CN114736182B - 一种抗心肌缺血再灌注损伤的化合物和傣药组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗心肌缺血再灌注损伤的化合物，以及一种抗心肌缺血再灌注损伤的组合物。本发明根据四塔理论将分离得到没药烷型倍半萜类成分与傣药苏木提取物、定心藤提取物，按特定重量比组合，在抗心肌缺血再灌注损伤方面效果显著。本发明将姜黄中非姜黄素类成分用于抗心肌缺血再灌注损伤，拓展姜黄中化学成分的价值，也能够增加姜黄、苏木、定心藤等传统傣药的综合价值。

Description

一种抗心肌缺血再灌注损伤的化合物和傣药组合物及其应用
技术领域
本发明具体涉及一种抗心肌缺血再灌注损伤的化合物和傣药组合物及其应用。
背景技术
缺血性心脏病是目前全球发病率和死亡率最高的疾病，临床治疗方案是及时手术恢复冠状动脉的血流灌注，但恢复血供后常出现心肌缺血再灌注损伤(MyocardialIschemia-reperfusion Injury，MIRI)，即心肌细胞因缺血造成的结构和功能损伤不仅没有因恢复血供而得到改善，反而加重甚至出现不可逆心力衰竭的情况。MIRI已成为缺血性心脏病术后死亡率高发的重要原因，尚无理想的防治手段。从疗效确切的民族药中寻找副作用小、安全可靠的活性成分是MIRI研究的重要方向。
巩红岩等，葛根素对大鼠体外循环后心肌缺血再灌注损伤的保护作用及抗氧化应激机制的探讨[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(1)：165—167，将葛根的提取物葛根素作用于体外循环后心肌缺血再灌注损伤大鼠，实验结果表明葛根素高剂量组能显著降低MIRI大鼠的心肌细胞凋亡指数和心肌梗死面积，降低血清中MDA的含量，并且增加血清中SOD、GSH—Px的活性和GSH的含量；刘川鄂等，人参皂苷Rbl减轻糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤期间心肌细胞凋亡的机制[J].中国中医急症，2012，21(7)：1080—1081应用参麦注射液有效成分人参皂苷Rbl作用于糖尿病MIRI大鼠，实验结果显示人参皂苷Rbl可明显降低大鼠心肌梗死区百分比和心肌细胞凋亡百分比，明显增加P—Akt表达。邵莹等.淡竹叶黄酮对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2013，29(2)：241—247.，将淡竹叶的提取物淡竹叶黄酮作用于MIRI大鼠，实验结果显示淡竹叶黄酮高剂量组可以明显的降低大鼠血清和心肌组织中LDH及CK的活性，降低MDA含量，提高SOD、GSH—Px和NO的浓度；并且可以抑制心肌组织中NF—xB及TNF一仅蛋白的表达，下调Caspase一3蛋白表达。
研究报道显示姜黄抗MIRI的主要活性成分是姜黄素类，其作用机制主要为降低氧化应激损伤；改善心室功能；抑制心肌细胞凋亡和自噬，抑制血管内皮细胞炎症反应等。目前尚未见姜黄中非姜黄素类成分抗心肌缺血再灌注损伤的报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种抗心肌缺血再灌注损伤的化合物，所述化合物如式(I)所示：
进一步地，所述R1R2为H或甲基，所述R3R4为H、甲基或连接成环。
更进一步地，所述化合物如式(II)或式(III)所示：
本发明还提供了一种抗心肌缺血再灌注损伤的组合物，它是包括下述质量份的原料药制备而成：
式(II)所示化合物1～10份，式(III)所示化合物1份；
进一步地，它是包括下述质量份的原料药制备而成：
式(II)所示化合物1份，式(III)所示化合物1份。
更进一步地，它是由下述质量份的原料药制备而成：
式(II)所示化合物1份，式(III)所示化合物1份，苏木提取物98份，定心藤提取物100份；
所述苏木提取物是豆科云实属苏木Caesalpinia sappan的心材的醇提物；
所述定心藤提取物是定心藤Mappianthus iodoides的藤茎的醇提物。
更进一步地，它是以式(II)所示化合物、式(III)所示化合物、苏木提取物、定心藤提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂；所述制剂为口服制剂；所述口服制剂为颗粒剂、膏剂、散剂、丸剂或溶液剂。
本发还提供了一种前述的抗心肌缺血再灌注损伤的化合物的制备方法，它包括如下步骤：
1)取姜黄的根，加水提取，提取液浓缩成浸膏，上样于大孔树脂柱，用45％甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，再上样于大孔树脂柱，用80％甲醇或20％甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩；
2)取步骤1)所得浓缩液，用制备高效液相色谱分离，收集响应值最大的色谱峰对应的流出液，再用凝胶柱纯化流出液，即得；
所述制备高效液相色谱的条件为：
色谱柱：Extend-C column 5μm，4.6×150mm；流动相：甲醇和水；流速1.0ml/min，柱温20℃，波长254nm和230nm，梯度洗脱程序：0-8min，50％或20％甲醇水溶液，8-13min，50％或20％甲醇水溶液→100％甲醇。
进一步地，所述浓缩为50℃减压浓缩；所述凝胶柱为Sephadex LH-20凝胶柱。
本发明还提供了一种前述组合物的制备方法，它包括以下步骤：
按前述配比称取原料药，加入药品上常用的辅料或辅助性成分，即得。
本发明最后提供了一种前述的化合物、前述组合物在制备抗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途。
本发明从姜黄中分离得到没药烷型倍半萜类成分Bisadinrone A和Bisacurone，经试验证明具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用。
傣医“四塔理论”认为体内四塔功能失调时，风、火塔(气、血)不足，火不制水，蕴积心胸，气血瘀阻不畅则胸闷胀痛，心胸失于温养，水血转运无力则致心动异常心慌心悸，土塔减弱使水血生化无源则致胸闷气短。因此，傣医治疗缺血性心脏病和MIRI相关症状注重补益风、火、土塔，温通行气，补火补血安心。傣药苏木(豆科云实属苏木Caesalpiniasappan的心材)味微甜，性平，入水、风塔，通血散瘀，消肿止痛；定心藤(茶茱萸科定心藤属定心藤Mappianthus iodoides的藤茎)味甜，性凉，入土、火、风塔。
本发明根据四塔理论将分离得到没药烷型倍半萜类成分Bisadinrone A、Bisacurone与傣药苏木提取物、定心藤提取物，按特定重量比组合，在抗心肌缺血再灌注损伤方面效果显著。
本发明将姜黄中非姜黄素类成分用于抗心肌缺血再灌注损伤，拓展姜黄中化学成分的价值，也能够增加姜黄、苏木、定心藤等传统傣药的综合价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1姜黄中没药烷型倍半萜Bisacurone和Bisadinrone A的制备流程
图2Bisacurone的纯度检测
图3Bisacurone的氢谱和DEPT谱
图4Bisacurone的化学结构
图5Bisadinrone A的纯度检测
图6Bisadinrone A的氢谱和DEPT谱
图7Bisadinrone A的平面结构式
图8H9C2细胞H/R模型
图9化合物预处理对H/R处理H9C2心肌细胞活力的影响
图10化合物预处理对H/R处理H9C2心肌细胞释放LDH的影响
图11傣药组合物对MIRI大鼠心肌梗死面积的影响
图12傣药组合物预处理对MIRI大鼠心肌组织结构的影响
图13傣药组合物预处理对MIRI大鼠血浆LDH和CK的影响
具体实施方式
实施例1、本发明药烷型倍半萜类成分Bisadinrone A的制备
1)取姜黄的根，粉碎，加5-8倍重量热水(100℃)回流提取，提取液50℃减压浓缩成浸膏，上样于大孔树脂柱(LX-T28大孔树脂)，用6-8柱体积45％甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃减压浓缩至相对密度1.10-1.15，再上样于大孔树脂柱，用3-5柱体积80％甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃减压浓缩至相对密度1.10-1.15；
2)取步骤1)所得浓缩液，用制备高效液相色谱分离，收集响应值最大的色谱峰对应的流出液，再上样于Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，干燥，即得Bisadinrone A，其化合物结构式如下：
所述制备高效液相色谱的条件为：
色谱柱：Extend-C18 column，5μm，4.6×150mm；流动相：甲醇和水；梯度洗脱程序：50％甲醇水溶液(0-8min)，50％甲醇水溶液→100％甲醇(8-13min)；流速1.0ml/min，柱温20℃，波长230nm和254nm。
实施例2、本发明药烷型倍半萜类成分Bisacurone的制备
1)取姜黄的根，粉碎，加5-8倍重量热水(100℃)回流提取，提取液50℃减压浓缩成浸膏，上样于大孔树脂柱(LX-T28大孔树脂)，用6-8柱体积45％甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃减压浓缩溶液密度1.15-1.20，再上样于大孔树脂柱，用3-5柱体积20％甲醇洗脱，收集洗脱液，50℃减压浓缩溶液密度1.15-1.20；
2)取步骤1)所得浓缩液，用制备高效液相色谱分离，收集响应值最大的色谱峰对应的流出液，再上样于Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，干燥，即得Bisacurone，其化合物结构式如下：
所述制备高效液相色谱的条件为：
色谱柱：Extend-C18 column，5μm，4.6×150mm；流动相：甲醇和水；梯度洗脱程序20％甲醇水溶液(0-8min)，20％甲醇水溶液→100％甲醇(8-13min)；流速1.0ml/min，柱温20℃，波长230nm和254nm。
实施例3本发明组合物的制备
1)苏木提取物的制备
取干燥的苏木心材，粉碎，加入8倍重量的80％浓度食用乙醇，浸泡48h。50℃下15KHz功率的超声波提取90min，过滤取滤液，重复超声波提取3次，合并滤液，50℃减压浓缩溶液密度1.15-1.20。浓缩液冻干得苏木提取物；
2)定心藤提取物
取干燥的定心藤藤茎，粉碎，加入8倍重量的80％浓度食用乙醇，浸泡48h。50℃下15KHz功率的超声波提取90min，过滤取滤液，重复超声波提取3次，合并滤液，50℃减压浓缩溶液密度1.15-1.20，浓缩液冻干得定心藤提取物；
3)取实施例1制备得到的Bisadinrone A、实施例2制备的Bisacurone、步骤1)所得苏木提取物和步骤2)所得定心藤提取物，按1：1：98：100混合均匀，加入药品上常用的辅料或辅助性成分，即得。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1抗心肌缺血再灌注损伤的化合物研究
1仪器与试剂
Bruker DRX-500MHz核磁共振光谱仪(德国Bruker公司)；LC-IT-TOF质谱仪(日本岛津公司)；Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Büchi旋转蒸发仪(瑞士Büchi公司)；SHB-3循环式多用真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；ZF-1型三用紫外仪(上海精科实业有限公司)；GF254硅胶板(50～100nm，临沂市海祥化工有限公司)；SephadexLH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)，大孔树脂(LX-T28，西安蓝晓科技新材料股份有限公司)；有机试剂如食用乙醇、甲醇为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；色谱级甲醇(上海星可高纯溶剂有限公司)。
2、抗心肌缺血再灌注损伤的化合物的制备
2.1药烷型倍半萜类成分Bisacurone的获得
干燥的姜黄根茎，粉碎，加入5-8倍重量的热水，回流提取三次(4h/次)。合并滤液，50℃减压浓缩。浓缩得到的浸膏用大孔树脂柱分离，蒸馏水/分析纯甲醇梯度洗脱(甲醇0％→30％→45％→60％→90％→100％)。采用GF254硅胶板对各馏分进行薄层色谱检测，合并45％甲醇洗脱部位相同的馏分，50℃减压浓缩后再次用大孔树脂柱分离，蒸馏水/分析纯甲醇梯度洗脱(甲醇0％→20％→40％→60％→80％→100％)。采用GF254硅胶板对各馏分进行薄层色谱检测，合并20％甲醇洗脱部位相同的馏分，50℃减压浓缩后，使用Agilent 1200型高效液相色谱分离，色谱柱为Extend-C18 column，5μm，4.6×150mm；使用甲醇/水溶液进行梯度洗脱：20％甲醇水溶液(0-8min，v/v)，20％甲醇水溶液(v/v)→100％甲醇(8-13min)；流速1.0ml/min，柱温20℃，检测波长230nm和254nm。接着使用Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇)纯化，50℃减压浓缩后真空干燥得单体化合物1(制备流程见图1)，纯度大于98％(图2)。化合物1为无色油状物，根据理化性质和1D NMR波谱数据(图3)鉴定为已知化合物，结构式见图4。
2.2药烷型倍半萜类成分Bisadinrone A的获得
采用GF254硅胶板对各馏分进行薄层色谱检测，合并45％甲醇洗脱部位相同的馏分，50℃减压浓缩后再次用大孔树脂柱分离，蒸馏水/分析纯甲醇梯度洗脱(甲醇0％→20％→40％→60％→80％→100％)。采用GF254硅胶板对各馏分进行薄层色谱检测，合并80％甲醇洗脱部位相同的馏分，50℃减压浓缩后，使用Agilent 1200型高效液相色谱分离，色谱柱为Extend-C18 column，5μm，4.6×150mm；使用甲醇/水溶液进行梯度洗脱：50％甲醇水溶液(0-8min，v/v)，50％甲醇水溶液(v/v)→100％甲醇(8-13min)；流速1.0ml/min，柱温20℃，检测波长230nm和254nm。接着使用Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇)纯化，50℃减压浓缩后真空干燥得化合物2(制备流程见图1)，纯度大于98％(图5)。化合物2根据理化性质和1D(图6)、2D NMR波谱数据，对比文献，鉴定该化合物为一个新的没药烷型倍半萜，命名为Bisadinrone A，其平面结构式如图7所示。
结构鉴定数据如下：无色油状物，高分辨质谱HRESI-MS(m/z 273.1461[M+Na]+，计算值273.1461)，分子式为C15H22O3；UV(MeOH)λmax(logε):238(2.81)nm；IR(KBr)νmax:3435,3013,2967,2933,2911,1683,1615,1447,1378,1356,1306,1225,1161,1127,1108,1086,1056,1043,1016,985,966,945,912,895,863,817,787,773,752,734,692,598,531,464,437,412,402cm-1；1HNMR(500MHz，CDCl3)δ：6.30(1H，br s，H-10)，5.94(1H，br s，H-4)，4.21(1H，m，H-1)，4.19(1H，m，H-8)，4.12(1H，d，J＝3.7Hz，H-2)，1.75(3H，br s，Me-15)，2.53(1H，m，H-5a)，2.19(1H，m，H-7)，2.16(3H，br s，Me-12)，2.06(1H，m，H-6)，2.00(1H，m，H-5b)，1.92(3H，br s，Me-13)，0.98(3H，br s，Me-14)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ：64.3(d，C-1)，73.9(d，C-2)，127.0(s，C-3)，127.8(d，C-4)，28.9(t，C-5)，38.3(d，C-6)，39.7(d，C-7)，74.8(d，C-8)，199.6(s，C-9)，120.5(d，C-10)，157.4(s，C-11)，21.1(q，C-12)，28.0(q，13-CH3)，14.2(q，C-14)，22.1(q，C-15)。
2.3Bisacurone、Bisadinrone A抗心肌缺血再灌注损伤的研究
2.3.1利用H9C2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型研究Bisacurone、Bisadinrone A的抗心肌缺血再灌注损伤活性
(1)试验材料
试剂和试剂盒：H9C2细胞；胎牛血清；培养基；PBS；低糖培养基；无糖培养基；DMSO；细胞活力检测(CCK-8)试剂盒；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒。
阳性对照：姜黄素(成都埃法生物科技有限公司，纯度98％)
仪器设备：三气培养箱(i160，美国Thermo Scientific Forma)，倒置显微镜(DMi1，徕卡显微系统(上海)贸易有限公司)，酶标仪(Varioskan Flash，美国Thermofisher)
(2)实验方法
待测化合物准备：Bisacurone、Bisadinrone A和阳性对照分别用含1％DMSO的完全培养基稀释成200，100，50，25和12.5μmol/L的浓度梯度；化合物组合：用含1％DMSO的完全培养基分别稀释Bisacurone和Bisadinrone A成200，100，50，25和12.5μmol/L的浓度梯度，再按体积比1:1混合均匀。
H/R处理：H9C2细胞加完全培养基(含10％胎牛血清，青霉素100U/ml，链霉素100U/ml和5-溴脱氧尿苷10μmol/L的高糖DMEM-H培养基)，37℃，5％CO2，相对湿度70-80％，培养48-60h，取对数生长期细胞，按1×106cell/100μL的密度接种至96孔板，每孔200μL，按图8方法进行H/R处理。
分组：A.正常组，第3步加入含1％DMSO的完全培养基，第1-2，4-5步加完全培养基，37℃，5％CO2，相对湿度70-80％；B.H/R组，第3步加入含1％DMSO的完全培养基，其余同图3；C.化合物处理组，第3步分别加入200，100，50，25和12.5μmol/L的Bisacurone或Bisadinrone A或化合物组合，其余操作同H/R组。D.阳性对照组，第3步分别加入200，100，50，25和12.5μmol/L的阳性对照，其余操作同H/R组。每组6-9个复孔，重复3次。
CCK-8法测细胞活力：每孔加入20μL的CCK-8溶液，在三气培养箱内孵育1h，使用酶标仪在450nm测定吸光度。细胞存活率＝[(A化合物处理组-AH/R组)/(A正常组-AH/R组)]×100％。
试剂盒测心肌细胞损伤标志物乳酸脱氢酶(LDH)活性：每孔吸取100μL细胞上清液，转移至新的96孔板对应孔洞中，按试剂盒说明书操作测定LDH活性。LDH活性＝[(LDHH/R组-LDH化合物处理组)/(LDHH/R组-LDH正常组)]×100％。
统计方法：采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果用均数±标准差表示，多组数据比较采用单因素方差分析，两组比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
(3)实验结果和讨论
Bisacurone和Bisadinrone A分别在200，100，50，25和12.5μmol/L浓度下，表现出一定程度的提高心肌细胞活力(图9)和抑制LDH释放(图10)活性。上述结果提示，Bisacurone和Bisadinrone A可在一定程度上缓解缺氧/复氧造成的H9C2心肌细胞损伤，有抗心肌缺血再灌注损伤的活性。当Bisacurone和Bisadinrone A按溶液体积比1:1组成组合物后，组合物抗心肌缺血再灌注损伤的活性比相同浓度下单体化合物的活性明显增强，在200，100，50，25和12.5μmol/L浓度下，提高心肌细胞活力(图9)和抑制LDH释放的活性均优于阳性对照(图10)。
试验例2抗心肌缺血再灌注损伤的药物研究
1、试验用药物
1.1傣药“更方”(苏木心材)提取物的制备
干燥的苏木心材，粉碎，加入8倍重量的80％浓度食用乙醇，浸泡48h。50℃下15KHz功率的超声波提取90min，过滤取滤液。重复超声波提取3次，合并滤液，50℃减压浓缩。浓缩液冻干得苏木心材提取物。
1.2傣药“邓嘿罕”(定心藤藤茎)提取物的制备
干燥的定心藤藤茎，粉碎，加入8倍重量的80％浓度食用乙醇，浸泡48h。50℃下15KHz功率的超声波提取90min，过滤取滤液。重复超声波提取3次，合并滤液，50℃减压浓缩，浓缩液冻干得定心藤藤茎提取物。
1.3傣药组合物的制备
按重量比，Bisadinrone A:Bisacurone：苏木心材提取物:定心藤藤茎提取物＝1：1：98：100混合均匀，得抗心肌缺血再灌注的傣药组合物。
2.傣药组合物抗心肌缺血再灌注损伤动物实验
2.1傣药组合物高、中、低剂量样品的制备
按1.3所述步骤制备傣药组合物的高、中、低剂量，其中加入的傣药组合物低剂量组为10份，中剂量组为20份，高剂量组为30份。
2.2实验材料
实验动物：8-9周，体重200±20g的SPF级SD雄性大鼠，由云南中医药大学动物实验中心提供。实验过程符合动物伦理学。
阳性对照药：姜黄素(成都埃法生物科技有限公司，纯度98％)。
试剂和试剂盒：2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；组织标本固定液(4％多聚甲醛固定液)，国药集团化学试剂有限公司，批号：20190318；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20191017；肌酸磷酸酶(CK)试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20191103。
仪器设备：冷冻切片机(德国美康，HM550)；动物呼吸机(北京众实迪创科技发展有限责任公司，ZS-MV-HX)；生物信号采集与分析系统(北京众实迪创科技发展有限责任公司，MadLab-4C/501H)
2.3实验方法
造模：适应性饲喂后禁食禁水12h，腹腔注射30g/L戊巴比妥钠麻醉，确认麻醉状态后，备皮，安装好心电监护仪，消毒局部皮肤，铺洞巾后剪开肋间皮肤，钝性分离肌肉、打开心包膜，将心脏推出体外，暴露左冠状动脉前降支，用6/0无菌丝线快速结扎，打活结，看到心脏底部变白，用荷包缝法迅速关闭胸腔，挤压防止气胸，造成左室前壁心肌缺血。心电图II导联下ST段抬高，表明缺血成功。缺血30min后，松开结扎进行再灌注，肉眼所见心尖部变白或紫绀，因缺血抬高的T波下降逐渐恢复时表明已成功进行再灌注，持续180min。再次关闭胸腔，缝合肌肉皮肤，进行心肺复苏。
分组和给药：60只SD雄性大鼠称重并标记，随机分为6组。(1)假手术组，每天灌喂生理盐水(1ml/100g/d，i.g.)，术中仅穿线不结扎；(2)MIRI模型组，术前7天每天灌喂生理盐水(1ml/100g/d，i.g.)，按上述方法进行结扎和再灌注；(3)阳性对照组，姜黄素用生理盐水稀释成100μg/ml，造模前7天每天灌喂1ml/100g/d，其余操作同MIRI组。(4)傣药组合物低剂量处理组，2.1所制傣药组合物低剂量用生理盐水稀释成100mg/ml，造模前7天每天灌喂(1ml/100g/d，i.g.，化合物Bisacurone每日灌喂量为5μg/100g/d，化合物Bisadinrone A每日灌喂量为5μg/100g/d，苏木心材提取物每日灌喂量为0.49mg/100g/d，定心藤提取物每日灌喂量为0.5mg/100g/d)，其余操作同MIRI组。(5)傣药组合物中剂量处理组，2.1所制傣药组合物样品用生理盐水稀释成100mg/ml，造模前7天每天灌喂(1ml/100g/d，i.g.，化合物Bisacurone每日灌喂量为10μg/100g/d，化合物Bisadinrone A每日灌喂量为10μg/100g/d，苏木心材提取物每日灌喂量为0.98mg/100g/d，定心藤提取物每日灌喂量为1.0mg/100g/d)，其余操作同MIRI组。(6)傣药组合物高剂量处理组，2.1所制傣药组合物用生理盐水分别稀释成100mg/ml，造模前7天每天灌喂(1ml/100g/d，i.g.，化合物Bisacurone每日灌喂量为20μg/100g/d，化合物Bisadinrone A每日灌喂量为20μg/100g/d，苏木心材提取物每日灌喂量为1.96mg/100g/d，定心藤提取物每日灌喂量为2mg/100g/d)，其余操作同MIRI组。
指标检测：分别记录术前、缺血时和再灌注后的心电图ST段变化。术后观察动物活动、采食情况。处死前对大鼠采血，检测血清中乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸磷酸酶(CK)的水平，实验操作均按试剂盒说明书进行。每组取6只大鼠进行TTC-Evans blue双染色法，Image-Pro plus图像分析处理软件计算梗死面积，梗死率＝心肌梗死面积/心肌面积×100％。每组取4只大鼠进行HE染色观察心肌组织结构变化。
统计方法：采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。结果用均数±标准差表示，多组数据比较采用单因素方差分析，两组比较用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.4实验结果和讨论
(1)各剂量傣药组合物预处理能在一定程度上抑制大鼠心电图ST段偏移，高、中剂量的抑制效果更好(表1)。
表1.傣药组合物对大鼠MIRI模型心电图S-T的影响( △P＜0.05，*P＜0.01，n＝3)
(2)心肌梗死面积大小是评价药物效果最直接的观察指标。利用Evans blue和TTC双染色法对大鼠心脏切片进行染色并计算心肌梗死率(图11)，各剂量傣药组合物均能在一定程度上减少MIRI造成的心肌梗死面积，且呈剂量依赖性。其中高、中剂量组效果较好，活性好于阳性对照。
(3)HE染色实验表明各剂量傣药组合物预处理均能在一定程度上改善MIRI造成的心肌纤维空泡，胞核固缩、碎裂或溶解等心肌组织形态损伤(图12)。
(4)血清检测结果
CK和LDH是普遍存在于心肌细胞浆中的酶，称为心肌酶。当心肌细胞损伤或坏死时会大量释放到血液中，出现血清心肌酶升高是评价和诊断心肌梗死、心肌细胞受损程度的实验室指标。傣药组合物各剂量预处理均能不同程度的降低大鼠血浆中的LDH和CK的水平，缓解MIRI造成的心肌细胞损伤，且呈剂量依赖性(图13)。
2.5实验结论
傣药组合物对大鼠心肌缺血再灌注具有较好的保护作用，可作为药物应用于预防或治疗心肌缺血再灌注损伤。
3傣药组合物的具体实施
按重量，取傣药组合物10-30份。按重量取药用辅料级的木糖醇、甘露醇、山梨糖醇、低聚乳糖、低聚果糖、异麦芽酮糖醇、赤藓糖醇中的2种或3种共70-90份。傣药组合物和药用辅料过100目筛，充分混匀。80％食用乙醇湿法制粒，干燥后装入胶囊壳中制得胶囊，每粒重1g。成人口服，每次1粒，每天3次。
按重量，取傣药组合物10-30份。按重量取药用辅料级的木糖醇、甘露醇、山梨糖醇、低聚乳糖、低聚果糖、异麦芽酮糖醇、赤藓糖醇中的2种或3种共70-90份。傣药组合物和药用辅料过100目筛，充分混匀。80％食用乙醇湿法制粒，压片后制得片剂，每粒重1g。成人口服，每次1粒，每天3次。
综上，本发明从姜黄中分离得到没药烷型倍半萜类成分Bisadinrone A、Bisacurone具有抗心肌缺血再灌注损伤的作用，将其与傣药苏木提取物、定心藤提取物，按特定重量比组合，在抗心肌缺血再灌注损伤方面效果显著，本发明拓展了姜黄中化学成分的药用价值，也增加了姜黄、苏木、定心藤等传统傣药的综合价值。

Claims (3)

1.一种抗心肌缺血再灌注损伤的化合物，其特征在于：所述化合物如式(II)：
2.权利要求1所述的抗心肌缺血再灌注损伤的化合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)取姜黄的根，加水提取，提取液浓缩成浸膏，上样于LX-T28大孔树脂柱，用45％甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩，再上样于大孔树脂柱，用80％甲醇洗脱，收集洗脱液，浓缩；
2)取步骤1)所得浓缩液，用制备高效液相色谱分离，收集响应值最大的色谱峰对应的流出液，再上样于Sephadex LH-20凝胶柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，干燥，即得；
所述制备高效液相色谱的条件为：
色谱柱：Extend-C18 column 5μm，4.6×150mm；流动相：甲醇和水；流速1.0ml/min，柱温20℃，波长254nm和230nm，梯度洗脱程序：0-8min，50％甲醇水溶液，8-13min，50％甲醇水溶液→100％甲醇。
3.权利要求1所述的化合物在制备抗心肌缺血再灌注损伤的药物中的用途。
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