CN110538112A - 一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物及其制备方法和应用。光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%~47.5%,甘草多糖30%~50%,甘草皂苷为余量。本发明的光果甘草提取物组合物通过光甘草定、甘草多糖及甘草皂苷三者组合产生协同功效,有助于改善在使用单一美白功效产品时可能产生的皮肤干燥、刺激等副作用,光果甘草提取物组合物对酪氨酸酶的抑制率可以达到66.65%,皮肤免疫屏障活性为0.88左右,具有优异的美白和增强皮肤免疫屏障的协同功效,使肌肤更健康亮丽、润泽,另外,本发明通过特定的分子印迹树脂纯化制备得到浅色光甘草定,颜色浅,品质高,更加适用于化妆品制品的制备。
Description
技术领域
本发明涉及日用化妆品技术领域,更具体地,涉及一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物及其制备方法和应用。
背景技术
传统美白方法调控黑色素采用酪氨酸酶抑制剂氨基汞、氢醌、曲酸等,均对皮肤产生了极为严重的毒副作用,包括近年日本“神效”美白功能因子杜鹃醇,也可能导致白癜风,源于天然的光甘草定具有良好的抑制黑色素功效,充分显示其在美白产品中具有广阔的市场前景。美白产品能够产生美白功效主要是通过美白成分抑制黑色素生成、运输及排泄,促进皮肤的代谢循环,从而达到美白功效。但是,在此过程中也会消化肌肤大量的水分,容易造成皮肤干燥,同时如果大量美白剂残留在皮肤表层,还容易引起皮肤刺激、过敏等副作用,造成角质层蛋白流失,继而导致皮肤免疫屏障功能受损。研究表明,皮肤免疫屏障是人体皮肤防御外界物理、化学损害的重要屏障,皮肤免疫屏障损伤,容易引起皮肤过敏、银屑病等皮肤疾病,因此如何解决现有美白产品造成的皮肤免疫屏障功能受损问题也是美白产品研发所急需解决的问题。现有技术CN 109549966A公开了一种光果甘草提取物及其制备方法和应用,其中虽然公开了光果甘草提取物适合于应用在美白、抗炎、抗过敏类化妆品中,但是其只是验证了其对黑色素络氨酸酶和透明质酸酶的抑制作用,即美白功效,并未揭示其是否能解决美白过程中对皮肤免疫屏障的损害问题。
因此,基于化妆品开发市场的需求,研制一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物对于美白产品的研发也具有非常重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有甘草定美白产品容易导致皮肤免疫屏障功能受损的缺陷和不足,提供一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物。
本发明的另一目的是提供一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物的制备方法。
本发明的另一目的是提供上述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物在制备具备增强皮肤免疫屏障和美白亮肤功效的日化产品和/或皮肤外科用制品中的应用。
本发明的又一目的在于提供一种具备增强皮肤免疫屏障和美白亮肤功效的日化产品和/或皮肤外科用制品。
本发明上述目的通过以下技术方案实现:
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,所述光甘果草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%~47.5%,甘草多糖30%~50%,甘草皂苷为余量。
其中,需要说明的是:本发明的光果甘草提取物组合物中光甘草定以光甘草定化合物有效含量计算,甘草多糖以从光果甘草中提取出来的多糖提取物总质量计算,该多糖提取物是不同分子量的多糖的混合物,甘草皂苷以从光果甘草中提取出来的甘草皂苷总质量计算。
本发明的光果甘草提取物组合物中的光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷均可以通过现有的提取方法获得,或者可以市场购买得到。
甘草多糖作为增强皮肤免疫活性物质,以及改善光甘草定水溶性的增溶材料,在改善光甘草定水溶性的同时,发挥增强皮肤免疫屏障功效,同时甘草皂苷具有良好的抗过敏功效,三者组合产生协同功效,经动物试验证实,具有显著增强皮肤免疫屏障功效,有助于改善在使用单一美白功效产品时可能产生的皮肤干燥、刺激等副作用,使肌肤更健康亮丽、润泽。
本发明的光甘草组合物以天然来源的美白剂光甘草定、甘草多糖、甘草皂苷为活性成分,进行合理配伍,得到具增强皮肤免疫屏障功效的光果甘草提取物组合物,同时改善光甘草定水溶性,具有美白亮肤的功效。
优选地,所述光甘草组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%~25%,甘草多糖40%~60%,甘草皂苷为余量。
例如可以选择为光甘草定5%,甘草多糖40%,甘草皂苷为余量;
光甘草定5%,甘草多糖55%,甘草皂苷为余量;
光甘草定15%,甘草多糖40%,甘草皂苷为余量;
光甘草定18%,甘草多糖48%,甘草皂苷为余量;
或光甘草定25%,甘草多糖60%,甘草皂苷为余量的配伍组合。
更优选地,所述光甘草组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定25%,甘草多糖60%,甘草皂苷为余量。
本发明的甘草多糖可以选择市售的或者现有方法提取得到的甘草多糖提取物,发明人无意中发现,相对于其他分子量范围的甘草多糖,优选分子量为2k~150k道尔顿的甘草多糖活性更显著。因此,本发明甘草多糖优选为分子量范围为2k~150k道尔顿,其中分子量大于5k道尔顿的占70%以上。
例如可以选择分子量范围为5k~150k道尔顿的甘草多糖或分子量范围为10k~10k道尔顿的甘草多糖。
更进一步地,本发明优选分子量范围为7.5k~140k道尔顿甘草多糖。
为了进一步优化光果甘草提取物组合物的增强皮肤免疫屏障功能,优选地,其中光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷通过如下方法提取得到:
S1.取光果甘草根粉,按料液比1:5~1:10加入95%乙醇提取,在50℃~70℃下提取1h~2h,过滤,得到滤液和滤渣,滤液浓缩得到浸膏,浸膏溶解后树脂纯化得到光甘草定;
S2.将S1中的滤渣加水提取,过滤,减压浓缩得到浓缩液,按浓缩液体积加入3~4倍无水乙醇,得到沉淀和上清液部分,取上清液脱色,过滤,浓缩干燥,得到甘草皂苷;
S3.取S2中的沉淀脱蛋白,冷冻干燥后加水复溶,采用DEAE-纤维素层析柱,依次采用蒸馏水、0.01mol/L~0.5mol/L的NaCl溶液洗脱,蒸馏水洗脱流速为1.0mL/min,NaCl溶液洗脱流速为10mL/管,分别收集洗脱液部分,减压浓缩,冷冻干燥得到甘草多糖。
通过上述提取方法提取得到的甘草多糖中的多糖质量含量≥80%。。
其中,本发明的光果甘草根粉优选粉碎过20目筛的光果甘草根粉末,光果甘草优选乌兹别克光果甘草。相对于其他产地的光果甘草,乌兹别克斯坦所产的光果甘草中可以提取的光甘草定含量更高。
浸膏溶解后树脂纯化的具体操作可以为:将浸膏用40%~70%乙醇溶液溶解,然后上样,使其流过装有不含光甘草定聚合物的分子印迹树脂的层析柱,流速≤1BV/h,上样结束后用75%乙醇溶液洗脱,流速≤2BV/h,收集洗脱液,减压浓缩,经真空干燥得浅黄色光甘草定粉末。
其中上样结束是指全部浸膏溶解液均流过层析柱。
S2中所述将S1中的滤渣加水提取,加水量优选为滤渣质量的8~14倍,优选提取2次,每次提取1~3h。
减压浓缩的温度为50℃~65℃,上清液脱色优选在取上清液中加入上清液质量0.2%~1%的活性炭保温脱色,过滤后,浓缩干燥优选温度45℃~65℃。
S3中脱蛋白可以采用Sevag法脱蛋白,减压浓缩温度可以为45℃~65℃。
另外,我们还发现市售的光甘草定,尽管其能起到与本申请所述光甘草定类似的作用,但其颜色较深,添加至化妆品基质中呈棕黄色至棕色,影响化妆品成品品质,加之光甘草定水溶性较差,严重限制其在日化产品中的应用。
为了获得浅颜色、高品质的光甘草定,我们对光甘草定的提取方法进行了改进,优选地,本发明的S1中所述树脂纯化的树脂优选通过如下方法制备得到的分子印迹树脂:
以异甘草素模板,以三氟甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,2,2’偶氮二异丁腈为引发剂,在惰性气体保护下,以氯仿与甲醇为混合溶剂,3℃~5℃下反应12~24h,得到含有光甘草定的分子印迹聚合物,洗脱分子聚合物中的光甘草定模板,得到不含光甘草定模板分子的分子印迹树脂。
光甘草定颜色是光甘草定产品主要指标之一,通过产品表观颜色深浅可以区分不同品质的光甘草定,颜色较浅则表示产品具有较高的品质。本发明采用分子印迹树脂模板,选择性吸附光甘草定,可以获得浅颜色、高品质的光甘草定,光甘草定的颜色及品质比市售产品更佳。
其中,光甘草定模板的洗脱优选采用含质量分数为25%乙酸的甲醇溶剂。
本发明还保护所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光甘草组合物的制备方法,具体如下:
将光甘草定、甘草多糖和甘草酸皂苷按质量百分比混合均匀,按1:10~30料液比加入浓度为30%~60%的乙醇水,搅拌溶解,45℃~65℃减压浓缩,冷冻干燥后得到具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物。
发明人的研究中意外发现通过本发明的特定料液比控制可以获得增强皮肤免疫活性较好的组合物。
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物在制备具备增强皮肤免疫屏障和美白亮肤功效的日化产品和/或皮肤外科用药中的应用也在本发明的保护范围之内。本发明的光果甘草提取物组合物增强皮肤免疫屏障并具有良好的美白功效,有利于解决或改善单一功能美白产品存在的缺陷,可作为有效成分广泛应用于制备具备增强皮肤免疫屏障和美白亮肤功效的日化产品和/或皮肤外科用制品中。
本发明还保护一种具备增强皮肤免疫屏障和美白亮肤功效的日化产品和/或皮肤外科用制品,其由所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物和其他可接受的辅料制备而成。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
(1)本发明提供了一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,通过光甘草定、甘草多糖及甘草皂苷三者组合产生协同功效,在改善光甘草定水溶性的同时具有显著增强皮肤免疫屏障功效,有助于改善在使用单一美白功效产品时可能产生的皮肤干燥、刺激等副作用,使肌肤更健康亮丽、润泽。
(2)本发明的光甘草定通过特定的分子印迹树脂纯化,制备得到浅色光甘草定提取物,解决传统工艺光甘草定提取物颜色深,影响产品品质的问题。
(3)本发明的光果甘草提取物组合物对酪氨酸酶的抑制率可以达到86.65%,皮肤免疫屏障活性为0.88左右,具有优异的美白和增强皮肤免疫屏障的协同功效。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非另有说明,本发明实施例采用的原料试剂为常规购买的原料试剂。
实施例1
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,所述光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%,甘草多糖30%,甘草皂苷为65%。
其中光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷购买自广州市康伦生物技术有限公司。
实施例2
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,所述光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定47.5%,甘草多糖30%,甘草皂苷为22.5%。
其中光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷购买自广州市康伦生物技术有限公司。
实施例3
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%,甘草多糖55%,甘草皂苷为40%。
其中光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷通过如下方法提取得到:
S1.取光果甘草根饮片,粉碎过20目筛,按料液比1:10加入95%乙醇提取,在温度70℃下提取2h,过滤,得到滤液和滤渣,重复提取1次,合并滤液,55℃条件下浓缩至浸膏,用50%乙醇溶液溶解然后上样,使其流过装有不含光甘草定聚合物的层析柱,流速1BV/h,上样结束后用75%乙醇溶液洗脱,流速2BV/h,分别收集洗脱液,浓缩,经真空干燥得淡黄色光甘草定粉末;
S2.将S1中的滤渣加入12倍水,提取2次,每次提取2h,过滤,合并滤液,50℃减压浓缩,得到浓缩液,按浓缩液体积加入4倍无水乙醇,得到沉淀和上清液部分,取上清液加0.5%活性炭保温脱色,过滤,50℃浓缩,60℃干燥,得到甘草皂苷;
S3.取S2中的沉淀经Sevag法脱蛋白后,冷冻干燥后加水复溶,采用DEAE-纤维素层析柱(DEAE-52),依次采用蒸馏水、0.15mol/L的NaCl溶液洗脱,流速1.0mL/min、10mL/管,分别收集蒸馏水、0.15mol/L的NaCl溶液的洗脱液部分,55℃减压浓缩,冷冻干燥得到甘草多糖。
其中分子印迹树脂的制备过程如下:以颜色较深的黄酮类物质异甘草素模板,以三氟甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,2,2′偶氮二异丁腈为引发剂,在氮气保护下,氯仿与甲醇混合溶剂,3℃反应24h,得到含有光甘草定的分子印迹聚合物,以25%乙酸的甲醇溶剂洗脱分子聚合物中的光甘草定模板,终得到不含模板分子的印迹聚合物。
光果甘草提取物组合物的制备方法,具体如下:将光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷按质量百分比混合均匀,按1:20料液比加入浓度为50%乙醇水,搅拌溶解,65℃减压浓缩,冷冻干燥后得到光果甘草提取物组合物。
实施例4
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定15%,甘草多糖40%,甘草皂苷为45%。
光果甘草提取物组合物的制备方法包括如下步骤:
S1.取光果甘草根饮片,粉碎过20目筛,按料液比1:8加入95%乙醇提取,在温度65℃下提取2h,过滤,得到滤液和滤渣,重复提取1次,合并滤液,48℃条件下浓缩至浸膏,取浸膏用55%乙醇溶液溶解然后上样,使其流过装有不含光甘草定聚合物的层析柱,流速1BV/h,上样结束后用75%乙醇溶液洗脱,流速2BV/h,分别收集洗脱液,浓缩,经真空干燥得淡黄色光甘草定粉末;
S2.将S1中的将滤渣加入14倍水,提取2次,每次提取3h,过滤,合并滤液,65℃减压浓缩得到浓缩液,按浓缩液体积加入3.5倍无水乙醇,得到沉淀和上清液部分,取上清液加0.8%活性炭保温脱色,过滤,45℃浓缩,65℃干燥,得到甘草皂苷;
S3.取S2中的沉淀经Sevag法脱蛋白后,冷冻干燥后加水复溶,采用DEAE-纤维素层析柱(DEAE-52),依次采用蒸馏水、0.01mol/L的NaCl溶液洗脱,流速1.0mL/min、10mL/管,分别收集蒸馏水、0.1mol/L的NaCl溶液的洗脱液部分,60℃减压浓缩,冷冻干燥得到甘草多糖。
其中分子印迹树脂的制备过程如下:以颜色较深的黄酮类物质异甘草素模板,以三氟甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,2,2′偶氮二异丁腈为引发剂,在氮气保护下,氯仿与甲醇混合溶剂,5℃反应6h,得到含有光甘草定的分子印迹聚合物,以25%乙酸的甲醇溶剂洗脱分子聚合物中的光甘草定模板,终得到不含模板分子的印迹聚合物。
光果甘草提取物组合物的制备方法,具体如下:将光甘草定、甘草多糖和甘草酸按质量百分比混合均匀,按1:30料液比加入浓度为30%乙醇水,搅拌溶解,45℃减压浓缩,冷冻干燥后得到光甘草定提取物组合物。
实施例5
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定18%,甘草多糖48%,甘草皂苷为34%。
光果甘草提取物组合物的制备方法包括如下步骤:
S1.取光果甘草根饮片,粉碎过20目筛,按料液比1:8加入95%乙醇提取,在温度60℃下提取2h,过滤,得到滤液和滤渣,重复提取1次,合并滤液,55℃条件下浓缩至浸膏,取浸膏用60%乙醇溶液溶解然后上样,使其流过装有不含光甘草定聚合物的层析柱,流速1BV/h,上样结束后用75%乙醇溶液洗脱,流速2BV/h,分别收集洗脱液,浓缩,经真空干燥得淡黄色光甘草定粉末;
S2.将S1中的将滤渣加入13倍水,提取2次,每次提取2.5h,过滤,合并滤液,55℃减压浓缩得到浓缩液,按浓缩液体积加入3倍无水乙醇,得到沉淀和上清液部分,取上清液加1%活性炭保温脱色,过滤,45℃浓缩,65℃干燥,得到甘草皂苷;
S3.取S2中的沉淀经Sevag法脱蛋白后,冷冻干燥后加水复溶,采用DEAE-纤维素层析柱(DEAE-52),依次采用蒸馏水、0.01mol/L、0.15mol/L的NaCl溶液洗脱,流速1.0mL/min、10mL/管,分别收集蒸馏水、0.01mol/L、0.15mol/L的NaCl溶液的洗脱液部分,65℃减压浓缩,冷冻干燥得到甘草多糖。
其中分子印迹树脂的制备过程如下:以颜色较深的黄酮类物质异甘草素模板,以三氟甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,2,2′偶氮二异丁腈为引发剂,在氮气保护下,氯仿与甲醇混合溶剂,3℃反应22h,得到含有光甘草定的分子印迹聚合物,以25%乙酸的甲醇溶剂洗脱分子聚合物中的光甘草定模板,终得到不含模板分子的印迹聚合物。
光果甘草提取物组合物的制备方法,具体如下:将光甘草定、甘草多糖和甘草酸按质量百分比混合均匀,按1:10料液比加入浓度为60%乙醇水,搅拌溶解,50℃减压浓缩,冷冻干燥后得到光甘草定提取物组合物。
实施例6
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定25%,甘草多糖60%,甘草皂苷为15%。
光果甘草提取物组合物的制备方法包括如下步骤:
S1.取光果甘草根饮片,粉碎过20目筛,按料液比1:5加入95%乙醇提取,在温度50℃下提取1h,过滤,重复提取1次,合并滤液,45℃条件下浓缩至浸膏,去浸膏用40%乙醇溶液溶解然后上样,使其流过装有不含光甘草定聚合物的层析柱,流速1BV/h,上样结束后用75%乙醇溶液洗脱,流速2BV/h,分别收集洗脱液,浓缩,经真空干燥得淡黄色光甘草定粉末;
S2.将S1中的将滤渣加入10倍水,提取2次,每次提取1.5h,过滤,合并滤液,50℃~65℃减压浓缩得到浓缩液,按浓缩液体积加入4倍无水乙醇,得到沉淀和上清液部分,取上清液加0.2%活性炭保温脱色,过滤,65℃浓缩干燥,得到甘草皂苷;
S3.取S2中的沉淀经Sevag法脱蛋白后,冷冻干燥后加水复溶,采用DEAE-纤维素层析柱(DEAE-52),依次采用蒸馏水、0.01mol/L、0.15mol/L的NaCl溶液洗脱,流速1.0mL/min、10mL/管,分别收集蒸馏水、0.15mol/L的NaCl溶液的洗脱液部分,65℃减压浓缩,冷冻干燥得到甘草多糖。
其中分子印迹树脂的制备过程如下:以颜色较深的黄酮类物质异甘草素模板,以三氟甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,2,2′偶氮二异丁腈为引发剂,在氮气保护下,氯仿与甲醇混合溶剂,3℃反应12h,得到含有光甘草定的分子印迹聚合物,以25%乙酸的甲醇溶剂洗脱分子聚合物中的光甘草定模板,终得到不含模板分子的印迹聚合物。
光果甘草提取物组合物的制备方法,具体如下:将光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷按质量百分比混合均匀,按1:20料液比加入浓度为50%乙醇水,搅拌溶解,65℃减压浓缩,冷冻干燥后得到光果甘草提取物组合物。
实施例7
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%,甘草多糖55%,甘草皂苷为40%,
其中甘草多糖中的多糖质量含量为80%,甘草多糖的分子量范围为10k~100k道尔顿,其中分子量大于5k道尔顿的占70%。
实施例8
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%,甘草多糖55%,甘草皂苷为40%,
其中甘草多糖中的多糖质量含量为90%,甘草多糖的分子量范围为5k~150k道尔顿。
对比例1
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定40%,甘草多糖60%,其中光甘草定和甘草多糖购买自广州市康伦生物技术有限公司,同实施例1。
对比例2
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定40%,甘草皂苷60%,其中光甘草定和甘草皂苷购买自广州市康伦生物技术有限公司,同实施例1。
对比例3
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定3%,甘草多糖65%,甘草皂苷为32%,其中光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷的提取方法与实施例3相同。
对比例4
一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定40%,甘草多糖25%,甘草皂苷为35%,其中光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷的提取方法与实施例3相同。
结果检测
(1)酪氨酸酶抑制实验
实验方法如下:
溶剂配制:
称取5.7055g K2HPO4,溶于蒸馏水中,并用蒸馏水滴定至500ml,充分溶解,再往其中加入KH2PO4,充分搅拌,并用PH计测其PH值,直至PH=6.8;
0.0mmol/L左旋多巴(用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制、现配现用):称量0.0986g左旋多巴溶于50ml磷酸盐缓冲液中,充分溶解;
200U/mL酪氨酸酶(用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制、现配现用):称量0.004g酪氨酸酶溶于50ml磷酸盐缓冲液中,充分溶解(冰上放置,防止酶失活);
不同浓度的提取物组合物样品溶液(水溶性的样品直接用pH=6.8的磷酸盐缓冲液配制;非水溶性的样品视样品具体性质而定)。
实验步骤:
1)先将10.0mmol/L左旋多巴置于96孔板中;
2)再加入不同浓度的待测天然产物样品,在室温下放置5min;
3)混匀后加入200U/mL酪氨酸酶水溶液,立即混匀室温培育25min;
4)酶标仪后测定吸光度OD475。
5)待测样品对酪氨酸酶的抑制率按下式计算:
抑制率(%)=(OD2-OD1+OD3)/(OD2-OD4)×100%,
式5)中:
(A组)OD1是指含有底物、酪氨酸酶、待测样品的测活体系的吸光度值;
(B组)OD2是指含有底物、酪氨酸酶,但不含样品的测活体系的吸光度值;
(C组)OD3是指含有底物、样品,但不含酪氨酸酶的测活体系的吸光度值;
(D组)OD4是指含有底物,但不含酪氨酸酶、样品的测活体系的吸光度值。
样品抑制酪氨酸酶活性实验结果见表1和表2所示。
表1.样品抑制酪氨酸酶活性实验结果(抑制率%)
表2(光甘草定的浓度0.05%)
序号 | 酪氨酸酶活性抑制率/% |
实施例1 | 86.65 |
实施例2 | 83.74 |
实施例4 | 84.19 |
实施例5 | 83.55 |
实施例6 | 84.23 |
实施例7 | 85.93 |
实施例8 | 85.41 |
对比例1 | 80.31 |
对比例2 | 81.76 |
对比例3 | 82.09 |
对比例4 | 82.23 |
由结果可知,实施例1-光甘草定组合物抑制酪氨酸酶活性,明显优于光甘草定(40)样品。
(2)皮肤免疫功效评价实验
实验方法如下:
选用Balb/c雌性小鼠,18g~20g;分成空白组、模型组(咪喹莫特)、阳性组(他克莫司)、光甘草定(40)、甘草多糖、甘草皂苷美白组合物;阳性与样品给药剂量为30mg/mL;
将小鼠用脱毛刀小心地对小鼠背部剃去大部分的绒毛,形成一个2×5cm的脱毛区域,再以6%的硫化钠溶液小心涂抹至背部润湿,30秒后小心涂去多余的硫化钠溶液,用去离子水冲洗干净,用电风吹吹干,小鼠休息2天。根据给药的种类和剂量进行给药,空白组背部每次给予凡士林涂抹,其他组每次均给60mg/kg/d的咪喹莫特乳膏,间隔4h后再给相应浓度的治疗药物,以此计为一周期。实验结束,采用颈椎脱臼法处死小鼠,背部皮肤以生物解剖剪刀和镊子取下,在0.9%生理盐水清洗,采用试剂盒方法检测IL-17指标。
检测结果如下表3。
表3皮肤免疫屏障活性(IL17因子表达)
注:**,表示与模型组相比,P<0.01;*,表示与模型组相比,P<0.05
由结果可知,实施例1-光果甘草提取物组合物抑制IL17因子表达,明显优于光甘草定(40)、甘草多糖样品,说明本发明技术制备光甘草定美白组合物具有增强皮肤免疫屏障,美白亮肤功效。
(3)提取物性能鉴定
对实施例3-6通过本发明的特定提取方法提取得到的光甘草定和甘草多糖的性能进行检测,包括光甘草定的颜色检测,甘草多糖提取物中的多糖含量和多糖分子量范围检测,具体检测方法如下:
光甘草定的颜色的检测方法为:在非直射阳光条件下,取样品进行目测。
甘草多糖中多糖含量的检测方法为:
1.标准溶液配制
采用苯酚硫酸法测定并计算甘草多糖含量。
标准葡萄糖溶液的配制:称取100mg葡萄糖标准品,取105℃烘干至恒重,在100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度,摇匀定容,置于4℃冰箱中贮存。
2.标准曲线的制作
精密移取葡萄糖标准储备液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置10mL容量瓶,加蒸馏水定容,配制成含葡萄糖0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL的系列葡萄糖标准溶液。分别移取上述系列葡萄糖标准溶液各1mL,置10mL具塞玻璃试管中,依次加入0.5mL 5%苯酚溶液,2.5mL浓硫酸,充分涡旋,冷却至室温,另取1mL蒸馏水,按照上述操作,作为空白对照。将上述溶液分别在490nm波长处测定吸光度值;得回归方程y=10.25X-0.013,r=0.9997,表明葡萄糖标准品在0.00~0.1mg/mL内浓度与吸光度值呈良好的线性关系。
3.甘草多糖含量测定分别称取0.25g甘草多糖,按料液比1:40加入水,置于90℃水浴3h,5000r/min离心15min后取上清液,加5倍量无水乙醇,于4℃冰箱中静置过夜,沉淀物加水溶解至100mL,即得甘草多糖溶液。取1.0mL甘草多糖溶液于25mL具塞试管中,加入5%苯酚溶液0.5mL和浓硫酸溶液2.5mL,摇匀,沸水浴反应30min,冷却后测其吸光度值,平行测定3次,在“2”项确定的检测波长处测定吸光度,测定多糖含量并按以下公式计算。
多糖含量(%)=(CV×稀释倍数)/M×100。其中:C为测得吸光度对应的浓度;V为提取液的体积;M为甘草多糖原料质量。
甘草多糖中多糖分子量范围的检测方法为:
1.色谱条件
采用Waters 1525高效液相色谱系统,检测器为2414示差检测器,色谱柱选用TSKgel G4000PWXL,流动相为超纯水,流速1mL/min,进样量为1μL。
2.标准曲线的制作
取不同分子量的葡聚糖标准品(1k、5k、12k、50k、80k、150k、270k、670kDa)配成2.0mg/m L溶液,过0.45μm微孔滤膜后,按上述液相条件分别进样。以保留时间为横坐标,以lg Mw为纵坐标,出峰时间为横坐标绘制标准曲线。
3.分子量大小测定
将甘草多糖样品配制成2.0mg/mL浓度,过0.45μm微孔滤膜后,按上述液相条件进样。以保留时间(min)为横坐标,以lg Mw为纵坐标,对照标准曲线可计算得到多糖分子量。
检测结果如表4所示。
表4
显然,本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,其特征在于,所述光甘果草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%~47.5%,甘草多糖30%~50%,甘草皂苷为余量。
2.如权利要求1所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,其特征在于,所述光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定5%~25%,甘草多糖40%~60%,甘草皂苷为余量。
3.如权利要求2所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,其特征在于,所述光果甘草提取物组合物由如下质量百分比组分组成:光甘草定25%,甘草多糖60%,甘草皂苷为余量。
4.如权利要求1所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,其特征在于,所述甘草多糖的分子量范围为2k~150k道尔顿,其中分子量大于5k道尔顿的占70%以上。
5.如权利要求4所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,其特征在于,所述甘草多糖的分子量范围为7.5k~140k道尔顿。
6.如权利要求1所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,其特征在于,所述光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷通过如下方法提取得到:
S1.取光果甘草根粉,按料液比1:5~1:10加入95%乙醇提取,在50℃~70℃下提取1h~2h,过滤,得到滤液和滤渣,滤液浓缩得到浸膏,浸膏溶解后树脂纯化得到光甘草定;
S2.将S1.中的滤渣加水提取,过滤,减压浓缩得到浓缩液,按浓缩液体积加入3~4倍无水乙醇,得到沉淀和上清液,取上清液脱色,过滤,浓缩干燥,得到甘草皂苷;
S3.取S2.中的沉淀脱蛋白,冷冻干燥后加水复溶,采用DEAE-纤维素层析柱,依次采用蒸馏水、0.01mol/L~0.5mol/L的NaCl溶液洗脱,蒸馏水洗脱流速为1.0mL/min,NaCl溶液洗脱流速为10mL/管,分别收集洗脱液部分,减压浓缩,冷冻干燥得到甘草多糖。
7.如权利要求4所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物,其特征在于,S1.中所述树脂纯化所使用的树脂的制备方法如下:以异甘草素模板,以三氟甲基丙烯酸为功能单体,乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂,2,2’偶氮二异丁腈为引发剂,在惰性气体保护下,以氯仿与甲醇为混合溶剂,3℃~5℃下反应12~24h,得到含有光甘草定的分子印迹聚合物,洗脱分子聚合物中的光甘草定模板,得到不含光甘草定模板分子的分子印迹树脂。
8.权利要求1~7任意一项所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将光甘草定、甘草多糖和甘草皂苷按质量百分比混合均匀,按1:10~30料液比加入浓度为30%~60%的乙醇水,搅拌溶解,45℃~65℃减压浓缩,冷冻干燥后得到具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物。
9.权利要求1~7任意一项所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物在制备具备增强皮肤免疫屏障和美白亮肤功效的日化产品和/或皮肤外科用制品中的应用。
10.一种具备增强皮肤免疫屏障和美白亮肤功效的日化产品和/或皮肤外科用制品,其特征在于,其由权利要求1~7任意一项所述具有增强皮肤免疫屏障功能的光果甘草提取物组合物和其他可接受的辅料制备而成。
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