CN102175674A

CN102175674A - 一种检测尿液微量清蛋白的方法

Info

Publication number: CN102175674A
Application number: CN 201110022797
Authority: CN
Inventors: 徐克前; 向跃芸; 刘芳; 夏璐玲; 刘小兰
Original assignee: Central South University
Current assignee: Central South University
Priority date: 2011-01-20
Filing date: 2011-01-20
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明公开了一种检测尿液微量清蛋白的方法。该方法是在聚偏氟乙烯膜或硝酸纤维素膜上先加入甲醇，再加入系列清蛋白标准品和待测尿样本后，用考马斯亮蓝R250染色液进行染色，脱色液脱色，待膜干燥后对待测样本与标准品形成的斑点颜色深浅进行比较分析：用肉眼即可进行初步定性；将膜拍照或扫描，用软件可根据标准品的浓度及其斑点平均密度制作出标准曲线，再根据待测样本斑点平均密度计算得其浓度，可实现定量分析。本发明所需样本量少，不需特殊试剂及仪器，技术操作简便，结果可靠，成本低廉，可实现尿液微量清蛋白的定量检测。

Description

一种检测尿液微量清蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种检测尿液微量清蛋白的方法，具体涉及检测含量为纳克级的清蛋白的方法。

背景技术

尿液清蛋白的排泄有着很大的变异范围，从不能测出的量到毫克甚至克不等。微量清蛋白尿(microalbunminuria，MAU)是指尿中清蛋白的排泄率高于正常人水平，但又低于用常规尿蛋白检测方法所能检出的水平，即尿清蛋白排泄为20-200mg/L。自80年代以来，MAU的研究已受到人们的重视，大量的临床研究表明，它是糖尿病肾病、高血压肾病的重要预测指标，是亚临床心血管疾病的指示物，是血管内皮细胞功能紊乱的标志物，是先兆子痫的敏感指标和静脉血栓的独立危险因素等等，对早期(可逆转期)治疗原发病、分析病程进展、评价相关危险因素等具有重要意义。因此，对这些患者或健康人群进行MAU常规筛查变得尤为重要。

尿液微量清蛋白的定量检测尚无参考方法。目前临床常用的有免疫学的方法和色谱法。近来有文献报道，尿中的清蛋白存在着不同形式，包括了免疫反应性清蛋白与免疫非反应性清蛋白。常规的免疫学方法如放射免疫分析法和免疫透射比浊法等都测不出尿中的免疫非反应性清蛋白从而会低估总的清蛋白。而采用HPLC法检测出的清蛋白浓度比常规免疫学方法要高，比常规免疫化学方法可提前3.9年预示1型糖尿病患者发生了持续性清蛋白尿，2型糖尿病可提前2.4年。免疫学方法需要特殊的单克隆或多克隆抗体，放射免疫分析法还需利用放射性元素作为示踪剂，影响检验者的身体健康，并严重污染环境；色谱法需要特定的色谱柱，并需要特殊的仪器，普及有较大的困难。目前还没有一种操作简便、成本低廉、快速准确的尿液微量清蛋白检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测尿液微量清蛋白的方法，本发明方法能实现纳克级别清蛋白含量的测定，技术操作简便，结果可靠，成本低廉，特别适用于尿液微量清蛋白的检测。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种检测尿液微量清蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)剪取适合大小的膜，根据待测样本数量，将膜等分，并做好标记；

(b)配制系列浓度的清蛋白标准品用于制作标准曲线；

(c)将新鲜的尿样本离心，取上清作为待测样本；若为冷藏或冷冻尿样本，先平衡，再离心取上清检测；

(d)加样：先在膜的每个等分面积的中心位置加2-3μl甲醇，然后立即在同一位置加入2-4μl清蛋白标准品或待测尿样本；

(e)染色：待肉眼见膜加样处无湿润时，在培养皿中用适量的考马斯亮蓝R250染色液将膜完全浸没，振摇使染色完全；

(f)脱色：将膜置于足量的脱色液1中不停振摇脱色，2-5分钟后将脱色液1弃去；加入充足的脱色液2，并不断更换脱色液2振摇脱色，至无背景色；

(g)用蒸馏水将膜上残余的脱色液漂洗掉，于空气中自然干燥；

(h)用肉眼对待测样本与标准品形成的斑点颜色深浅进行比较，进行初步定性；将完全干燥后的膜拍照或扫描，用软件分析标准品和待测样本斑点的平均密度值；以清蛋白标准品浓度为横坐标，平均密度为纵坐标，做出标准曲线，从标准曲线中计算出待测样品的清蛋白浓度。

步骤(a)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)中所述的膜为聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜或硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜。

步骤(b)中的清蛋白标准品系列浓度为12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L。

步骤(c)中样本3000g离心10分钟。

步骤(e)中所述染色液为将考马斯亮蓝R250完全溶解于甲醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液。配制方法为：将1g考马斯亮蓝R250染料溶解于225ml无水甲醇、50ml冰醋酸和225ml蒸馏水中；使用磁力搅拌器搅拌5小时使染料完全溶解。

步骤(f)中所述脱色液1为5％乙酸。

步骤(f)中所述脱色液2为无水乙醇、冰醋酸和蒸馏水的混和液；配比为450ml无水乙醇、100ml冰醋酸和450ml蒸馏水。

本发明提供的方法，技术操作简便，结果可靠，成本低廉，估计为不到人民币0.2元/样本，与常用的免疫化学法超过人民币10元/样本相比成本大大减低。此外，此法只需2-4μl尿样，不需要特异性抗体，无放射性污染，试剂热稳定，在条件不允许的情况下可以加样干燥后将PVDF膜或NC膜邮寄到别处检测，或者当资源有限时直接用肉眼读估计，适用于尿液微量清蛋白的检测。

利用本发明方法得到的检测结果，并不能作为获得疾病诊断结果或健康状况的直接依据，而只是作为一种中间结果。

附图说明

图1为根据本发明的一个实施方式绘制的PVDF膜染色法标准曲线图；

图2为PVDF膜染色法系列浓度清蛋白标准液的检测拍照图；

从左至右清蛋白标准液浓度分别为500mg/L、400mg/L、300mg/L、200mg/L、100mg/L、50mg/L、25mg/L、12.5mg/L；

图3为清蛋白浓度的免疫速率散射比浊法和本发明中PVDF膜染色法相关性比较；

图4为本发明中PVDF膜染色法检测微量清蛋白的分析测量范围。

具体实施方式

以下实施方式和实施例旨在进一步说明本发明，而不会限制本发明权利要求保护的范围。

实施例1

1.尿样本微量白蛋白的检测

(a)根据待测样本数量(每个样本约占用一个8mm*8mm的方格)，剪取适合大小的一块PVDF膜，用铅笔在膜的四周画好标尺便于加样，并做好标记。

(b)配制系列浓度的清蛋白标准品12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L。

(c)将尿样本平衡至37℃，3000g离心10分钟，取上清作为待测样本。

(d)加样：先在一个方格的中心位置加2.5μl甲醇，然后马上在同一位置加入2μl清蛋白标准品或待测尿样本。如果加入的甲醇已被PVDF膜吸干而标准品或尿样本还未成功加入，则弃用此方格，换一个方格重新上样。按此法将标准品和待测尿样本均加样完毕。

(e)染色：待肉眼见PVDF膜加样处无湿润时，在培养皿中取充足的考马斯亮蓝R250染色液将PVDF膜完全浸没，振摇5分钟。

(f)脱色：将PVDF膜置于足量的脱色液1中不停振摇脱色，2分钟后将脱色液1弃去；加入充足的脱色液2，不断振摇脱色，更换数次脱色液2，至无背景色。

(g)用蒸馏水将PVDF膜漂洗3次，于空气中自然干燥。

(h)用肉眼对待测样本与标准品形成的斑点颜色深浅进行比较，初步定性为100mg/L-200mg/L；将完全干燥后的PVDF膜置于Bio-Rad凝胶成像系统中拍照(不使用任何滤镜)，用Quantity One软件分析出标准品和待测样本斑点的平均密度值。以清蛋白标准品浓度为横坐标，平均密度为纵坐标，做出标准曲线，为y＝5.1216x+539.84(r²＝0.9935)，待测样本的平均密度值为1054.7，从标准曲线中计算出待测样品的清蛋白浓度为100.5。

2.精密度性能评价

取三个已知浓度(50mg/L、100mg/L、200mg/L)的微量清蛋白尿样本用于本发明中PVDF膜染色法重复性的评价。批内重复性：在同一批内测定这三个样本，每个样本重复测定10次；批间重复性：分4批测定这三个样本，每批每个样本重复测定5次。50mg/L、100mg/L、200mg/L三个浓度的尿液清蛋白测得批内变异系数分别为9.1％、5.6％、5.0％，批间变异系数分别为10.0％、9.6％、7.4％。

3.正确度性能评价

方法比较试验：随机选取中南大学湘雅医院63例患者尿液样本，同时采用三种方法进行检测。方法一：采用免疫速率散射比浊法检测，试剂盒由Beckman Coulter公司提供，仪器为美国Beckman Coulter公司

Immunochemistry Systems。试剂盒、标准品及质控品均为公司配套产品。实验严格按照试剂说明书操作。方法二：采用体积排阻高效液相色谱法分离清蛋白后采用紫外分光光度计检测(HPLC法)。方法三：采用本发明中PVDF膜染色法进行检测。其标准品均可溯源至Certified Reference Material 470。

本发明中PVDF膜染色法分别与免疫速率散射比浊法、HPLC法进行配对t检验，p值分别为p＜0.05、p＞0.05，可认为本发明中PVDF膜染色法的检测结果与HPLC法无显著性差异，与免疫速率散射比浊法有显著性差异，其结果高于免疫速率散射比浊法。相关性分析显示，膜染色法与免疫速率散射比浊法相关性良好，Y(本发明中PVDF膜染色法；mg/L)＝0.7804×(免疫速率散射比浊法)+97.7(mg/L)，r²＝0.8552，P＜0.001(图3)。

4.分析灵敏度性能评价

将生理盐水作为空白样本，重复检测10次，计算其平均值加3倍标准差，得本发明中PVDF膜染色法检测低限为15mg/L。

5.分析测量范围性能评价

配制系列浓度清蛋白标准品6.25mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L、700mg/L、800mg/L、900mg/L、1000mg/L。每个样品重复测定两次，取平均值。以清蛋白浓度为横坐标，平均密度为纵坐标作图，评估本发明中PVDF膜染色法的线性检测范围，线性范围为6.25-600mg/L(图4)。

6.分析干扰性能评价

分别制备80g/L维生素C浓缩贮存液、80g/L肌酐浓缩贮存液、800g/L尿素浓缩贮存液、400g/L氯化钠浓缩贮存液、2000U/mL青霉素钠、23g/L血红蛋白溶液、5g/L胆红素浓缩贮存液(溶于二甲亚砜)、4g/L免疫球蛋白浓缩贮存液等干扰物。

肌酐、尿素、氯化钠、葡萄糖、青霉素钠、血红蛋白、免疫球蛋白G、二甲亚砜、胆红素等干扰物质对尿液清蛋白测定的影响。

基础样品：收集中南大学湘雅三医院健康体检尿液样本，加入适量6g/dL清蛋白标准品，使其尿液清蛋白浓度约为200mg/L。

对照样本：取基础样品950μl，加入50μl蒸馏水，混匀，即为对照样本。

干扰样本：取基础样品950μl，分别加入50μl干扰物质，混匀，即为各种干扰样本。

用本发明中PVDF膜染色法将对照样本测定5次，各干扰样本各测定5次，取平均值，计算干扰率。如有明显干扰，则将干扰物质配制成不同浓度，确定干扰物浓度与干扰程度两者之间的关系。

4g/L维生素C、4g/L肌酐、40g/L尿素、20g/L氯化钠、40g/L葡萄糖、100U/mL青霉素钠、二甲亚砜对膜染色法检测无干扰。血红蛋白、胆红素、免疫球蛋白G等对本发明中PVDF膜染色法有干扰，结果见表1。在正常情况下，人尿液中血红蛋白、胆红素、免疫球蛋白G等含量很低，对此方法检测尿液中的微量清蛋白不会造成明显的干扰。

表1血红蛋白、胆红素、免疫球蛋白G对PVDF膜染色法的干扰

7.尿液pH值的影响

将清蛋白标准液分别溶于0.1mol/L醋酸钠/醋酸缓冲液(pH 4.6)、0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.3)、0.1mol/L巴比妥/盐酸缓冲液(pH 8.8)，将其配成清蛋白终浓度均为200mg/L的样本进行检验，每个样本检测5次结果进行比较。尿液不同pH值对本发明中PVDF膜染色法的检测结果无明显影响(CV＜4％)。

虽然本发明已经参考具体的实施方式进行描述，但是本领域技术人员通过阅读上述描述后，将可以对本发明做出显而易见的修改和修饰，而不违背本发明的意图和本质。本发明有意将这些修改和修饰包括在权利要求的范围内。

Claims

1.一种检测尿液微量清蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(b)配制系列浓度的清蛋白标准品用于制作标准曲线；

(e)染色：待肉眼见膜加样处无湿润时，在培养皿中取充足的考马斯亮蓝R250染色液将膜完全浸没，振摇使染色完全；

(h)用肉眼对待测样本与标准品形成的斑点颜色深浅进行比较，进行初步定性；将完全干燥后的膜拍照或扫描，用软件分析标准品和待测样本斑点的平均密度值；以清蛋白标准品浓度为横坐标，平均密度为纵坐标，做出标准曲线，由标准曲线得出待测样品的清蛋白浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)中所述的膜为PVDF膜或者NC膜。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(e)中所述染色液为将考马斯亮蓝R250完全溶解于甲醇、冰醋酸和蒸馏水的混合液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(f)中所述脱色液1为5％乙酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(f)中所述脱色液2为无水乙醇、冰醋酸和蒸馏水的混和液。

6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，步骤(f)中所述脱色液2为450ml无水乙醇、100ml冰醋酸和450ml蒸馏水的混和液。