CN1290519C - 中药骨碎补有效部位提取物及其提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药骨碎补有效部位的提取方法、由该方法得到的提取物、该提取物的用途、包含该提取物的药物和该药物的制备方法；该药物可用于治疗肾衰。药理实验结果表明，与市售同类品种进行比较，本发明的中药注射制剂对肾衰疾病具有更强药理作用。
Description
所属技术领域
本发明涉及中药骨碎补有效部位的提取方法、由该方法得到的提取物、该提取物的用途、包含该提取物的药物和该药物的制备方法；该药物可用于治疗肾衰。
背景技术
严重的肾功能不足称为肾衰，肾衰是由毒物、药物、感染、外伤、年龄以及其他器官的疾病等多种原因导致的严重肾病，肾衰不但可以是肾脏泌尿功能的障碍，并能导致耳聋、骨质疏松、脱发等多种疾患，是临床常见的危重症，严重地危害人类的健康和生命，肾衰是集亢进性、衰退性、失调性变化于一身的错综复杂的难治性疾病。目前治疗肾衰的方法主要有肾透析、肾移植、药物治疗等，肾透析是采用体外模拟肾脏器官的仪器替代体内衰竭肾脏来清除体内毒素的功能，改善肾中毒症状，达到延长病人寿命的目的，其治疗本质不能恢复肾脏的自身功能，肾脏内分泌功能和其他功能得不到改善，另外，肾透析不能从本质上治疗和预防肾衰所导致的继发疾病，病人如若进行了肾透析，则需终生使用，费用昂贵，给患者及家属带来巨大的负担；肾移植能够从根本上治疗肾衰，但目前因为可移植的受体有限、强烈的排斥反应、费用昂贵的局限，可以得到治疗的病人非常少；西药治疗只能缓解肾衰症状，不能从本质上治疗这一疾病；中药治疗肾衰的复方很多，也具有一定的疗效，但中药复方体积大、服用不方便、作用原理不明确性；因此，临床急需一种药理作用非常好的治疗肾衰疾病的中药制剂。
发明专利申请号为02114169“一种促进肾功能康复的药物”的专利公开了利用骨碎补治疗肾衰的疾病，其提取纯化过程中利用大量有机溶剂、硅胶柱层析、聚酰胺柱层析的方法，这些方法只适用实验室少量中药的提取纯化，得到很少一部分原料，在实际生产中，可行性几乎没有；这项专利公开了治疗肾衰的药物含量总黄酮、总甾体为5mg-500mg，范围太大，有100倍的差距，在做临床前急性毒理研究时，是不可能有这么大范围的剂量通过实验，安全系数太低或者该药的有效性值得商榷；这项专利工艺描述太简单，实际操作过程无法重复。
发明内容
基于上述原因，本发明采用CO2超临界萃取法、超声波提取法、大孔吸附树脂法对骨碎补进行提取纯化，得到的有效部位与药用辅料混合，制备成水针、输液、粉针、冻干粉针剂，药理实验结果表明，本发明的中药注射制剂对肾衰疾病有着非常药理药效，与市售同类品种进行比较，本发明的中药注射制剂具有更强药理作用。
本发明通过以下技术方案实现的。
一.工艺制法
取骨碎补饮片，粉碎，放入CO2超临界提取设备萃取釜中，调整萃取釜压力为15-35Mpa，萃取温度为40℃-60℃，流量为40-100L/h，解析釜1的压力为5-7Mpa，解析温度为30℃-40℃，解析釜2的压力为3-5Mpa，解析温度为20℃-30℃，萃取4-6小时，合并解析釜1、2的物料，备用，萃取釜物料取出，放入超声提取罐中，用40％-60％的乙醇超声提取0.5小时-1小时，超声功率为100-5400W，搅拌速度为50-1500RPM，控制温度为室温-55℃，提取2-4次，合并提取液，回收乙醇至尽，干燥，粉碎，与大孔吸附树脂混合，上大孔吸附树脂柱，用8-12倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用8-12倍浓度为50％-80％的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，将其与解析釜中的物料混合，加入药用辅料增溶剂，用注射用水溶解，过滤至澄清，灌封，灭菌，制备成水针制剂；或者将其与解析釜中的物料混合，加入药用辅料增溶剂，用注射用水溶解，过滤至澄明，灌封，灭菌，制备成输液制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，加入药用辅料赋形剂，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，分装到西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，加入药用辅料赋形剂，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，浓缩注入托盘中，放入干燥箱中干燥，分装到西林瓶，制备成粉针制剂。
二.药理实施例
实施例1
对肾衰大鼠的药理作用
实验药物：本发明骨碎补注射制剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
生理盐水材料(北京乾露春科技有限公司实验室提供)
实验动物：SD大鼠体重230～270g，雌雄各半，由北京大学医学部动物实验室提供
实验方法：取大鼠饲养1周后开始手术，戊巴比妥钠麻醉，常规皮肤消毒，腹部正中切口暴露右肾，结扎肾带，剥离皮膜，切除右肾；然后暴露左肾，迅速切除上下极，所切除部分占肾皮质的1/6，切除后立即以明胶海绵压迫止血，关闭腹腔，青霉素40万/支，肌肉注射3天以防感染。手术后饲养12周，眼眶采血，测BUN、Cr，依次将手术大鼠均分为五组，按1ml/kg给大鼠尾静脉给药或生理盐水连续4周，第29日眼眶采血，测BUN、Cr、P、K、Ca值及Na、Cl，结果见表1：
表1本发明各注射制剂对肾衰大鼠的药理作用
| 组别 | 给药前 | 给药后 |
| BUN Cr | BUN Cr P K Ca | |
| 生理盐水 | 9.07±1.70 52.7±7.1 | 9.19±1.28 60.4±8.9 1.88±0.32 6.35±0.35 2.26±0.08 |
| 本发明水针剂 | 9.08±1.28 53.1±9.9 | 6.78±1.16** 46.5±8.5** 1.56±0.18* 5.62±0.35* 2.35±0.09* |
| 本发明输 | 9.13±1.66 55.8±6.9 | 6.83±1.54** 45.9±7.9** 1.55±0.16* 5.61±0.33* 2.34±0.08* |
| 液剂 | ||
| 本发明粉针剂 | 9.19±1.63 55.3±10.7 | 6.65±1.39** 45.7±8.3** 1.55±0.17* 5.64±0.35* 2.34±0.09* |
| 本发明冻干粉针剂 | 9.17±1.44 55.3±9.1 | 6.69±1.08** 46.1±8.0** 1.56±0.17* 5.62±0.32* 2.36±0.07* |
*P＜0.05，**P＜0.01
实施例2
治疗庆大霉素中毒引起的肾衰的实验
实验药物：本发明骨碎补注射制剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)庆大霉素(北京白塔寺医药公司购买，北京第二制药厂生产)NRKSIE人肾小管细胞株，由首都医科大学内科实验室提供。
方法：肾小管细胞庆大霉素损伤模型制作及分组。分为5组，对照组为庆大霉素组，其余4组庆大霉素+本发明注射制剂，检测指标为细胞培养72h后，收集培养上清液和细胞，检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和上清液乳酸脱氢酶(LDH)，同时测定细胞蛋白含量作校正，测定结果见表2：
表2五组制剂对肾小管细胞SOD、MDA、LDH含量比较
| 组别 | N | MDA(nmol/mgpro) | SOD(NU/mgpro) | LDH(U/L) |
| 庆大霉素 | 12 | 18.9201±0.9300 | 1.5832±0.2973 | 2202±331 |
| 本发明水针+庆大霉素 | 12 | 8.3550±0.7341** | 3.4061±0.2598** | 1507±118** |
| 本发明输液剂+庆大霉素 | 12 | 8.2673±0.6903** | 3.3987±0.2774** | 1498±104** |
| 本发明粉针剂+庆大霉素 | 12 | 8.0753±0.7014** | 3.4128±0.2658** | 1479±123** |
| 本发明冻干粉针剂+庆大霉素 | 12 | 8.1539±0.7156** | 3.4017±0.2619** | 1507±106** |
**P＜0.01
实施例3
对肾衰大鼠存活率影响
实验药物：本发明骨碎补注射制剂(北京乾露春科技有限公司实验室提供)生理盐水材料(北京乾露春科技有限公司实验室提供)肾衰胶囊(北京中医药大学中药制剂实验室提供)
实验动物：SD大鼠体重230-270g，雌雄各半，由北京大学医学部动物实验室提供
实验方法：取大鼠饲养1周后开始手术，戊巴比妥钠麻醉，常规皮肤消毒，腹部正中切口暴露右肾，结扎肾带，剥离皮膜，切除右肾；然后暴露左肾，迅速切除上下极，所切除部分占肾皮质的1/6，切除后立即以明胶海绵压迫止血，关闭腹腔，青霉素40万/支，肌肉注射3天以防感染。手术15周开始尾静脉给药，计算死亡率，见表3：
表3肾衰大鼠死亡率
| 组别 | 16周 | 20周 | 24周 | 28周 |
| 生理盐水 | 7％ | 95.4％ | 100％ | 100％ |
| 肾衰胶囊 | 46.3％* | 54.6％* | 68.9％* | 80.1％* |
| 本发明水针剂 | 18.9％** | 25.3％** | 29.6％** | 38.9％** |
| 本发明输液剂 | 17.6％** | 25.3％** | 29.5％** | 37.5％** |
| 本发明粉针剂 | 19.1％** | 26.4％** | 28.4％** | 40.1％** |
| 本发明冻干粉针剂 | 17.9％** | 25.1％** | 29.1％** | 39.5％** |
结论：通过以上药理实验可以得知，本发明的各组注射制剂对肾衰疾病有着非常好的药理作用，与同类产品比较，本发明各组注射制剂有更强的药理作用。
三.制备实施例
实施例1
取骨碎补饮片1000克，粉碎，放入CO2超临界提取设备萃取釜中，调整萃取釜压力为15Mpa，萃取温度为40℃，流量为40L/h，解析釜1的压力为5MPa，解析温度为30℃，解析釜2的压力为3MPa，解析温度为20℃，萃取4小时，合并解析釜1、2的物料，备用，萃取釜物料取出，放入超声提取罐中，用40％的乙醇超声提取0.5小时，超声功率为100W，搅拌速度为50RPM，控制温度为室温，提取2次，合并提取液，回收乙醇至尽，干燥，粉碎，与AB-8型大孔吸附树脂混合，上AB-8型大孔吸附树脂柱，用8倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用8倍浓度为50％的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，将其与解析釜中的物料混合，得到原料31.12克，加入药用辅料增溶剂丙二醇31.12克，用注射用水溶解，过滤至澄清，灌封，灭菌，制备成水针制剂；或者将其与解析釜中的物料混合，得到原料31.12克，加入药用辅料增溶剂丙二醇31.12克，用注射用水溶解，过滤至澄明，灌封、灭菌，制备成输液制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，得到原料31.12克，加入药用辅料赋形剂甘露醇124.48克，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，分装到西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，得到原料31.12克，加入药用辅料赋形剂甘露醇124.48克，，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，浓缩注入托盘中，放入干燥箱中干燥，分装到西林瓶，制备成粉针制剂。
实施例2
取骨碎补饮片1000克，粉碎，放入CO2超临界提取设备萃取釜中，调整萃取釜压力为35Mpa，萃取温度为60℃，流量为100L/h，解析釜1的压力为7Mpa，解析温度为40℃，解析釜2的压力为5Mpa，解析温度为30℃，萃取6小时，合并解析釜1、2的物料，备用，萃取釜物料取出，放入超声提取罐中，用60％的乙醇超声提取1小时，超声功率为5400W，搅拌速度为1500RPM，控制温度为55℃，提取4次，合并提取液，回收乙醇至尽，干燥，粉碎，与NKA-9型大孔吸附树脂混合，上NKA-9型大孔吸附树脂柱，用12倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用12倍浓度为80％的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，将其与解析釜中的物料混合，得到原料32.58克，加入药用辅料增溶剂2％吐温-80为48.87克，用注射用水溶解，过滤至澄清，灌封，灭菌，制备成水针制剂；或者将其与解析釜中的物料混合，得到原料32.58克，加入药用辅料增溶剂2％吐温-80为48.87克，用注射用水溶解，过滤至澄明，灌封，灭菌，制备成输液制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，加入药用辅料赋形剂蔗糖293.22克，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，分装到西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，加入药用辅料赋形剂蔗糖293.22克，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，浓缩注入托盘中，放入干燥箱中干燥，分装到西林瓶，制备成粉针制剂。
实施例3
取骨碎补饮片800克，粉碎，放入CO2超临界提取设备萃取釜中，调整萃取釜压力为18Mpa，萃取温度为45℃，流量为50L/h，解析釜1的压力为5.5Mpa，解析温度为35℃，解析釜2的压力为4Mpa，解析温度为25℃，萃取4.5小时，合并解析釜1、2的物料，备用，萃取釜物料取出，放入超声提取罐中，用45％的乙醇超声提取0.6小时，超声功率为500W，搅拌速度为300RPM，控制温度为30℃，提取3次，合并提取液，回收乙醇至尽，干燥，粉碎，与D-101型大孔吸附树脂混合，上D-101型大孔吸附树脂柱，用9倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用9倍浓度为55％的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，将其与解析釜中的物料混合，得到原料28.2克，加入药用辅料增溶剂丙三醇56.4克，用注射用水溶解，过滤至澄清，灌封，灭菌，制备成水针制剂；或者将其与解析釜中的物料混合，得到原料28.2克，加入药用辅料增溶剂丙三醇56.4克，用注射用水溶解，过滤至澄明，灭菌，灌封，制备成输液制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，得到原料28.2克，加入药用辅料赋形剂乳糖159.9克，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，分装到西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，得到原料28.2克，加入药用辅料赋形剂乳糖159.9克，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，浓缩注入托盘中，放入干燥箱中干燥，分装到西林瓶，制备成粉针制剂。
实施例4
取骨碎补饮片500克，粉碎，放入CO2超临界提取设备萃取釜中，调整萃取釜压力为25Mpa，萃取温度为55℃，流量为60L/h，解析釜1的压力为6Mpa，解析温度为35℃，解析釜2的压力为4Mpa，解析温度为25℃，萃取5小时，合并解析釜1、2的物料，备用，萃取釜物料取出，放入超声提取罐中，用50％的乙醇超声提取0.8小时，超声功率为2000W，搅拌速度为1000RPM，控制温度为40℃，提取4次，合并提取液，回收乙醇至尽，干燥，粉碎，与NKA-9型大孔吸附树脂混合，上NKA-9型大孔吸附树脂柱，用10倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用10倍浓度为70％的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，将其与解析釜中的物料混合，得到原料15.9克，加入药用辅料增溶剂丙二醇、丙三醇25.4克，用注射用水溶解，过滤至澄清，灌封，灭菌，制备成水针制剂；或者将其与解析釜中的物料混合，得到原料15.9克，加入药用辅料增溶剂丙二醇、丙三醇25.4克，用注射用水溶解，过滤至澄明，灭菌，灌封，制备成输液制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，得到原料15.9克，加入药用辅料赋形剂甘露醇、蔗糖72.3克，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，分装到西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，得到原料15.9克，加入药用辅料赋形剂甘露醇、蔗糖72.3克，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，浓缩注入托盘中，放入干燥箱中干燥，分装到西林瓶，制备成粉针制剂。
实施例5
取骨碎补饮片2000克，粉碎，放入CO2超临界提取设备萃取釜中，调整萃取釜压力为30Mpa，萃取温度为55℃，流量为90L/h，解析釜1的压力为6Mpa，解析温度为35℃，解析釜2的压力为4Mpa，解析温度为25℃，萃取5小时，合并解析釜1、2的物料，备用，萃取釜物料取出，放入超声提取罐中，用55％的乙醇超声提取0.9小时，超声功率为4500W，搅拌速度为1300RPM，控制温度为50℃，提取4次，合并提取液，回收乙醇至尽，干燥，粉碎，与AB-9型大孔吸附树脂混合，上AB-9型大孔吸附树脂柱，用10倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用9倍浓度为75％的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，将其与解析釜中的物料混合，得到原料67.8克，加入药用辅料增溶剂2％吐温-80、丙三醇为94.9克，用注射用水溶解，过滤至澄清，灌封，灭菌，制备成水针制剂；或者将其与解析釜中的物料混合，得到原料67.8克，加入药用辅料2％吐温-80、丙三醇为94.9克，用注射用水溶解，过滤至澄明，灌封，灭菌，制备成输液制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，得到原料67.8克，加入药用辅料赋形剂乳糖、甘露醇355.7克，，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，分装到西林瓶中，冷冻干燥，制备成冻干粉针制剂；或者，将其与解析釜中的物料混合，得到原料67.8克，加入药用辅料赋形剂乳糖、甘露醇355.7克，用注射用水溶解，用0.45um微孔滤膜过滤，浓缩注入托盘中，放入干燥箱中干燥，分装到西林瓶，制备成粉针制剂。
Claims (3)
1.一种骨碎补有效部位的提取方法，该方法采用CO2超临界萃取法、超声波提取法、大孔吸附树脂法对骨碎补进行提取纯化，得到所述有效部位，其特征在于：
(1)取骨碎补饮片，粉碎，放入CO2超临界提取设备萃取釜中，调整萃取釜压力为15-35MPa，萃取温度为40℃-60℃，流量为40-100L/h，解析釜1的压力为5-7MPa，解析温度为30℃-40℃，解析釜2的压力为3-5Mpa，解析温度为20℃-30℃，萃取4-6小时，合并解析釜1、2的物料，备用，萃取釜物料取出，备用；
(2)将萃取釜物料放入超声波提取罐中，用40％-60％的乙醇超声提取0.5小时-1小时，超声功率为100-5400w，搅拌速度为50-1500RPM，控制温度为室温-55℃，提取2-4次，合并提取液，回收乙醇至尽，备用；
(3)取备用提取液干燥粉碎，与大孔吸附树脂混合，上大孔吸附树脂柱，用8-12倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用8-12倍浓度为50％-80％的乙醇洗脱，洗脱液回收乙醇至尽，备用；
(4)将(1)中解析釜中的物料与(3)中物料混合，得到所述有效部位。
2.根据权利要求1的方法，所述大孔吸附树脂为弱极性或极性的一种。
3.根据权利要求1至2任意一项的方法所得到的骨碎补有效部位提取物。
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