CN108918703B

CN108918703B - 一种鉴别蜂王浆制剂中10-hda的方法

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Publication number: CN108918703B
Application number: CN201810549806.4A
Authority: CN
Inventors: 杨俊杰; 陈重; 郭磊磊; 潘岩; 郭心灵
Original assignee: Xinyang Agriculture and Forestry University
Current assignee: Xinyang Agriculture and Forestry University
Priority date: 2018-05-31
Filing date: 2018-05-31
Publication date: 2021-05-14
Anticipated expiration: 2038-05-31
Also published as: CN108918703A

Abstract

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种鉴别蜂王浆制剂中是否掺入人工合成的10‑HDA的分析鉴别方法，该方法采用硅胶柱层析纯化方法前处理待检样品，得白色固体，然后利用反相‑高效液相色谱法检测，固定相为ODS‑C18反相柱，体积比为55：10：35的甲醇：0.03mol/L HCl：水为流动相，采用等度洗脱。该鉴别方法，灵敏度高，分离度和重现性好，鉴别特征明显，能够准确鉴别蜂王浆制剂中掺0.5%以上的人工合成的10‑HDA。

Description

一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法。

背景技术

蜂王浆是工蜂头部的分泌物，色白或淡黄，是理想的天然保健品，其味酸辛、微甘，性平；既补先天之根本，又益后天之不足；具有宣肺益气、善疏肝理气、滋补强壮、提高免疫能力的功能。蜂王浆的成分极其复杂，其主要成分包括蛋白质、多种氨基酸、维生素、脂肪酸、生物活性酶等。对人体有明显的保健作用，特别是对心血管病、血脂代谢紊乱、高血压、内分泌失调等症有良好的调治作用。

蜂王浆含有26种以上的脂肪酸，目前已确认有12种，其中10-羟基-2-癸烯酸(简称10-HDA)，占总脂肪酸的50％以上，是蜂王浆的重要成分。10-HDA是由德国科学家D.J.朗格(1921)首次在工蜂上额腺中发现的，日本学者佐藤道夫也以大量数据证实。10-HDA主要分泌于工蜂的上颚腺，1957年Batendt首先报导从王浆中分离出10-HDA，至今还未在自然界其它物质中发现此化合物。由于在自然界中只有蜂王浆中才有，所以10-HDA通常又被称为王浆酸。

10-HDA有多种生理活性,它具有抗菌、灭菌、强壮机体和抑制淋巴癌、乳腺癌等多种癌细胞的作用，还有增强机体免疫功能，防治脱发，并用作化妆品的增效剂，还用作治疗急性辐射损伤和化学物质所致损伤。10-HDA常温时为白色晶体，性质稳定，在室温或高温下长时间存放时，结构不会被破坏或完全消失。该化合物的结构如下：

目前10-HDA主要由蜂王浆浆渣中提取，对于人工合成的10-HDA的研究仍处于起步阶段。10-HDA的含量是评判蜂王浆品质的重要指标，如果10-HDA的含量≥1.4％为合格品，含量≥1.8％为优等品。虽然所有的蜂王浆制剂中都含有10-HDA，但是由于10-HDA的来源不同，导致其含有的杂质种类不同。由于蜂王浆制剂的利润高，且目前对于10-HDA的检测标准较低，造成不法商人通过添加人工合成的10-HDA，制备出检测合格的蜂王浆制剂假货。由于10-HDA在人工合成过程中会引入一些未知的杂质，且对于这些杂质还没有相关的研究。这样可能会因为这些杂质而损害消费者的健康。这极大地危害到人民群众的食品安全，危险性极大。目前对10-HDA的相关研究较多，但都集中于蜂王浆制剂中10-HDA含量的检测，而对人工合成的10-HDA中杂质的研究没有相关报道。因此，一种简单、反应灵敏、快速的对蜂王浆制剂中10-HDA的掺假的检测方法对保证人民食品和保健品安全意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法，该方法能去除绝大多数杂质的干扰，快速将蜂王浆制剂中10-HDA分离出来，并根据不同来源10-HDA的谱图，来鉴别蜂王浆制剂是否掺假。

人工合成的10-HDA与由蜂王浆浆渣提取的10-HDA所含的杂质不一样，人工合成的10-HDA中的杂质，在从蜂王浆浆渣中提取的10-HDA中没有出现过。本发明利用该区别来鉴别蜂王浆制剂中是否掺假。

为实现上述目的，本发明提供了一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法，主要包括以下步骤：

步骤1：蜂王浆制剂的前处理：

由于蜂王浆制剂中的其它成分会影响10-HDA的测定，因此需要对蜂王浆制剂进行前处理；蜂王浆制剂的前处理主要包括以下步骤：

步骤1.1：将蜂王浆制剂溶解于乙醇，并上样于30～60目柱层析硅胶；

步骤1.2：石油醚洗脱并去除石油醚洗脱部位；

步骤1.3：体积百分数50％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部位，回收过滤并干燥，得白色固体。

步骤2：将步骤1得到的白色固体用体积百分数95％的乙醇溶解，然后用反相-高效液相色谱法(RP-HPLC)分析检测。

步骤3：色谱图分析：

蜂王浆制剂中掺有人工合成的10-HDA的样品，反相-高效液相色谱图在17～22min有一个杂质峰；蜂王浆浆渣中提取的10-HDA的色谱图在17～22min无杂质峰。

进一步地，步骤1.1中所述乙醇为体积百分数95％的乙醇。

进一步地，步骤1.1中所述蜂王浆制剂：95％乙醇＝(2～3)g：1mL。

进一步地，步骤1.2中所述石油醚的使用体积为3～5倍柱体积。

进一步地，步骤1.3中所述50％乙醇的使用体积为3～4倍柱体积。

进一步地，步骤2中所述反相-高效液相色谱的色谱条件如下：

(1)固定相为ODS-C₁₈反相柱，规格为：4.6×150mm，5μm；

(2)体积比为45～60：10：30～45的甲醇：0.03mol/L HCl：水为流动相；

(3)流速为1.0mL/min；

(4)检测波长为210nm；

(5)进样量为10μL；

洗脱方式采用等度洗脱。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明方法反应非常灵敏，能检测出蜂王浆制剂中掺0.5％以上的人工合成的10-HDA。

2、本发明中对样本的前处理方法包括石油醚洗脱等，可以去除绝大多数杂质的干扰。

3、采用本发明的方法对由蜂王浆浆渣提取的10-HDA和人工合成的10-HDA的谱图存在明显的区别。而其它鉴别方法则因存在大量的杂质，对10-HDA的检测有影响。本发明方法特异性高，制剂中的其它成分不影响本发明方法的测定。

4、本发明适用于各种剂型的蜂王浆制剂中10-HDA的分析和鉴别，前处理方法简单、操作步骤少；分析方法快速、准确；鉴别真伪方法容易、判断指标清晰明确。对蜂王浆制剂标准的提高及产业化的进一步发展意义重大。

附图说明

图1为实施例1中蜂王浆浆渣提取的10-HDA的RP-HPLC色谱图，10-HDA的相对保留时间为8.540min。

图2为实施例1中人工合成的10-HDA的RP-HPLC色谱图，10-HDA的相对保留时间为8.322min。

图3为实施例2中掺0.5％人工合成10-HDA的蜂王浆制剂中10-HDA的RP-HPLC色谱图，10-HDA的相对保留时间为8.230min。

图4为实施例3中掺1.0％人工合成10-HDA的蜂王浆制剂中10-HDA的RP-HPLC色谱图，10-HDA的相对保留时间为8.387min。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限定本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中，从蜂王浆浆渣提取10-HDA包括以下步骤：将蜂王浆采用乙醚提取，使用10％的氢氧化钠水溶液洗涤乙醚层，在0℃滴加盐酸调整水层至pH＝2后，抽滤，得到的固体使用乙醚：石油醚＝3：1重结晶，得到含量为97％的10-HDA。所述蜂王浆购自浙江蜂之语股份有限公司。

人工合成的10-HDA购自武汉远城共创科技有限公司或嘉兴市远墨化工有限公司。

蜂王浆制剂包括两种，一种是新鲜蜂王浆灭菌后得到的制剂，一种是蜂王浆冻干粉，本发明中所述蜂王浆制剂为新鲜蜂王浆灭菌后得到的制剂。

实施例1蜂王浆浆渣提取的10-HDA与人工合成的10-HDA的对比

取蜂王浆浆渣提取的10-HDA(含量为97％)和人工合成的10-HDA(含量98％)各200mg，分别用体积百分数95％的乙醇溶解，定容至100mL，使用0.45μm微孔滤膜过滤后，进行RP-HPLC检测。人工合成的10-HDA购自武汉远城共创科技有限公司。

设备：岛津LC-10AT型高效液相色谱仪；Diamonsil C18色谱柱5μm，4.6×150mm。

色谱条件：

(1)固定相为ODS-C₁₈反相柱；

(2)流动相为甲醇：0.03mol/L HCl：水(V/V/V)＝55：10：35；

(3)流速为1.0mL/min；

(4)检测波长为210nm；

(5)进样量为10μL。

结果见图1和图2，从RP-HPLC色谱图中可以发现，人工合成的10-HDA的色谱图在19.235min处比蜂王浆浆渣提取的10-HDA的RP-HPLC色谱图多一个杂质峰。

实施例2掺0.5％人工合成10-HDA的蜂王浆制剂中10-HDA的RP-HPLC分析

人工合成的10-HDA购自武汉远城共创科技有限公司。

取掺0.5％人工合成10-HDA的蜂王浆制剂样品40g，用20mL 95％的乙醇超声辅助溶解，离心，去除不溶性物质；将滤液上样于30～60目的柱层析硅胶，上样完成后用3倍柱体积的石油醚洗脱，弃去该部位的洗脱液；再用3倍柱体积的体积百分数50％乙醇洗脱，得乙醇洗脱部位；将此洗脱液回收至无乙醇味，出现白色固体；再继续回收水相至适量的体积，抽滤，得白色固体，60℃条件下鼓风干燥6h烘干，备用。

将上述白色固体用体积百分数95％的乙醇溶解至2mg/mL，然后进行色谱检测。

色谱条件：

(1)固定相为ODS-C₁₈反相柱；

(2)流动相为甲醇：0.03mol/L HCl：水(V/V/V)＝45：10：30；

(3)流速为1.0mL/min；

(4)检测波长为210nm；

(5)进样量为10μL。

结果如图3所示：掺0.5％人工合成10-HDA的蜂王浆制剂的色谱图在18.937min处有一个杂质峰。

实施例3掺1.0％人工合成10-HDA的蜂王浆制剂中10-HDA的RP-HPLC分析

人工合成的10-HDA购自嘉兴市远墨化工有限公司。

取掺1.0％人工合成10-HDA的蜂王浆制剂样品50g，用20mL95％的乙醇超声辅助溶解，离心，去除不溶性辅料；将滤液上样于30～60目的柱层析硅胶，上样完成后用5倍柱体积的石油醚洗脱，弃去该部位的洗脱液；再用4倍柱体积的体积百分数50％乙醇洗脱，得乙醇洗脱部位；将此洗脱液回收至无乙醇味，出现白色固体；再继续回收水相至适量的体积，抽滤，得白色固体，60℃条件下鼓风干燥6h烘干，备用。

上述白色固体用体积百分数95％的乙醇溶解至2mg/mL，然后进行色谱检测。设备：岛津LC-10AT型高效液相色谱仪；Diamonsil C18色谱柱5μm，4.6×150mm。

色谱条件：

(1)固定相为ODS-C₁₈反相柱；

(2)流动相为甲醇：0.03mol/L HCl：水(V/V/V)＝60：10：45；

(3)流速为1.0mL/min；

(4)检测波长为210nm；

(5)进样量为10μL。

结果如图4所示，掺1.0％人工合成10-HDA的蜂王浆制剂的色谱图在19.522min处有一个杂质峰。

由RP-HPLC色谱图可得，与浆渣提取的10-HDA的RP-HPLC色谱图相比，掺入人工合成的10-HDA的蜂王浆制剂的RP-HPLC谱图发生了明显的变化，在19min前后出现了一个杂质峰。该杂质峰的峰高和峰面积的变化与人工合成的10-HDA的加入量成正比：实施例2(图3)中杂质的面积归一法含量为0.003％，实施例3(图4)中杂质面积归一法含量为0.006％。

利用该杂质峰，可以鉴别蜂王浆制剂的真伪，可以非常容易的鉴别出蜂王浆制剂中是否掺有人工合成的10-HDA。

以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，仅仅用以解释本发明，并非限制本发明实施范围，对于本技术领域的技术人员来说，当然可根据本说明书中所公开的技术内容，通过置换或改变的方式轻易做出其它的实施方式，故凡在本发明的原理及工艺条件所做的变化和改进等，均应包括于本发明申请专利范围内。

Claims

1.一种鉴别蜂王浆制剂中10-HDA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：蜂王浆制剂的前处理：

蜂王浆制剂的前处理包括以下步骤：

步骤1.1：将蜂王浆制剂溶解于乙醇溶液，并上样于30～60目柱层析硅胶；

步骤1.2：石油醚洗脱并去除石油醚洗脱部位；

步骤1.3：体积百分数50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱部位，回收过滤并干燥，得白色固体；

步骤2：将步骤1得到的白色固体用体积百分数95%的乙醇溶解，然后用反相-高效液相色谱法分析检测；所述反相-高效液相色谱的色谱条件如下：

（1）固定相为ODS-C₁₈反相柱；

（2）体积比为45～60：10：30～45的甲醇：0.03mol/L HCl：水为流动相；

（3）流速为1.0mL/min；

（4）检测波长为210nm；

（5）进样量为10μL；

步骤3：色谱图分析：蜂王浆制剂中掺有人工合成的10-HDA的样品，反相-高效液相色谱图在17～22min有一个杂质峰；蜂王浆浆渣中提取的10-HDA的色谱图在17～22min无杂质峰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.1中所述乙醇溶液为体积百分数95%的乙醇。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1.1中所述蜂王浆制剂：95%乙醇=（2～3）g：1mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.2中所述石油醚的使用体积为3～5倍柱体积。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1.3中所述50%乙醇的使用体积为3～4倍柱体积。