CN105842238B - 一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法 - Google Patents

一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法 Download PDF

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Abstract

一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，包括如下步骤：配置不同浓度的标准蛋白质溶液，所述标准蛋白质溶液浓度为0.1‑10μg/μL；分别将不同浓度的标准蛋白质溶液、待测样品滴加在滤纸上，放置≥10秒，其中，两者的滴加量相同；用染色液对上述滤纸进行染色，染色时间≥2秒，待滤纸吸饱染色液；染色后1小时之内用水冲洗染色后的滤纸，直到露出滤纸上的显色斑点；通过待测样品与不同浓度的标准蛋白质溶液在滤纸上显色斑点的颜色对比来判定待测样品中蛋白质浓度的半定量结果。本发明的半定量检测方法所需样品量少、灵敏度可达0.1μg/μL，且具有快速、简单、不需要昂贵的仪器等优点。

Description

一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法
技术领域
本发明属于蛋白质技术领域，具体涉及一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法。
背景技术
蛋白质溶液浓度检测是一种常用的生物学检测方法。目前主要的检测方法有如下几种：第一：检测蛋白质溶液在280nm处的吸光值(即A280数值)。一般情况下，A280＝1时，蛋白质溶液的浓度为1μg/μL，其原理是蛋白质分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯环结构，在紫外280nm波长处有最大吸收峰，其光吸收值与蛋白质浓度成正比，故可以用280nm波长吸收值大小来测定蛋白质浓度。该方法使用紫外分光光度计，普通的紫外分光光度计操作复杂，而且只能检测100μl以上样品，而检测微量样品(比如1μl溶液样品)的紫外分光光度计价格昂贵，比如美国赛默飞(Thermo Fisher)Nanodrop 2000型号的紫外分光光度计价格在10万元以上。因此，该方法存在如下缺陷：必须配备紫外分光光度计，且普通的紫外分光光度计需要样品量大，而高端的紫外分光光度计则非常昂贵。
第二，检测溶液中蛋白质的质量，再结合溶液体积计算蛋白质溶液的浓度。其原理是将一定浓度的标准蛋白质溶液与待测样品一起进行聚丙烯酰胺凝胶分析，然后使用软件对比标准蛋白质溶液与待测样品在凝胶上的蛋白质质量，获得待测样品蛋白质质量，再结合溶液体积获得蛋白质溶液的浓度。但该方法需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，步骤繁多，整个实验需要3个小时以上，花费时间比较长。
第三，考马斯亮兰法(Bradford法)检测蛋白质浓度，其原理是将标准蛋白质溶液与待测样品分别加入Bradford检测液中，混匀，检测混合溶液在595nm处的吸光值(即A595数值)，作标准蛋白质溶液与吸光值相关性的标准曲线。然后，根据标准曲线推导蛋白质溶液浓度与吸光值相关性的公式，将待测样品吸光值导入公式计算出样品蛋白质溶液的浓度。但该方法在检测微量样品(例如小于50μL的蛋白质溶液)时必须配备酶标仪，设备比较昂贵，比如美国博腾(BioTek)Epoch型号的酶标仪价格在30万元以上。
发明内容
本发明的目的在于提供一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，该方法具有快速、简单、成本低、样品量小、灵敏度高等优点。
为了实现上述目的，本发明的主要技术方案如下：
本发明基于如下理论和方法实现：染色液中的考马斯亮蓝和蛋白质中的芳香族氨基酸残基结合，当它与蛋白质结合后，蛋白质和色素的结合物为蓝色，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而且在室温下蛋白质和色素的结合物比较稳定(1小时内)。因此，考马斯亮蓝可用于蛋白质的定量测定。
本发明将蛋白质吸附到滤纸上后，加入染色液，在滤纸上形成蛋白质和色素的结合物，然后使用自来水冲洗滤纸。由于蛋白质和色素的结合物分子量较大，难以冲洗。因此，自来水冲洗滤纸后，滤纸上大部分染色液被去除，留下蛋白质和色素的结合物显色，可以从显示颜色的深浅判断蛋白质溶液浓度范围。
一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，其包括如下步骤：
1)配置不同浓度的标准蛋白质溶液，所述标准蛋白质溶液浓度为0.1-10μg/μL；分别将至少两种不同浓度的标准蛋白质溶液、待测样品滴加在滤纸上，放置≥10秒，其中，不同浓度的标准蛋白质溶液和待测样品的滴加量相同；
2)用染色液对上述滤纸进行染色，染色时间≥2秒，待滤纸吸饱染色液；染色后1小时之内用水冲洗染色后的滤纸，直到露出滤纸上的显色斑点；
3)通过待测样品与不同浓度的标准蛋白质溶液在滤纸上显色斑点的颜色对比来判定待测样品中蛋白质浓度的半定量结果。
进一步，步骤1)中，所述标准蛋白质溶液和所述待测样品的滴加量均≥1μL。
步骤2)中，所述染色液包括0.01-0.1％考马斯亮蓝R-250，0.01-0.1％考马斯亮蓝G-250，5-40％酒精，5-40％冰醋酸。
又，所述滤纸为慢速定量滤纸、中速定量滤纸、快速定量滤纸、慢速定性滤纸、中速定性滤纸或快速定性滤纸。
优选的，所述滤纸为慢速定性滤纸。
本发明通过将蛋白质溶液中蛋白质吸附在滤纸上后，利用染色液使不同浓度的蛋白质溶液在滤纸上的显色深浅不同，再与标准蛋白质溶液在滤纸上的显色比对来确定待测样品中蛋白质浓度范围，如果待测样品的显色深浅处于两个不同浓度的标准蛋白质溶液的显色之间，则待测样品的蛋白质浓度处于该标准蛋白质溶液的两个不同浓度之间。
本发明的有益效果：
本发明所提供的检测方法需要的样品量少，1μL样品量即可进行半定量检测；灵敏度高，具体可以达到0.1μg/μL，可检测微克级的蛋白质；检测结果的准确性不受标准蛋白质溶液的缓冲液种类的影响；成本低，不需要昂贵的仪器和设备即可操作。
本发明所需的标准蛋白质溶液配置完成后，可以储存于-20℃冰箱中，备用；染色液储存于室温中，备用。因此，本发明通过事先配置好的标准蛋白质溶液和染色液用于该半定量检测过程中，实验步骤少，操作简单，整个过程只需要2分钟，并且样品数量的增加不会导致实验时间的大量增加，大大节约了时间。
附图说明
图1为本发明实施例1不同类型滤纸上的检测结果图。
图2为本发明实施例2不同缓冲液配置标准蛋白质溶液后的检测结果图。
图3本发明实施例3的检测结果图。
图4为对比例2中BSA标准蛋白质溶液和待测样品的聚丙烯酰胺凝胶图。
图5为对比例3中BSA标准蛋白质溶液的A595吸光值和浓度相关标准直线图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。
下列实施例中如无特殊说明，均为《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，2002年)所记载的方法。
以下实施例中，化学试剂和实验材料从杭州南天生物科技有限公司购买。使用美国赛默飞(Thermo Fisher)Nanodrop2000型号的紫外分光光度计检测蛋白质溶液浓度中A280数值，检测蛋白质溶液中蛋白质含量的聚丙烯酰胺凝胶电泳槽和电泳仪为美国伯乐(BioRad)Mini Protean 3 Cell型号电泳槽和Powerpac型号电泳仪，使用美国伯乐(BioRad)QuentityOne凝胶分析软件检测和对比蛋白质溶液中蛋白质含量。聚丙烯酰胺凝胶染色和脱色使用华城润华TY-80A/S型号水平摇床。移液枪为德国Eppendorf公司的Research Plus系列。
实施例1.检测的蛋白质溶液浓度范围和最佳滤纸类型
本实施例使用慢速、中速、快速的定量滤纸和定性滤纸(购自GE公司的Whatman牌滤纸)进行试验，检测滤纸对蛋白质的吸附力以及自来水冲洗后的检测效果。
配置不同浓度的标准蛋白质溶液，检测本发明可以检测到的蛋白质溶液浓度范围，本实施例中使用模式蛋白质牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质溶液。为了检测不同滤纸对蛋白质的吸附力，蛋白质溶液的体积从实验室可操作的最低量1μL逐渐递增到3μL。
具体试验步骤如下：
1)配置标准蛋白质溶液牛血清白蛋白BSA，浓度设置为0.1μg/μL、2μg/μL、5μg/μL。
2)对滤纸进行编号：慢速定量滤纸(1号)、中速定量滤纸(2号)、快速定量滤纸(3号)、慢速定性滤纸(4号)、中速定性滤纸(5号)、快速定性滤纸(6号)。
3)使用1-10μL量程的移液枪分别将1μL、2μL、3μL的步骤1)配置的不同浓度BSA标准蛋白质溶液加在1-6号滤纸上，放置10秒以上，让蛋白质充分吸附在滤纸上。
4)将1-6号滤纸放置在培养皿中，加入2mL染色液对滤纸进行染色5秒以上，滤纸吸饱染色液即可，对染色液的量，没有要求；只要在1个小时内进行后续实验，对结果不会产生影响。
本实施例中染色液包括0.05％考马斯亮蓝R-250，0.05％考马斯亮蓝G-250，20％酒精，10％冰醋酸。
5)自来水冲洗滤纸，直至可以看到蛋白质溶液的显色斑点即蓝色圆点，具体结果如图1所示，对比不同滤纸上圆点颜色，结合BSA标准蛋白质溶液浓度进行分析。
图1中，每张滤纸上第1行从左至右分别为：1μL、2μL、3μL的5μg/μL BSA标准蛋白质溶液添加位置；每张滤纸上第2行从左至右分别为：3μL、2μL、1μL的2μg/μL BSA标准蛋白质溶液添加位置；每张滤纸上第3行从左至右分别为：1μL、2μL、3μL的0.1μg/μL的BSA标准蛋白质溶液添加位置。
从图1可以看出：1-6号滤纸上，1μL、2μL、3μL的5μg/μL标准蛋白质溶液，1μL、2μL、3μL的2μg/μL标准蛋白质溶液，1μL、2μL、3μL的0.1μg/μL标准蛋白质溶液在1-6号不同滤纸上均能显色(其中，图1中各显色实际为蓝色，转换为黑白照片后，导致其中1-6号滤纸上第三行1μL、2μL、3μL的0.1μg/μL标准蛋白质溶液的显色不明显)，说明1-6号滤纸均可用于本发明提供的半定量检测方法中。
同时，从图1可以看出：当蛋白质溶液体积为1-3μL、浓度为0.1μg/μL时，溶液中蛋白质的质量为0.1-0.3μg，蛋白质溶液在滤纸上显示的蓝色圆点颜色很淡，说明0.1μg/μL浓度的蛋白质溶液是本发明检测方法的检测下限，灵敏度较高。
从图1中4号慢速定性滤纸上可以看出，1μL的5μg/μL、2μg/μL、0.1μg/μL的蛋白质溶液显色斑点处的蓝色深浅不同，足够区分不同的浓度，所以，本发明所提供的检测方法中所需样品量仅为1μL即可，从节约样品的角度出发，可使用体积量为1μL作为最佳检测体积。
当蛋白质溶液体积为3μL，浓度为5μg/μL时，溶液中蛋白质的量最大达到15μg，此时，只有慢速定性滤纸(4号)仍然可以显示蓝色，说明慢速定性滤纸没有饱和吸附蛋白质，存在大量蛋白质-色素复合体。其他滤纸在蛋白质溶液体积2μL，浓度为5μg/μL的情况下显示白色，说明这些滤纸已经饱和吸附蛋白质，只有少量染色液可以吸附在表面上，存在少量蛋白质-色素复合体。该结果说明，慢速定性滤纸(4号)的蛋白质吸附能力最强，其原因是定性滤纸中的灰分含量(0.13％)远大于定量滤纸(0.0009％)，这部分灰分可以吸附蛋白质。而慢速滤纸中纤维之间的空隙小于中速和快速滤纸，可以更好地固定蛋白质-染料复合物，使其不被自来水洗脱。因此，慢速定性滤纸可作为本发明最佳的蛋白质溶液载体。
实施例2.检测的蛋白质溶液浓度不受溶液缓冲液的影响
蛋白质溶液的缓冲液需要根据蛋白质的不同用途进行配置，尤其是在操作蛋白质过程中需要使用不同的缓冲液。本实施例通过实验验证不同缓冲液对本发明检测方法的影响。具体试验步骤如下：
1)配置6种不同常用蛋白质缓冲液：酸盐缓冲液(10mM Na2HPO4,100mM NaCl，pH7.4)、膜蛋白缓冲液(10mM Na2HPO4,100mM NaCl，1％DDM，10％甘油，pH8.0)、Histag纯化洗脱液(50mM Na2HPO4,500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0)、变性蛋白缓冲液(100mM Na2HPO4,100mM NaCl，8M尿素，pH7.0)、GSTtag纯化洗脱液(50mM Tris-Cl，10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0)、Tris缓冲液(100mM Tris-Cl，100mM NaCl，pH8.0)。可以为其他缓冲液，不止限于上述所示缓冲液。
2)使用步骤1)的不同蛋白质缓冲液分别配置浓度为2μg/μL的BSA标准蛋白质溶液，得到酸盐缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液、膜蛋白缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液、Histag纯化洗脱液配置的BSA标准蛋白质溶液、变性蛋白缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液、GSTtag纯化洗脱液配置的BSA标准蛋白质溶液、Tris缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液。
3)使用1-10μL量程的移液枪分别将1μL 6种缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液加在慢速定性滤纸上，放置10秒以上，让蛋白质和滤纸充分吸附。在滤纸上，酸盐缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为1、膜蛋白缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为2、Histag纯化洗脱液配置的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为3、变性蛋白缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为4、GSTtag纯化洗脱液配置的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为5、Tris缓冲液配置的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为6。
4)将滤纸放置在培养皿中，加入2ml染色液对滤纸进行染色5秒以上，滤纸吸饱染色液即可，对染色液的量，没有要求；只要在1个小时内进行后续实验，对结果不会产生影响。
本实施例中染色液包括0.1％考马斯亮蓝R-250，0.1％考马斯亮蓝G-250，30％酒精，20％冰醋酸。
5)自来水冲洗滤纸，直至可以看到蛋白质溶液的的显色斑点即蓝色圆点，具体结果如图2，对比滤纸上不同显色斑点颜色深浅，进行分析。
由图2可看出：滤纸上6个样品的显色斑点上的颜色相近，说明不同缓冲液中的蛋白质浓度相同，其原因是蛋白质可以特异性地与色素结合，而缓冲液中的成分不会影响这种结合。因此，本发明的检测结果的准确性不受标准蛋白质溶液的缓冲液种类的影响。
实施例3.检测纯化蛋白质溶液样品的浓度
蛋白质纯化步骤根据QIAGEN公司的Histag蛋白纯化手册进行，最终获得蛋白质纯化溶液(缓冲液为实施例2中的Histag纯化洗脱液(50mM Na2HPO4，500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0))，以此为样品进行检测。具体试验步骤如下：
1)配置牛血清白蛋白BSA的标准蛋白质溶液，浓度设置为1μg/μL、5μg/μL、10μg/μL。
2)使用1-10μL量程的移液枪将1μL上述不同浓度的BSA标准蛋白质溶液和1μL待测样品溶液加在同一慢速定性滤纸上，放置10秒以上，让蛋白质和滤纸充分吸附。
其中，1μL浓度为10μg/μL的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为1，1μL浓度为5μg/μL的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为2，1μL浓度为1μg/μL的BSA标准蛋白质溶液添加位置编号为3，1μL待测样品溶液添加位置编号为4。
3)将滤纸放置在培养皿中，加入2mL染色液对该滤纸进行染色5秒以上，滤纸吸饱染色液即可，对染色液的量，没有要求；只要在1个小时内进行后续实验，对结果不会产生影响。
本实施例中染色液包括0.01％考马斯亮蓝R-250，0.01％考马斯亮蓝G-250，5％酒精，5％冰醋酸。
4)自来水冲洗步骤3)染色后的滤纸，直至可以看到蛋白质溶液的显色斑点即蓝色圆点，如图3所示。
5)对比滤纸上待测样品与不同浓度的BSA标准蛋白质溶液的圆点颜色的深浅，进行分析：
由图3可知：滤纸上待测样品添加位置4的颜色深浅在BSA标准蛋白质溶液添加位置2和3的颜色之间，这说明待测样品中的蛋白质浓度在1μg/μL～5μg/μL之间。
为了验证本发明检测方法的准确性，使用常用的3个方法对待测样品进行定量分析，具体参见对比例1、2、3。
对比例1.利用A280吸光值检测纯化蛋白质溶液样品的浓度
对比例1使用美国赛默飞(Thermo Fisher)Nanodrop 2000型号的紫外分光光度计检测蛋白质溶液A280吸光值，具体试验步骤如下：
1)使用1-10μL量程的移液枪将1μL体积的Histag纯化洗脱液(50mM Na2HPO4，500mM NaCl，500mM咪唑，pH8.0)加入仪器中，进行空白校正。
2)使用1-10μL量程的移液枪将1μL纯化蛋白质溶液样品(即实施例3中的待测样品)加入仪器中，读取A280吸光值＝1.5，说明样品中蛋白质浓度为1.6μg/μL。
该对比例1结果与实施例3中的检测结果相符。
对比例2.利用聚丙烯酰胺凝胶分析纯化蛋白质溶液样品的浓度
本对比例2比较BSA标准蛋白质溶液和待测样品在聚丙烯酰胺凝胶上的量，计算待测样品蛋白质质量，从而获得蛋白质溶液的浓度。具体试验步骤如下：
1)配置BSA的标准蛋白质溶液，浓度设置为0.2μg/μL、0.5μg/μL、1μg/μL、2μg/μL、4μg/μL、8μg/μL。将80μL不同浓度的BSA标准蛋白质溶液以及实施例3中的待测样品分别加入1.5ml离心管中，然后每管加入20μL的5×蛋白质上样缓冲液(250mMTris-HCl，10％(W/V)SDS，0.5％(W/V)BPB，50％(V/V)甘油，5％(W/V)，β-巯基乙醇(2-ME)，pH6.8)。将离心管95℃加热15分钟，然后10000转/分钟离心10分钟，取上清10μL作为上样液。
2)制12％蛋白质聚丙烯酰胺胶，将BSA标准蛋白质溶液、待测样品和蛋白质Marker分别加入12％聚丙烯酰胺胶凝胶加样孔，将凝胶放入含有1×PAGE(25m M Tris，250mMGlycine，0.1％(W/V)SDS)电泳液的电泳槽中，以120V电压电泳1个小时。
3)将凝胶取出，放入含有染色液的染色槽中，然后，将染色槽放在水平摇床上染色2个小时。
4)将凝胶取出，自来水冲洗后放入含有脱色液的染色槽中，然后，将脱色槽放在水平摇床上染色3个小时。
5)将凝胶置于美国伯乐(BioRad)凝胶成像系统上进行拍照，具体结果如图4所示，利用BioRadQuentityOne凝胶分析软件对比分析，获得样品的浓度为1.5μg/μL。
该对比例2结果与实施例3、对比例1的检测结果相符。
对比例3.利用Bradford法检测纯化蛋白质溶液样品的浓度
本对比例3比较BSA标准蛋白质和待测样品分别与Bradford检测液混合后的A595吸光值，作标准蛋白质溶液浓度的标准曲线，根据标准曲线公式，计算出样品蛋白质溶液浓度。具体试验步骤如下:
1)配置BSA的标准蛋白质溶液，浓度设置为0.06μg/μL、0.08μg/μL、0.1μg/μL。将实施例3中的待测样品溶液稀释到1倍，1/5倍，1/10倍，1/20倍，1/30倍。
2)用移液枪分别取50μL不同浓度的BSA标准蛋白质溶液和待测样品，加入酶标板中。
3)加入200μL Bradford检测液(购自上海生工生物技术有限公司)，混匀，静置10min。
4)将酶标板置入酶标仪(美国博腾(BioTek)公司的Epoch酶标仪)中，检测溶液的A595吸光度，获得标准蛋白质溶液和待测样品的A595吸光值数值，具体数值参见表1。
5)根据BSA标准蛋白质溶液的A595吸光值和浓度，利用Excel软件制作标准曲线，计算标准曲线公式，具体参见图5。
6)分析表1中的结果，待测样品溶液稀释到1倍、1/5倍、1/10倍的值不在0μg/μL-0.1μg/μL BSA的标准蛋白质溶液的范围内，只能够取待测样品溶液稀释到1/20倍、1/30倍的数值。将待测样品稀释到1/20倍、1/30倍的数值代入公式，并乘以稀释倍数，计算获得浓度分别为1.63μg/μL、1.56μg/μL，取平均值，最终计算待测样品中蛋白质浓度为1.595μg/μL。
本对比例3结果与实施例3、对比例1、对比例2的检测结果相符。
表1

Claims (3)

1.一种半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，其包括如下步骤：
1)配置至少两种不同浓度的标准蛋白质溶液，所述标准蛋白质溶液浓度为0.1-10μg/μL；分别将不同浓度的标准蛋白质溶液、待测样品滴加在滤纸上，放置≥10秒，其中，所述标准蛋白质溶液和所待测样品的滴加量各为1-3μL，且，标准蛋白质溶液和待测样品的滴加量相同；
2)用染色液对上述滤纸进行染色，染色时间≥2秒，待滤纸吸饱染色液；染色后1小时之内用水冲洗染色后的滤纸，直到露出滤纸上的显色斑点；所述染色液包括0.01-0.1％考马斯亮蓝R-250，0.01-0.1％考马斯亮蓝G-250，5-40％酒精，5-40％冰醋酸；
3)通过待测样品与不同浓度的标准蛋白质溶液在滤纸上显色斑点的颜色对比来判定待测样品中蛋白质浓度的半定量结果。
2.根据权利要求1所述的半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，其特征在于，所述滤纸为慢速定量滤纸、中速定量滤纸、快速定量滤纸、慢速定性滤纸、中速定性滤纸或快速定性滤纸。
3.根据权利要求1或2所述的半定量检测蛋白质溶液浓度的方法，其特征在于，所述滤纸为慢速定性滤纸。
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