳克级蛋白进行标准定量，得到每个蛋白点灰度面积值后绘制标准的定量曲线。
以BSA为标准品0.45μm水系微孔滤膜作为载体对纳克级蛋白进行定量
标准品制备：30mg的BSA溶于3ml超纯水中制备成10mg/ml的BSA标准液。将10mg/ml的BSA标准液稀释成1-9mg/ml的9个梯度。再将1mg/ml的BSA溶液稀释成100-900μg/ml的9个梯度；将100μg/ml的BSA溶液稀释成10-90μg/ml的9个梯度。
标准曲线建立：在0.45μm水系滤膜上用铅笔画出3×6的方格。(1)在滤膜上设置50，100，200，400，600，1000ng的6个梯度溶液，样品浓度为100-1000μg/ml，每个方格点1μl样品，每个样品重复点三次。(2)点样结束后，使滤膜自然干燥，并且避免滤膜出现褶皱。(3)将滤膜置于考染液中浸泡5分钟；水洗3min；脱色：用脱色液脱色10分钟。(4)应用灰度尺对ScanMaker8700扫描仪进行灰度校正。扫描采用反射模式，分辨率设置为600DPI。应用ImageMaster软件对扫描图像进行分析。得到每个蛋白点灰度面积值(Volume值)后绘制定量曲线。
步骤二、将待测样本按照步骤一的方式，在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样和定量，得到待测样本每个蛋白点灰度面积值。
步骤三、将待测样本每个蛋白点灰度面积值代入步骤一的标准定量曲线进行计算，得出待测样本蛋白含量。
效果：图1可以看出，应用0.45μm水系滤膜作为载体，BSA标准曲线，在50-1000ng的范围内，蛋白量与染色灰度面积有着良好的相关性，R2＝0.9773。因此采用0.45μm水系滤膜作为载体可以对纳克级样本进行定量，并且有良好的线性。
实施例二
本实施例包括以下步骤：
步骤一、在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样，对纳克级蛋白进行标准定量，得到每个蛋白点灰度面积值后绘制标准的定量曲线。
标准品制备：30mg的LYS溶于3ml超纯水中制备成10mg/ml的LYS标准液。将10mg/ml的LYS标准液稀释成1-9mg/ml的9个梯度。再将1mg/ml的LYS溶液稀释成100-900μg/ml的9个梯度。
标准曲线建立：在0.45μm水系滤膜上用铅笔画出3×10的方格。(1)在滤膜上设置100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000ng的10个梯度溶液，样品浓度为100-1000μg/ml，每个方格点1μl样品，每个样品重复点三次。(2)点样结束后，使滤膜自然干燥，并且避免滤膜出现褶皱。(3)应用灰度尺对ScanMaker 8700扫描仪进行灰度校正。(4)应用ImageMaster软件对扫描图像进行分析。得到每个蛋白点灰度面积值(Volume值)后绘制定量曲线。
步骤二、将待测样本按照步骤一的方式，在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样和定量，得到待测样本每个蛋白点灰度面积值。
步骤三、将待测样本每个蛋白点灰度面积值代入步骤一的标准定量曲线进行计算，得出待测样本蛋白含量。
效果：图2展示了100-1000ng的LYS的效果。对LYS蛋白量与灰度面积值的相关性分析。LYS在100-1000ng与染色灰度面积的相关R2＝0.8805。可以发现，相同量的LYS和BSA的蛋白点的面积和形状很不相同，BSA的扩散面积较大，边缘的曲线较为平滑；而LYS蛋白点的扩散面积较小，边缘处有许多细小毛刺。这说明了LYS和BSA在载体上扩散性质的差别，可能与其疏水性及蛋白与载体表面的相互作用有关。标准曲线也呈现差异。所以在对纳克级的微量蛋白定量时应该采用一种与待测样品组成类似、简单易得的复杂体系蛋白(如组织提取液与细胞提取的蛋白组成类似、血浆蛋白与脑脊液等体液的组成类似)作为标准，利用0.45μm水系微孔滤膜作为载体，制作标准曲线。利用该标准曲线实现对微量待测样本的准确定量。
以上对本发明实施例公开的一种基于微膜法的超微蛋白定量检测方法的具体实验步骤进行阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (1)
1.一种基于微膜法的超微量蛋白定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样，对纳克级蛋白进行标准定量，得到每个蛋白点灰度面积值后绘制标准的定量曲线；
步骤二、将待测样本按照步骤一的方式，在0.45μm孔径的水系微孔滤膜载体上进行点样和定量，得到待测样本每个蛋白点灰度面积值；
步骤三、将待测样本每个蛋白点灰度面积值代入步骤一的标准定量曲线进行计算，得出待测样本蛋白含量；
所述的步骤一具体过程如下：
(1)在0.45μm孔径的水系微孔滤膜上用铅笔画出方格，将标准品样本设置多个梯度溶液，每个方格点1μl样品，每个样品重复点三次；
(2)点样结束后，使滤膜自然干燥，或用电吹风吹干，避免滤纸出现褶皱；
(3)将滤膜置于考染液中浸泡5分钟；水洗3min；再用脱色液脱色10分钟；
(4)扫描仪进行灰度扫描；得到每个蛋白点灰度面积值(Volume值)后绘制定量曲线；
所述的考染液为：1.0g考马斯亮蓝R-250溶于450ml甲醇、450ml超纯水以及100ml冰醋酸溶液中得到的混合液；
所述的脱色液为：甲醇100mL、冰醋酸100ml和超纯水800ml的混合液。
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