CN108008060B - 一种饲料中羟脯氨酸的测定方法及试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种饲料中羟脯氨酸的测定方法及试剂。所述方法包括如下步骤：将待测样品进行前处理，使所述待测样品中的蛋白质水解；采用离子交换色谱法对蛋白质水解产物中的羟脯氨酸含量进行测定；阳离子交换柱分离所使用的第一洗脱液为：溶剂为水，溶质及其浓度分别为：柠檬酸钠0.02‑0.03mol/L、氯化钠0.075‑0.125mol/L、柠檬酸0.075‑0.125mol/L、乙醇12‑16％(体积百分含量)的溶液。本发明在流动相试剂配制和仪器分析方法方面进行了改进，适用于针对羟脯氨酸的快速检测，该方法能够使羟脯氨酸与其它氨基酸完全分离，具有快速、准确的特点。该方法能够准确分析饲料中的羟脯氨酸，可用于大规模样品检测，适于标准化。

Description

一种饲料中羟脯氨酸的测定方法及试剂
技术领域
本发明涉及羟脯氨酸的检测技术领域，具体说是一种饲料中羟脯氨酸的检测方法及试剂。
背景技术
羟脯氨酸，分子式C5H9NO3，分子量131.13，又名反式-4-羟基-L-脯氨酸，是胶原蛋白特有的氨基酸，在胶原蛋白中含量约为13.4％，在弹性蛋白中含量极少，不存在于其它蛋白中。
动物胶原水解蛋白是将动物毛皮及其制品下脚料等成分粗加工后制成的水解蛋白质，可以作为动物饲料添加使用，是一种廉价蛋白原料。然而，某些非法厂商为提高乳品中蛋白含量，降低生产成本，将廉价的水解动物蛋白掺入乳粉中冒充代替乳蛋白，掺加的动物胶原水解蛋白不但会影响乳品口感和风味，而且其氨基酸组成不合理，易造成乳品营养价值下降，人体吸收利用率降低，严重影响消费者健康。鉴于蛋白质资源的合理利用及相应风险控制，有必要建立一套快速、准确、有效的羟脯氨酸定量分析方法，为相应农产品及食品质量安全提供有力的检测技术支撑。
现行标准对出口食品、肉与肉制品以及乳品等基质中羟脯氨酸的测定进行了规范，其中前处理方法大多采用酸水解法，即：一定质量的样品中加入一定体积6mol/L盐酸溶液，在充氮条件下，于110℃水解22-24h，检测方法多采用比色法、液相色谱串联质谱法等，比色法在特异性、灵敏度方面尚显不足，而液相色谱串联质谱法虽然能够达到较高灵敏度，但检测成本较高，前处理过程需净化，操作较繁琐，不适于大批量样品的筛查检测。
氨基酸分析仪根据经典的茚三酮与氨基酸显色反应，以阳离子交换色谱梯度洗脱各氨基酸组分，经柱后衍生生成的衍生物通过紫外-可见检测器测定，具有特异性好，灵敏度高，自动化操作等特点。该仪器方法与高效前处理技术相结合，能够满足大批量样品的定量分析，然而目前市售的氨基酸分析仪专用流动相价格昂贵，样品测定消耗快，由国外进口的原装试剂一套4000多元，日常检测量大的情况下一周基本用完，成本太高；且仪器分析方法采用18种氨基酸同步分析方法，检测时间较长，无形中提高了样品分析的成本。
发明内容
针对现有技术中存在的羟脯氨酸测定方法样品前处理时间长，检测特异性不高的问题，本发明的目的在于提供一种快速、准确、灵敏度高、重复性好，检测限低并且操作简便的羟脯氨酸的快速检测方法及试剂。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种羟脯氨酸的快速检测方法，包括如下步骤：
S1、将待测样品进行前处理，使所述待测样品中的蛋白质水解,获得蛋白质水解产物；
S2、采用离子交换色谱法对蛋白质水解产物中的羟脯氨酸含量进行测定；
所述离子交换色谱法包括：阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、和光度法测定的步骤，
所述阳离子交换柱分离所使用的洗脱液中包括：第一洗脱液(即洗脱液pH-1)；
所述第一洗脱液为溶剂为水，溶质及其浓度分别为：柠檬酸钠0.02-0.03mol/L、氯化钠0.075-0.125mol/L、柠檬酸0.075-0.125mol/L、乙醇12-16％(体积百分含量)的溶液。
实施例1具体为：所述第一洗脱液为溶剂为水，溶质及其浓度分别为：柠檬酸钠0.024mol/L、氯化钠0.097mol/L、柠檬酸0.099mol/L、乙醇13.25％(体积百分含量)的溶液。
对于羟脯氨酸的分离来说，最重要的洗脱液为第一洗脱液，第一洗脱液直接影响着羟脯氨酸与天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸的分离度，本发明在第一洗脱液中加入更多的柠檬酸钠，使溶液离子强度提高，其pH值也相应有所变化，从而保证了几种氨基酸的分离效果，配方所用试剂均为国产，也降低了检测成本。
在上述方法中，步骤S2中，所述离子交换色谱法使用的洗脱液中还包括：第二洗脱液、第三洗脱液、第四洗脱液和第五洗脱液(即洗脱液pH-2、洗脱液pH-3、洗脱液pH-4和洗脱液pH-RG)；
所述第二洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.02-0.035mol/L、氯化钠0.1-0.15mol/L、柠檬酸0.075-0.15mol/L、乙醇1-3％(体积百分含量)的溶液；
实施例1具体为：所述第二洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.03mol/L、氯化钠0.12mol/L、柠檬酸0.11mol/L、乙醇2％(体积百分含量)的溶液；
所述第三洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.035-0.05mol/L、氯化钠0.05-0.1mol/L、柠檬酸0.05-0.1mol/L、乙醇0.1-0.3％(体积百分含量)的溶液；
实施例1具体为：所述第三洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.049mol/L、氯化钠0.064mol/L、柠檬酸0.064mol/L、乙醇0.2％(体积百分含量)的溶液；
所述第四洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.05-0.15mol/L、氯化钠0.75-1.25mol/L、柠檬酸0.025-0.5mol/L、苯甲醇0.3-1％(体积百分含量)的溶液；
实施例1具体为：所述第四洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.094mol/L、氯化钠0.93mol/L、柠檬酸0.03mol/L、苯甲醇0.5％(体积百分含量)的溶液；
所述第五洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：氢氧化钠0.2mol/L、乙醇10％(体积百分含量)的溶液。
在上述方法中，所述第一洗脱液的pH值为3.25-3.35；
和/或，所述第二洗脱液的pH值为3.15-3.25；
和/或，所述第三洗脱液的pH值为3.8-4.2；
和/或，所述第四洗脱液的pH值为4.7-5.1。
在上述方法中，所述阳离子交换柱分离包括柱分析和柱再生，其中的柱分析按照如下梯度洗脱程序依次进行：
S201、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱1.5分钟；
S202、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S203、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱2.9分钟；
S204、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S205、第三洗脱液洗脱阳离子交换柱3.9分钟；
S206、第三洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S207、第四洗脱液洗脱阳离子交换柱0.3分钟；
S208、第四洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S209、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟。
在上述方法中，所述阳离子交换柱分离中的柱再生按照如下梯度洗脱程序依次进行：
S210、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱3.9分钟；
S211、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S212、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱0.9分钟；
S213、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S214、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱14.9分钟；
S215、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱。
一个完整17种氨基酸分析程序为53分钟，包括分析与再生两个部分，从谱图来看分析时间为30分钟，其实之后还需要再生23分钟，而再生程序为下一针进样做平衡准备，不宜改动，因此我们选择将分析程序调整缩短，使其既满足羟脯氨酸的检测需要，又不会因为长时间分析造成流动相的无谓消耗，这里所指的是分析和再生整个程序一共29分钟。实施例1表3中从9.1分钟开始是再生程序，之前是分析程序。
本申请实施例1具体使用日立L-8900全自动氨基酸分析仪进行；流速：0.35-0.4mL/min、阳离子交换柱即分离柱4.6mm×40mm；固定相：阳离子交换树脂。仪器由2个泵组成，泵1压力2-25MPa，泵2压力0-5MPa；分析柱温度：55-59℃；反应柱温度：130-140℃；进样量：10-20μL；检测波长：440-570nm；每个泵的组分单合计百分比，泵1由B1、B2、B3、B4、B6中的洗脱液组成，为分离流动相；泵2由R1、R2、R3中的反应液组成，用作柱后衍生。
在上述方法中，所述柱后茚三酮衍生使用的反应液包括反应液R1、反应液R2和反应液R3；
所述反应液R1为二丙二醇独甲醚、茚三酮和硼氢化钠按1L：30g：81mg混合得到的溶液；
所述反应液R2为二丙二醇独甲醚与茚三酮缓冲液按体积比1：1混合得到的溶液；所述茚三酮缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：乙酸钠328g/L,冰乙酸10％(体积百分含量)；
所述反应液R3为乙醇与水按体积比1:19混合得到的溶液。
在上述方法中，所述柱后茚三酮衍生按照如下程序依次进行：
步骤S201～S209的柱后茚三酮衍生使用体积比为1:1的所述反应液R1和所述反应液R2进行；
步骤S210～S213的柱后茚三酮衍生使用所述反应液R3进行；
步骤S214～S215的柱后茚三酮衍生使用体积比为1:1的所述反应液R1和所述反应液R2进行。
在上述方法中，所述步骤S1按包括如下步骤的方法进行：
向待测样品中加入6mol/L盐酸溶液后通入氮气，然后在微波功率为600-1000W、温度为5-30min内从常温升至150-170℃、再保温10-50min的条件下进行微波水解，然后浓缩蒸干，加入1-3mL 0.02mol/L的盐酸溶液混匀、过滤，获得所述蛋白质水解产物。
现有技术为采用烘箱恒温加热110度水解22-24小时，微波消解提高了水解效率，缩短了前处理时间。
本发明提供了一种用于离子交换色谱法分离检测羟脯氨酸的流动相试剂，该试剂包括独立包装的所述第一洗脱液。
该试剂还包括：独立包装的所述第二洗脱液、第三洗脱液、第四洗脱液和/或第五洗脱液。
本发明的有益效果如下：
和原配方相比，本发明修改了第一洗脱液(pH-1)中柠檬酸钠(二水)的加入量，省去了五种洗脱液pH-1，pH-2，pH-3，pH-4，pH-RG中的硫代双乙醇，辛酸和聚氧乙烯月桂醚组分，在保证检测分离度的同时简化了流动相配方，提高了大批量样品测定时流动相的配制效率。另外，本发明还将流动相切换时间做了较大改变，分析和再生平衡时间由以前的53min缩短至29min，各切换时间也相应调整，使得分析时间更少，效率提高。
本发明在流动相试剂配制(表1)和仪器分析方法(表3)方面进行了改进，适用于针对羟脯氨酸的快速检测，该方法能够使羟脯氨酸与其它氨基酸完全分离，具有快速、准确的特点。该方法能够准确分析饲料中的羟脯氨酸，可用于大规模样品检测，适于标准化。
附图说明
图1为氨基酸混合标准溶液的色谱图。
图2为鱼粉中氨基酸含量色谱图。
图3为肉骨粉中氨基酸含量色谱图。
图1-3中，Hpro为羟脯氨酸、Asp为天门冬氨酸、Thr为苏氨酸、Ser为丝氨酸、Glu为谷氨酸、Pro为脯氨酸。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、饲料中羟脯胺酸的快速检测方法
A、样品前处理
将待测饲料样品粉碎，精确称取100mg样品放入微波水解罐内，加入6mol/L盐酸溶液5mL，通入氮气，盖好罐盖，按照微波水解仪器(Multiwave Pro微波消解仪，奥地利AntonPaar公司)条件设置并进行水解：其中控制微波功率为600W，控制温度为5min内从常温升至150℃，然后恒温30min；恒温结束后，移取200μL水解液至浓缩水解管，经浓缩仪浓缩蒸干，加入3mL0.02mol/L的盐酸溶液，涡旋混合均匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，待氨基酸分析仪检测；
B、氨基酸分析仪准备
氨基酸分析仪色谱柱：日立L-8900全自动氨基酸分析仪，分离柱4.6mm×40mm；固定相：阳离子交换树脂；流动相：见表1；梯度洗脱程序见表2；流速：0.4mL/min；仪器由2个泵组成，泵1压力8.6MPa，泵2压力0.8MPa；分析柱温度：57℃；反应柱温度：135℃；进样量：20μL；检测波长：440nm；每个泵的组分单合计百分比，泵1由B1、B2、B3、B4、B6中的洗脱液组成，为分离流动相；泵2由R1、R2、R3中的反应液组成，用作柱后衍生。
C、混合标准溶液的制备
准确称取13.11mg羟脯氨酸标准品，用超纯水定容至100mL容量瓶中，得到1.0μmol/mL的标准溶液，从中准确移取1mL至10mL容量瓶，加入1mL 1.0μmol/mL的17种氨基酸混合标准溶液，以超纯水定容至刻度，即得到100nmol/mL的混合标准溶液，于4℃冰箱保存；
D、按照氨基酸分析仪设定程序分别对混合标准溶液和试样中的羟脯氨酸进行定量分析，采用外标法计算试样中羟脯氨酸含量，取3组平行试验，测定结果取平均值。氨基酸混合标准溶液的色谱图如图1所示。(检测过程中的泵1流速0.40mL/min，泵2流速0.35mL/min；检测波长：570nm、440nm)
氨基酸分析仪流动相缓冲溶液(即洗脱液)包括：PH-1、PH-2、PH-3、PH-4、PH-RG，配方见表1；反应液包括：R1、R2、R3，配方见表2。氨基酸分析仪分析程序按照表3的梯度洗脱程序进行。
表1：氨基酸分析仪流动相配方
Figure BDA0001414337890000081
表2：氨基酸分析仪流动相反应液配方
Figure BDA0001414337890000082
表3：梯度洗脱程序
时间(分钟) ％B1 ％B2 ％B3 ％B4 ％B6 ％R1 ％R2 ％R3
0.0 100 0 0 0 0 50 50 0
1.5 100 0 0 0 0 50 50 0
1.6 0 100 0 0 0 50 50 0
4.5 0 100 0 0 0 50 50 0
4.6 0 0 100 0 0 50 50 0
8.5 0 0 100 0 0 50 50 0
8.6 0 0 0 100 0 50 50 0
8.9 0 0 0 100 0 50 50 0
9.0 0 0 0 0 100 50 50 0
9.1 0 0 0 0 100 0 0 100
13.0 0 0 0 0 100 0 0 100
13.1 0 100 0 0 0 0 0 100
14.0 100 0 0 0 0 0 0 100
14.1 100 0 0 0 0 50 50 0
29.0 100 0 0 0 0 50 50 0
注：表3中从9.1分钟开始是再生程序，之前是分析程序。
E、线性范围、检出限、定量限
以超纯水稀释混合标准溶液至适当浓度，得到浓度分别为0.05μmol/mL、0.1μmol/mL、0.25μmol/mL、0.5μmol/mL的系列标准曲线，采用上述氨基酸分析仪仪器条件进行测定，每个浓度的标准混合溶液分别测定3次，以保留时间定性，以色谱峰面积和对应浓度绘制标准曲线；以3倍信噪比(S/N＝3)对应浓度作为该组分的最低检出限(LOD)，以10倍信噪比(S/N＝10)对应浓度作为定量限(LOQ)，具体检测结果见表4。
表4
Figure BDA0001414337890000091
Figure BDA0001414337890000101
F、加标回收率、精密度
各称取3组约100mg饲料样品，分别添加10μmol、20μmol、50μmol 3种不同浓度的混合标准溶液，加入6mol/L盐酸溶液5mL，通入氮气，盖好罐盖，按照微波水解仪器条件设置并进行水解：其中控制微波功率为600W，控制温度为5min内从常温升至150℃，然后恒温30min；恒温结束后，将水解液进行转移定容至100mL容量瓶中，经0.45μm微孔滤膜过滤，经氨基酸分析仪测定，具体检验结果见表5。
表5
Figure BDA0001414337890000102
实施例2、鱼粉中羟脯胺酸的检测
精确称取待测鱼粉样品100mg样品放入微波水解罐内，加入6mol/L盐酸溶液5mL，通入氮气，盖好罐盖，按照微波水解仪器条件设置并进行水解：其中控制微波功率为600W，控制温度为5min内从常温升至150℃，然后恒温30min；恒温结束后，移取200μL水解液至浓缩水解管，经浓缩仪浓缩蒸干，加入3mL0.02mol/L的盐酸溶液，涡旋混合均匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，用实施例1的方法测定3组平行实验，结果取平均值，测定结果如图2。
实施例3、肉骨粉中羟脯胺酸的检测
精确称取待测肉骨粉样品100mg样品放入微波水解罐内，加入6mol/L盐酸溶液5mL，通入氮气，盖好罐盖，按照微波水解仪器条件设置并进行水解：其中控制微波功率为600W，控制温度为5min内从常温升至150℃，然后恒温30min；恒温结束后，移取200μL水解液至浓缩水解管，经浓缩仪浓缩蒸干，加入3mL0.02mol/L的盐酸溶液，涡旋混合均匀，经0.45μm微孔滤膜过滤，用实施例1的方法测定3组平行实验，结果取平均值，测定结果如图3。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (4)

1.一种羟脯氨酸的快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将待测样品进行前处理，使所述待测样品中的蛋白质水解，获得蛋白质水解产物；
S2、采用离子交换色谱法对蛋白质水解产物中的羟脯氨酸含量进行测定；
所述离子交换色谱法包括：阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、和光度法测定的步骤，
所述阳离子交换柱分离所使用的洗脱液中包括：第一洗脱液；
所述第一洗脱液为溶剂为水，溶质及其浓度分别为：柠檬酸钠0.02-0.03mol/L、氯化钠0.075-0.125mol/L、柠檬酸0.075-0.125mol/L、乙醇体积百分含量12-16％的溶液；所述第一洗脱液的pH值为3.25-3.35；
步骤S2中，所述离子交换色谱法使用的洗脱液中还包括：第二洗脱液、第三洗脱液、第四洗脱液和第五洗脱液；
所述第二洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.02-0.035mol/L、氯化钠0.1-0.15mol/L、柠檬酸0.075-0.15mol/L、乙醇体积百分含量1-3％的溶液；所述第二洗脱液的pH值为3.15-3.25；
所述第三洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.035-0.05mol/L、氯化钠0.05-0.1mol/L、柠檬酸0.05-0.1mol/L、乙醇体积百分含量0.1-0.3％的溶液；所述第三洗脱液的pH值为3.8-4.2；
所述第四洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：柠檬酸钠0.05-0.15mol/L、氯化钠0.75-1.25mol/L、柠檬酸0.025-0.5mol/L、苯甲醇体积百分含量0.3-1％的溶液；所述第四洗脱液的pH值为4.7-5.1；
所述第五洗脱液为溶剂为水，溶质及浓度分别为：氢氧化钠0.2mol/L、乙醇体积百分含量10％的溶液；
所述阳离子交换柱分离包括柱分析和柱再生，其中的柱分析按照如下梯度洗脱程序依次进行：
S201、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱1.5分钟；
S202、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S203、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱2.9分钟；
S204、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S205、第三洗脱液洗脱阳离子交换柱3.9分钟；
S206、第三洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S207、第四洗脱液洗脱阳离子交换柱0.3分钟；
S208、第四洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S209、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
所述阳离子交换柱分离中的柱再生按照如下梯度洗脱程序依次进行：
S210、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱3.9分钟；
S211、第五洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S212、第二洗脱液洗脱阳离子交换柱0.9分钟；
S213、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱0.1分钟；
S214、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱14.9分钟；
S215、第一洗脱液洗脱阳离子交换柱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述柱后茚三酮衍生使用的反应液包括反应液R1、反应液R2和反应液R3；
所述反应液R1为二丙二醇独甲醚、茚三酮和硼氢化钠按1L：30g：81mg混合得到的溶液；
所述反应液R2为二丙二醇独甲醚与茚三酮缓冲液按体积比1：1混合得到的溶液；所述茚三酮缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度分别为：乙酸钠328g/L，冰乙酸体积百分含量10％；
所述反应液R3为乙醇与水按体积比1:19混合得到的溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述柱后茚三酮衍生按照如下程序依次进行：
步骤S201～S209的柱后茚三酮衍生使用体积比为1:1的所述反应液R1和所述反应液R2进行；
步骤S210～S213的柱后茚三酮衍生使用所述反应液R3进行；
步骤S214～S215的柱后茚三酮衍生使用体积比为1:1的所述反应液R1和所述反应液R2进行。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S1按包括如下步骤的方法进行：
向待测样品中加入6mol/L盐酸溶液后通入氮气，然后在微波功率为600-1000W、温度为5-30min内从常温升至150-170℃、再保温10-50min的条件下进行微波水解，然后浓缩蒸干，加入1-3mL0.02mol/L的盐酸溶液混匀、过滤，获得所述蛋白质水解产物。
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