CN115089694A

CN115089694A - 一种甘草蛋白提取物及其新用途

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Publication number: CN115089694A
Application number: CN202210884691.0A
Authority: CN
Inventors: 柏冬; 郭琴; 王欢欢; 高源�
Original assignee: INSTITUTE OF BASIC THEORY CACMS
Current assignee: INSTITUTE OF BASIC THEORY CACMS
Priority date: 2022-07-25
Filing date: 2022-07-25
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2042-07-25
Also published as: CN115089694B

Abstract

本申请提供一种甘草蛋白提取物及其在制备具有镇痛作用的药物中的应用。本申请研究证实所述甘草蛋白提取物具有明显的抗炎、镇痛作用，为缓解人体炎症、疼痛提供了一个新的治疗手段。

Description

一种甘草蛋白提取物及其新用途

技术领域

本申请涉及一种中药提取物及其新用途，具体涉及一种甘草蛋白提取物及其在镇痛方面的新用途，属于中医药领域。

背景技术

中药大分子是与传统的中药小分子相对的一类成分，通常包括所有分子质量大与1.5kDa的生物体内源性成分或采用生物技术制得的物质。常见的中药大分子物质有多糖、蛋白质和部分多肽等。

蛋白是广泛存在于中药中的一类大分子物质，目前用于中药糖蛋白提取的方法主要有水提、稀盐溶液和缓冲溶液浸提、酸碱溶液提取以及酶解法等。近年来对中药蛋白的研究日益增多，许多研究发现它具有显著的药用功效和保健功能，如免疫调节、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等，如肉桂糖蛋白能够增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性，对B细胞产生免疫球蛋白(Ig)和单核细胞产生白细胞介素(IL-1)有促进作用；山药及丹参糖蛋白均能明显增强小鼠免疫器官胸腺器官指数及巨噬细胞吞噬功能，促进T细胞的增殖、分化及体液免疫中抗体的生成；玉竹及蒲公英糖蛋白均被发现具有较强的体外抗氧化活性，对羟基自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基具有较强的清除作用，对脂质过氧化具有抑制作用，二者均能提高小鼠血清、肝脏和脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH·Px)活性，降低丙二醛(MDA)含量；天麻糖蛋白能够提高SOD活力及NO含量，降低MDA含量及MPO活性，以改善胃黏膜局部的血液循环、清除氧自由基达到保护胃黏膜的作用。由此可见，中药中的蛋白类大分子化合物具有不可替代的的优势。

甘草的药用历史悠久，在临床应用上素来就有“十方九草”的说法，可见甘草的应用之广泛。甘草是一味常用大宗药材，来源于乌拉尔甘草、光果甘草和胀果甘草的干燥根和根茎，具有抗溃疡、抗炎、解痉、抗氧化、抗病毒、抗癌、抗抑郁、保肝、祛痰和增强记忆力等多种药理活性。甘草的化学成分研究主要集中在小分子化合物，如三萜皂苷和黄酮类化合物。对于其中的蛋白等大分子成分研究较少。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本申请提供一种从甘草中提取获得的大分子化合物——甘草蛋白提取物及其在镇痛方面的新用途。

作为本申请的一个方面，本申请提供一种甘草蛋白提取物，所述甘草蛋白提取物是以甘草为原料获得的以蛋白质为主要成分的提取物，所述提取物中蛋白质含量为50％～70％。

优选的，所述提取物中蛋白质含量为52％～68％；进一步优选为55％～66％；更进一步优选为57％～64％；更进一步优选为59％～61％。

优选的，所述提取物中蛋白质分子量主要为63-75Kda。

作为一种具体的实施方式，所述提取物按如下方法制备：

步骤a，取甘草，加入pH为6.0-8.0的提取溶剂进行提取，得到甘草蛋白粗提液；

步骤b，取步骤a的甘草蛋白粗提液，按常规方法去除粗提液中的小分子化合物，得到甘草蛋白初提液；

步骤c，取步骤b的甘草蛋白初提液，经过离子交换色谱进行纯化，以Tris-HCI缓冲液(流动相A)-含0.5mol/L NaCl Tris-HCI缓冲液(流动相B)为流动相洗脱，分别收集流动相B为40％45％和95％-100％时的洗脱组分；

步骤d，将步骤c收集的洗脱组分混合，透析，过滤，即得甘草蛋白提取物。

优选的，步骤a所述提取溶剂包括水或pH为6.0-8.0的缓冲液，包括但不限于磷酸盐缓冲液。

步骤b所述常规方法包括加乙醇或硫酸铵使亲水性的蛋白质等大分子成分形成沉淀，或通过超滤去掉小分子化合物。

步骤c优选收集流动相B为43％和100％时的洗脱组分。

作为本申请的第二个方面，本申请提供所述甘草蛋白提取物在制备具有镇痛作用的药物中的应用。

优选的，所述镇痛包括外周性镇痛和中枢性镇痛。

作为本申请的第三个方面，本申请提供一种甘草蛋白提取物制剂，所述制剂包括甘草蛋白提取物和药学上可接受的辅料。

所述制剂包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液等。所述药学上可接受的辅料包括但不限于：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。

本申请的有益效果：传统中药成分研究多针对小分子化合物，而蛋白等大分子类成分一般作为杂质去除。本申请从中药甘草中提取纯化出一种蛋白提取物，研究证实该蛋白提取物具有明显的镇痛作用，为缓解人体疼痛提供了一个新的治疗手段，该提取物的研发可以产生较大的经济效益。

附图说明

图1中A步骤c的流出曲线图，其峰1和峰2分别为43％流动相B和100％流动相B时流出的组分，B为峰1和峰2的SDS-PAGE图；

图2为扭体药效实验结果；

图3为福尔马林药效实验结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1甘草蛋白提取物的制备

步骤a，甘草蛋白的粗提

将甘草饮片粉碎成粉末，加入磷酸缓冲液(0.02mol/L、pH7.2)，使甘草饮片粉末量与缓冲液比例为1：5，将其于4℃下浸提24h，用纱布过滤，弃去滤渣。将滤液在4℃下4700rpm离心15min，收集上清液，即甘草蛋白粗提液。

步骤b，乙醇分级沉降

向甘草蛋白粗提液中缓慢加乙醇至饱和度为40％，静置24h，4700rpm离心20min，弃去沉淀，继续向上清液中缓慢加入乙醇至饱和度为60％，静置24h，4700rpm离心20min，分离上清和沉淀，沉淀用Tris-HCl缓冲液(0.1mol/L、pH8.0)充分溶解，即甘草蛋白初提液。

步骤c，离子交换色谱

取甘草蛋白初提取液的100mL上样到层析柱上。流动相A：Tris-HCI缓冲液(0.02mol/L、pH8.0)；流动相B：含0.5mol/L NaCl Tris-HCI缓冲液(0.02mol/L、pH8.0)；流速1mL/min，分别采用43％和100％的流动相B对甘草蛋白进行分步洗脱，收集洗脱峰组分。

步骤d，透析

将收集的组分混合后装入预处理的透析袋(8000-10000)，置于Tris-HCl(0.02mol/L、pH8.0)缓冲液中12h，此期间至少更换五次缓冲液。透析液过0.45μm滤膜，冻干，备用，得到甘草蛋白提取物。

实施例2蛋白浓度测定

取实施例1步骤b制备的蛋白初提液，以离子交换色谱进行纯化。流动相A：Tris-HCI缓冲液(0.02mol/L、pH8.0)；流动相B:含0.5mol/L NaCl Tris-HCI缓冲液(0.02mol/L、pH8.0)；流速1mL/min，流动相B以0-100％线性洗脱10个柱体积，蛋白分布洗脱的色谱峰见图1A，分别收集流动相B为43％(峰1)和100％时(峰2)流出组分，进行蛋白测定和SDS-PAGE。

通过BCA试剂盒(碧云天生物科技，P0012)对洗脱的蛋白进行测定，结果显示峰1和峰2洗脱获得的蛋白提取液中蛋白浓度分别为30.32mg/mL和9.43mg/mL。SDS-PAGE结果见图1B，可以看出，峰1的条带中63-75Kda的蛋白含量较高，该条带的占比在90％以上，且峰1和峰2的蛋白条带呈一致性，因此将峰1和峰2的蛋白洗脱液混合，混合后蛋白浓度为17.57mg/mL，对混合后的蛋白溶液进行透析和冷冻干燥，蛋白冻干粉中蛋白含量分别为60.09％。

以上结果说明通过离子交换色谱对甘草蛋白初提液达到了富集和纯化的效果。

实施例3药效实验

1实验方法

1.1扭体实验：扭体法实验参照《实验药理方法学》中的醋酸扭体实验。取昆明种小鼠40只，随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组、甘草蛋白提取物组(按实施例1制备)60mg/kg(3mg/ml)、阳性药(对乙酰氨基酚注射液)5mg/kg(0.25mg/ml)、注射给药，给药一个小时后造模。各组小鼠末次给药后20min后，给每只小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液0.1ml/10g，记录注射醋酸后30min内小鼠扭体反应次数，计算扭体抑制率。每隔5分钟记录一次扭体次数。

1.2福尔马林实验：取昆明种小鼠40只，随机分为4组，每组10只，分别为正常组、模型组，甘草蛋白提取物组(按实施例1制备)36mg/kg、阳性药(对乙酰氨基酚注射液)5mg/kg(0.25mg/ml)、注射给药，给药一个小时后造模。各组在注射给药1个小时后于小鼠右足底皮下注射5％福尔马林25μL，然后放置于悬挂的1000mL烧杯内，观察第一时相(0～10min)和第二时相(15～60min)舔咬右后足次数。

2实验结果

2.1扭体实验结果

实验结果见图2和表1。

表1甘草蛋白提取物对醋酸扭体实验扭体次数的影响(

n＝8)

分组	扭体次数
		模型组	47.9±17.87
阳性药组	15.4±6.22<sup>*</sup>
		甘草蛋白提取物组	7.889±4.93<sup>**</sup>

结果显示，与模型组相比，阳性药组和甘草蛋白提取物组扭体次数均显著减少(阳性药组，p＜0.05；甘草蛋白提取物组，p＜0.01)。且相对于阳性药组，甘草蛋白提取物组扭体次数也明显减少(p＜0.05)。

2.2福尔马林实验结果

实验结果见图3和表2。

表2甘草蛋白对福尔马林实验一相和二相舔足持续时间的影响(

n＝8)

分组	一相舔足持续时间	二相舔足持续时间
			模型组	68.7±17.92	244.1±55.01
阳性药组	42.25±16.588<sup>**</sup>	181±45.891<sup>*</sup>
			甘草蛋白提取物组	26.44±16.53<sup>**</sup>	20.78±13.69<sup>**</sup>

结果显示，与模型组相比，阳性药组和甘草蛋白提取物组一相舔足持续时间均显著减少，具有极显著差异(p＜0.01)；与模型组相比，阳性药组二相舔足持续时间具有显著差异(p＜0.05)，甘草蛋白提取物组具有极显著差异(p＜0.01)。

福尔马林药效实验第一相时反映药物的外周性镇痛，第二相时反映药物的中枢性镇痛。通过结果可以看出阳性药(对乙酰氨基酚)是外周性镇痛药，其在第一相药效更好，而甘草蛋白提取物对于一相和二相都有很好的镇痛效果。

以上研究结果表明，从甘草中提取出的蛋白提取物具有明显的镇痛作用，且作用效果优于阳性对照药物对乙酰氨基酚。

Claims

1.一种甘草蛋白提取物，其特征在于，所述甘草蛋白提取物是以甘草为原料获得的以蛋白质为主要成分的提取物，所述提取物中蛋白质含量为50％～70％，所述提取物中蛋白质分子量主要为63-75Kda。

2.如权利要求1所述的甘草蛋白提取物，其特征在于，所述提取物中蛋白质含量为52％～68％；进一步优选为55％～66％；更进一步优选为57％～64％；更进一步优选为59％～61％。

3.如权利要求1所述的甘草蛋白提取物，其特征在于，所述提取物按如下方法制备：

4.如权利要求3所述的甘草蛋白提取物，其特征在于，步骤a所述提取溶剂包括水或pH为6.0-8.0的缓冲液，优选为磷酸盐缓冲液。

5.如权利要求3所述的甘草蛋白提取物，其特征在于，步骤b所述常规方法包括加乙醇或硫酸铵使蛋白质形成沉淀，或通过超滤去掉小分子化合物。

6.如权利要求3所述的甘草蛋白提取物，其特征在于，步骤c收集流动相B为43％和100％时的洗脱组分。

7.如权利要求1-6任一项所述甘草蛋白提取物在制备具有镇痛作用的药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述镇痛包括外周性镇痛和中枢性镇痛。

9.一种甘草蛋白提取物制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1-6任一项所述甘草蛋白提取物和药学上可接受的辅料。

10.如权利要求9所述的制剂，其特征在于，所述制剂包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液。