CN100335073C - 木鳖子含三萜皂甙成分提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木鳖子含三萜皂甙成分提取物的制备方法。将中药木鳖子粉碎后，用乙醇回流提取、乙醚萃取除去脂溶性成分、正丁醇萃取除去不溶于正丁醇的成分、吸附性大孔树脂纯化，获得一种淡黄色具有清香味的木鳖子提取物粉末。理化分析和溶血试验表明该提取物含三萜皂甙成分。本发明所得木鳖子含三萜皂甙提取物毒性低，肌肉注射小鼠、猪、牛后无局部刺激性，口服和注射应用较为安全，在疫苗制造领域具有广泛应用前景。

Description

木鳖子含三萜皂甙成分提取物的制备方法

技术领域

本发明属于中药有效成分提取技术，涉及一种中药木鳖子含三萜皂甙成分提取物的制备方法。

背景技术

木鳖子(Semen momordicae)为葫芦科植物木鳖Momordica Cochinchinesis(Lour.)Spreng.的干燥成熟种子。木鳖为多年生藤本，主要分布在东南亚国家、蒙古、以及我国南方的大部分地区，如广西、四川、湖北、湖南、贵州、云南、广东、安徽等省。一般冬季采收成熟果实，剖开，晒至半干，除去果肉，取出种子，晒干备用。木鳖子为常用中药，味苦、微甘，性凉，具有散结消肿，攻毒疗疮的功能。北宋《开宝本草》(公元973年)记载木鳖子治“妇人乳痈，肛门肿痛”。现在该药已收载于《中国药典》和《中国兽药典》。人医和兽医临床上常用于治疗乳痈、腹泻、肿毒、瘰疬等感染性疾病。

木鳖子作为一个抗感染中药已经在临床上应用了1000多年。木鳖子可以单味应用，也可以和其他药物配伍组成方剂使用。

化学分析表明木鳖子含脂肪酸、皂甙、蛋白质以及α-菠菜甾醇、齐墩果酸、木鳖子酸等成分。最近的研究发现木鳖子的一种水提取物具有抗肿瘤(Tien et al.，2005；Tsoi et al.，2004；Wonget al.，2004)以及抗氧化活性(Tsoi et al.，2005)。Iwamnoto等(1985)从木鳖子中分离出两种皂甙，momordica saponin I和II，并确认I为丝石竹皂甙，II为一种含皂皮酸的皂甙。丝石竹皂甙为含双糖链的三萜皂甙。一些具有类似化学结构的皂甙已被证明具有免疫佐剂作用，和疫苗同时应用可以提高疫苗的免疫效果。

然而，木鳖子在许多医学文献中被认为是一个有毒的中药。张景岳在《本草正》中记载：“木鳖子，有大毒，本草言其甘温无毒，缪也。今见毒狗者，能毙于倾刻。”木鳖子水浸液，乙醇水浸液和乙醇浸出液静脉或肌肉注射狗猫兔等动物，被注射动物血压降低，于数日之内死亡；木鳖子皂甙的小鼠LD₅₀研究表明，静脉注射为32.35mg/kg，腹腔注射为37.34mg/kg。

为了开拓我国传统中药的应用价值，目前有将木鳖子含三萜皂甙提取物在免疫佐剂方面的应用研究，然而，佐剂使用的途径为包含在与疫苗中口服或注射，这使得传统以外用为主的有毒的木鳖子不能直接应用于佐剂，本发明的目的在于制备木鳖子中含三萜皂甙有效成分的提取物，去除其毒性成分，使木鳖子的应用安全、可靠。

发明内容

本发明提供一种中药木鳖子含三萜皂甙成分提取物的制备方法。所得到的木鳖子提取物为一种去除毒性的含三萜皂甙成分的黄色粉末。

本发明木鳖子含三萜皂甙成分提取物的制备方法包括以下步骤：

(1)将原料木鳖子粉碎后在40～50％乙醇中浸泡，回流提取2～5次，提取液过滤后减压浓缩；

(2)在浓缩液中加入澄清剂去除杂质，静置后取上清液，用乙醚萃取去除脂溶性成分，保留水层的水溶液；

(3)水溶液用水饱和正丁醇萃取，减压浓缩正丁醇萃取液至干，得黄色粉末状木鳖子粗提物；

(4)用50～80℃热水溶解粗提物，调节pH至6～7，充分溶解后，将水溶解的木鳖子粗提物加入吸附性大孔树脂柱，静置15～30小时后，水洗去除非有效成分的杂质；

(5)用40～50％乙醇洗脱，减压浓缩洗脱液，将浓缩的洗脱液真空干燥，得黄色粉末状木鳖子精提物。

按以上方法获得的木鳖子粗提物或木鳖子精提物产品均为本发明的产品，该产品中含三萜皂甙类化学成分。

具体实施方式

实施例一

木鳖子30公斤(购自安徽省毫州中药材市场)，分3次提取，每次10公斤。首先将木鳖子粉碎，在40～50％乙醇中浸泡24小时；然后，乙醇回流提取3次，每次2小时；提取液过滤，减压浓缩滤液(R502B旋转蒸发器购自上海申生科技有限公司)；浓缩液加入101澄清剂(上海沃逊生物工程有限公司)，使最终浓度为5‰(101澄清剂与浓缩液重量体积比)，充分混匀，水浴加热至60℃后，静置24小时；取上清液，用乙醚萃取3次，以除去脂溶性成分；水层加入水饱和正丁醇萃取4次，以除去不溶于正丁醇的成分，减压浓缩正丁醇萃液至干，得黄色残留物；热水洗出残留物，用1N氢氧化钠调节pH至6～7，使残留物充分溶解；将溶液加至吸附性大孔树脂(D101A，天津市海光化工有限公司产品)柱，静置24小时，吸附有效成分；用蒸馏水洗柱除去杂质，再用40～50％酒精洗脱；减压浓缩洗脱液；浓缩液真空干燥，得淡黄色木鳖子提取物粉末，略带清香味，对鼻粘膜有刺激性。三次提取分别获得木鳖子20.58g、22.10g和19.63g，从30kg木鳖子中共获提取物62.31g，平均得率为2.077g/kg。

实施例二

将木鳖子的种仁和硬质种皮分离，得种仁0.597kg和硬质种皮0.401kg。按上述方法分别提取种仁和硬质种皮。从0.401kg硬质外种皮中获得0.45g，得率为1.12g/kg；从0.597kg种仁中获得2.02g，得率为3.38g/kg。

木鳖子提取物性质的分析：为证实本发明方法所得木鳖子提取物的性质，以及是否含有三萜皂甙，特进行以下试验。

1.醋酐-浓硫酸反应(Liebermann-Burchard reaction)：取5mg木鳖子提取物溶于1ml醋酐中，加浓硫酸-醋酐(1∶20)5ml，开始出现为黄褐色，然后变为深褐色。

2.氯仿-浓硫酸反应(Salkowski reaction)：取5mg木鳖子提取物溶于1ml氯仿，后加入1ml浓硫酸，底部的浓硫酸层开始为黄褐色，然后变为深褐色。

3.表面活性：取木鳖子提取物的水溶液2ml于具塞试管中，用力振摇，可产生持久性泡沫，且不因加热而消失。

4.紫外光谱分析：配制0.1mg/ml木鳖子提取物水溶液，用紫外分光光度计(Ultrospec3300pro，Biochrom Ltd公司)扫描，观察木鳖子提取物水溶液的紫外吸收。在紫外分光光度计下从190nm-1100nm范围内进行扫描，在200nm处有最大吸收峰。

以上结果提示木鳖子提取物含三萜皂甙。

5、木鳖子提取物的溶血作用

取柠檬酸钠抗凝的鸡血，1500rpm10分钟离心，弃去上清，用生理盐水洗三次，配成2％的鸡红细胞悬液。配制5mg/ml的木鳖子提取物水溶液，在V型96孔血凝板的1～12孔中加入50ul生理盐水，于第1孔加入50ul木鳖子提取物溶液，对倍稀释，然后在各孔加入50ul鸡红细胞悬液，于37℃培养1小时，观察溶血情况。根据公式V/PS计算溶血指数(hemolytic index，HI)，式中V：每孔液体的总体积(ml)；P：使红细胞溶血的最低木鳖子提取物的百分比浓度；S：加入孔中木鳖子提取物溶液的体积(ml)。96孔板上出现溶血现象的最低浓度木鳖子提取物溶液位于第7孔，该孔木鳖子提取物浓度为0.0039％，根据溶血指数计算公式，HI＝V/PS＝100μl/(0.0039％×50μl)＝51200。

溶血作用提示木鳖子提取物含三萜皂甙成分。

6、木鳖子提取物的急性毒性试验

(1)木鳖子提取物静脉注射LD₅₀的测定

取体重为19～21g的ICR小鼠80只，雌雄各半，随机分成4组，每组20只，雌雄各半。尾静脉注射木鳖子提取物水溶液，各组注射剂量分别为115.50mg/kg、109.73mg/kg、104.24mg/kg和99.03mg/kg。注射前用75％酒精棉尾部消毒，缓慢注射，注射后，立即观察小鼠的反应，进行记录。静脉注射木鳖子提取物的LD₅₀为108.05mg/kg，95％可信限范围为105.78～110.36mg/kg；

(2)木鳖子提取物肌肉注射LD₅₀的测定

取体重为19～21g的ICR小鼠100只，雌雄各半，随机分成5组，每组20只，雌雄各半。腿部肌肉注射木鳖子提取物水溶液，各组注射剂量分别为240.00mg/kg、192.00mg/kg、153.60mg/kg、122.90mg/kg和98.30mg/kg，注射前用75％酒精棉腿部消毒，缓慢注射，注射后，立即观察小鼠的反应，进行记录。肌肉注射木鳖子提取物的LD₅₀为178.09mg/kg，95％可信限范围为160.10～198.09mg/kg。

静脉注射木鳖子提取物的LD₅₀为108.05mg/kg，肌肉注射木鳖子提取物为的LD₅₀为178.09mg/kg，静脉和腹腔注射均十分安全。

以上结果表明，按本发明的制备方法所得到的木鳖子提取物主要含三萜皂甙成分，已去除了毒性，静脉注射和肌肉注射对小鼠均十分安全。肌肉注射小鼠、奶牛和猪未见局部刺激反应。因此，本发明采用的制备方法去处了木鳖子中的毒性成分，使木鳖子含三萜皂甙成分提取物的应用更加安全。

Claims (1)

1、木鳖子含三萜皂苷成分提取物的制备方法，包括：乙醇浸提，减压浓缩，乙醚脱脂后水饱和正丁醇萃取，其特征在于：乙醇浸提液减压浓缩后，在浓缩液中加入101澄清剂，充分混匀，水浴加热至60℃后静置24小时，去除杂质，取上清夜，再用乙醚萃取去除脂溶性成分，保留水层的水溶液，再用水饱和正丁醇萃取。