CN115040476B - 一种复方血三七降糖口服液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于中药提取物的制备技术领域，具体公开了一种复方血三七降糖口服液及其制备方法和应用。所述复方血三七降糖口服液的主药成分包括：血三七的乙醇提取物、杏香兔耳风的乙醇提取物以及葡萄糖酸锌，以血三七与杏香兔耳风为复方中药材，利用优化的工艺条件制备复方中药材提取液，调节至适宜的pH值，然后加入一定量的葡萄糖酸锌、防腐剂和矫味剂，补充纯化水，搅拌均匀。本发明采用乙醇回流法提取血三七及杏香兔耳风中活性成分，并进一步制备了复方血三七口服液体制剂，具有操作简单、成本低廉、吸收快速、服用方便等优点；所制备的复方血三七口服液体制剂具有明显的抗氧化、降血糖作用。

Description

一种复方血三七降糖口服液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及口服液体制剂技术领域，具体涉及一种复方血三七降糖口服液及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是由于人体内胰岛素分泌的不足而引起的以高血糖为特征、蛋白质和脂肪代谢紊乱的一种全身性慢性疾病。国际糖尿病联合会(IDF)官网2021年数据显示，全球5.37亿成年人(20～79岁)患糖尿病，患病率为10.5％，其中4名患者中有3名生活在中低收入国家。中国在过去的10年间(2011-2021年)，糖尿病患者人数由9000万增加至1亿4000万，预计到2030年增加到1.64亿，2045年将增加至1.75亿。可见，糖尿病发病率在全球范围内持续上升。该病终身不愈，且并发症广泛而严重，具有高致死率和高致残率的特点，是威胁人类健康的第三大疾病，也给患者及家庭带来巨大的经济负担。
目前糖尿病分型采取世界卫生组织1999年基于病理生理机制的分型标准，主要分为1型糖尿病(T1DM)和2型糖尿病(T2DM)等，其中T2DM是多基因与环境多因素共同作用下，由胰岛素抵抗或胰岛素分泌相对不足导致血糖升高的慢性代谢疾病，占比可达90％以上。
血三七，别名红三七，为蓼科蓼属植物中华抱茎蓼(Polygonum amplexicauleD.Don var sinense)的干燥根茎。血三七产于山区较多的省，如湖北、湖南、四川、陕西及云南等省皆有充足的血三七资源。中医理论认为其性味归经、甘微苦温、归肝肾经，临床上常用于跌打损伤、肠胃炎等疾病的治疗。现代药理学研究结果证明，血三七具有抗真菌、抗氧化和辅助治疗动脉粥样硬化等作用(张敏,血三七活性成分和药理作用研究进展[J],中国医院用药评价与分析,2019,19(12):1528-1536)。
血三七的主要活性成分包括黄酮类化合物、酚酸类化合物等，化学分析研究结果表明，从血三七根茎的乙醇提取物中分离得到了根皮苷、芦丁、柚皮苷、儿茶素、表儿茶素没食子酸酯、槲皮素呋喃阿拉伯糖苷等黄酮类成分，以及没食子酸、儿茶酸、原儿茶酸、反式阿魏酸、绿原酸、咖啡酸等酚酸类成分，且上述物质都有较好的DPPH自由基清除能力，显示了很强的抗氧化活性。
杏香兔耳风为菊科兔耳风属植物(Ainsliaea fragrans Champ)杏香兔耳风的干燥全草，性微寒，味微苦辛。具有清热解毒、利湿、止血之功效，主治肠炎痢疾、跌打损伤、妇科炎症等(陈欣悦,杏香兔耳风化学成分及药理作用研究进展[J],现代中药研究与实践,2021,35(6):89-93)。
大量研究表明，杏香兔耳风活性成分主要为倍半萜类、黄酮类、酚酸类以及香豆素类化合物。其中，黄酮类化合物主要包含槲皮素、木犀草素、芹菜素及其葡萄糖苷等成分；酚酸类化合物主要包含熊果苷、绿原酸、二咖啡酰基奎宁酸、原儿茶醛、原儿茶酸等成分。黄酮类及酚酸类化合物被证实是发挥抗炎作用的主要功效成分，某种程度上化合物的酸性越强其表现的抗炎作用也会越好。杏香兔耳风的醇提物也被证明在复方中发挥主要的抗氧化作用，具有还原高价铁的电子转移能力、阳离子及中性自由基的清除能力。
某些金属离子失调可影响体内葡萄糖和脂肪代谢，导致胰岛素抵抗，而胰岛素抵抗是T2DM的主要发病机制之一。研究发现，锌是胰岛素分子中的重要组成部分，参与维持胰岛素的稳定性和生物效应。锌可在胰腺α和β细胞中检测到，其对于胰岛β细胞中胰岛素的合成、储存和分泌起关键作用，能够增加胰岛素信号通路的活性，当锌缺乏时可导致胰岛素分泌减少。
此外，锌缺乏还会增加糖尿病的发病风险，其原因是胰岛素在合成过程中需形成含锌六聚体，而缺锌将导致胰岛素合成受限，胰岛素敏感性降低。有研究结果显示，血清锌水平与空腹血糖、餐后血糖、糖化血红蛋白水平及胰岛素抵抗指数呈负相关，表明锌可促进胰岛素分泌、提高胰岛素敏感性，在维持血糖稳定中发挥积极作用。锌还能抑制胰高血糖素的分泌，虽然其具体机制尚不明确，但补锌可以改善2型糖尿病患者的血糖控制情况，锌主要通过抗氧化应激、抑制炎症因子及抗凋亡的作用降低血糖。
综上，锌作为糖尿病的保护元素，高锌摄入可降低血糖、预防糖尿病，缺锌会增加糖尿病发生风险。葡萄糖酸锌是一种临床常用的补锌药物，葡萄糖酸锌中起作用的是其中所含的锌，主要用于预防或治疗由于缺锌所导致的相关疾病或症状。
口服液为现代口服液体制剂，这一剂型在保留了汤剂吸收起效快、作用迅速的同时，拥有更小的体积及更好的口感，增加了患者的顺应性。同时，与颗粒剂、胶囊剂、片剂等固体制剂相比，液体制剂具有工艺简单、服用方便、起效迅速的特点，制备时不需加入填充剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂等辅料，不需进行干燥、制粒、压片等影响产品质量的关键单元操作。
当T2DM一线用药二甲双胍(主要肝AMPK靶点)临床疗效不佳时，常与其他不同靶点降糖药进行联合治疗，因此固定剂量的多组分制剂成为降糖西药的研发热点，这明显借鉴中药复方天然的多组分多靶点来减毒增效的特性、理念和思路。多成分多靶点的复方药物可能是未来降糖药的重要发展方向。
复方是中药新药研发的重要构成部分，从临床有效的降糖复方中找寻新的糖尿病治疗成分及结构改造优化，或者开发等效组分药物，是值得考虑的选项。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的第一个目的在于：提供一种复方血三七降糖口服液，该目的通过如下的技术方案来实现：
一种复方血三七降糖口服液，其包括主药成分和辅料，所述主药成分包括：血三七和杏香兔耳风的混合乙醇提取物以及葡萄糖酸锌。
进一步的，所述辅料包括防腐剂(优选为山梨酸钾)、矫味剂(优选为甜蜜素)。
进一步的，所述防腐剂、葡萄糖酸锌和甜蜜素均为食品级，纯度99％。
本发明的另一个目的在于：提供一种上述复方血三七降糖口服液的制备方法，具体操作步骤如下：
(1)将洁净、干燥的中药材血三七和杏香兔耳风，粉碎后过筛，备用；
(2)以重量比1：(1-3)的上述过筛后的血三七与杏香兔耳风为复方原料，向复方原料中加入60-90v/v％乙醇，然后水浴回流提取0.5-2.5小时(优选为在80℃下水浴回流提取1-2小时)；所得提取液离心后取上清液减压浓缩得无醇水液，即复方血三七浓缩液；
(3)取步骤(2)制备的复方血三七浓缩液以复方血三七浓缩液：纯化水体积比1：(25-100)的比例加纯化水稀释，搅拌均匀，调节溶液的pH＝3.5-4.0(优选为：选择1％枸橼酸调节溶液的pH)，再经微孔滤器除菌；
(4)将防腐剂、葡萄糖酸锌以及矫味剂各自分别溶于水后的溶液加入步骤(3)除菌后所得溶液中，混合均匀后，根据需要加水配置成复方血三七降糖口服液。
进一步的，步骤(2)中过筛后的血三七与杏香兔耳风质量比为1：1。
进一步的，所述步骤(2)的回流提取过程中，料液比为1g：(6-10)mL。
进一步的，所述复方血三七降糖口服液中葡萄糖酸锌的浓度为(1-10)g/L，优选为(3.6-4.0)g/L。
进一步的，所述复方血三七降糖口服液中防腐剂的浓度为(1.5-1.8)g/L，矫味剂的浓度为(0.1-0.3)g/L。
本发明还有一个目的在于提供了上述复方血三七口服液在制备降血糖药物中的应用：将本发明所制备的复方血三七口服液进行活性测试，显示了较强的降血糖和抗氧化作用，具有良好的药用价值。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
血三七乙醇提取物中含有芦丁、根皮苷、儿茶素等黄酮类成分以及没食子酸、儿茶酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸等酚酸类成分，并显示了体内外的降糖活性；杏香兔耳风乙醇提取物中主要含有槲皮素、木犀草素、芹菜素等黄酮类成分以及熊果苷、绿原酸、二咖啡酰基奎宁酸等酚酸类成分。
本申请的实验结果表明，杏香兔耳风的乙醇提取物对DPPH自由基的清除能力较强，显示了明显的抗氧化活性，血三七的乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶具有明显的抑制作用，对糖尿病模型小鼠具有良好的降血糖作用。
本发明充分发挥中药复方多成分多通路多靶点的特点，以血三七、杏香兔耳风和补锌药葡萄糖酸锌为复方成分，突破了单方中药材药效物质基础的研究思路，以实现减毒增效为目的，开发用于治疗复合病因的T2DM复方新型中药口服液体制剂，提高了中药材资源的利用率。
本发明所制备的复方血三七口服液，突破了相关文献和市售产品复方成分复杂、制备过程工序多、耗时长的不足，且口感好、服用方便，并具有明显的降血糖、抗氧化作用，扩大了单方制剂的使用范围，开辟了其新的应用方向。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。
以下实施例中所用杏香兔耳风均为湖北省建始县所产杏香兔耳风的干燥全草，山梨酸钾(食品级，99％纯度)；葡萄糖酸锌(食品级，99％纯度)和甜蜜素(食品级，99％纯度)。
以下实施例中，总黄酮含量的测定参照硝酸铝络合分光光度法(邱宁,正交试验优选杏香兔耳风总黄酮提取工艺[J].中国药房,2010,21(35):3303-3304)，以芦丁为单位计算总黄酮含量。
以下实施例中所用1％枸橼酸为质量百分比浓度为1％的柠檬酸水溶液。
以下实施例1-4中所用血三七粉末为在市面上购买的血三七的细粉末(过100目筛)，未作说明的水均为纯化水。
实施例1一种复方血三七降糖口服液的制备方法，步骤如下：
(1)将经过洗净、干燥的杏香兔耳风全草，粉碎后过60目筛，备用；
(2)称取粉碎过筛后的杏香兔耳风和血三七粉末各50g共计100g作为复方原料，按照复方原料与乙醇的用量比为1g：6mL的比例，向复方原料中加入80v/v％乙醇，于80℃下水浴回流提取1小时，所得提取液离心后，取上清液减压浓缩得无醇水液，即复方血三七提取液，测定总黄酮以芦丁计为46.07mg/mL，4℃冰箱保存。
(3)取步骤(2)制备的复方血三七提取液10mL，加入250mL的水稀释，搅拌均匀后，用1％枸橼酸调节溶液pH＝3.5-4.0，再经0.22μm微孔滤器过滤除菌；
(4)将1.5g山梨酸钾置于烧杯中，加入2mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(5)将3.6g葡萄糖酸锌置于烧杯中，加入5mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(6)将0.10g甜蜜素置于烧杯中，加入2mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(7)将步骤(4)、(5)、(6)溶解后的溶液在搅拌条件下加入步骤(3)除菌后所得的溶液中，搅拌均匀后再加纯化水至1000mL，搅拌15分钟，即得复方血三七降糖口服液。
实施例2一种复方血三七降糖口服液的制备方法，步骤如下：
(1)将经过洗净、干燥的杏香兔耳风全草，粉碎后过60目筛，备用；
(2)称取粉碎过筛后的杏香兔耳风与血三七粉末各50g共计100g作为复方原料，按照复方原料与乙醇用量比为1g：10mL的比例，向复方原料中加入70v/v％乙醇，于80℃水浴回流提取2小时，所得提取液离心后，取上清液减压浓缩得无醇水液，即复方血三七提取液，测定总黄酮以芦丁计为44.92mg/mL，4℃冰箱保存。
(3)取步骤(2)制备的复方血三七提取液10mL，加入250mL的水稀释，搅拌均匀后，用1％枸橼酸调节溶液pH＝3.5-4.0，再经0.22μm微孔滤器过滤除菌；
(4)将1.5g山梨酸钾置于烧杯中，加入5mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(5)将3.8g葡萄糖酸锌置于烧杯中，加入5mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(6)将0.15g甜蜜素置于烧杯中，加入2mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(7)将步骤(4)、(5)、(6)所得溶液在搅拌下加入步骤(3)除菌后所得的溶液中，搅拌均匀后再加纯化水至1000mL，搅拌15分钟，即得复方血三七降糖口服液。
实施例3一种复方血三七降糖口服液的制备方法，步骤如下：
(1)将经过洗净、干燥的杏香兔耳风全草，粉碎后过60目筛，备用；
(2)称取粉碎过筛后的杏香兔耳风与血三七粉末各50g共计100g作为复方原料，按照复方原料与乙醇用量比为1g：6mL的比例，向复方原料中加入80v/v％乙醇，于80℃水浴回流提取1.5小时，所得提取液离心后，取上清液减压浓缩得无醇水液，即复方血三七提取液，测定总黄酮以芦丁计为42.41mg/mL，4℃冰箱保存。
(3)取步骤(2)制备的复方血三七提取液10mL，加500mL水稀释，搅拌均匀后，用1％枸橼酸调节溶液pH＝3.5-4.0，再经0.22μm微孔滤器过滤除菌；
(4)将1.8g山梨酸钾置于烧杯中，加入3mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(5)将4.0g葡萄糖酸锌置于烧杯中，加入8mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(6)将0.30g甜蜜素置于烧杯中，加入5mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(7)将步骤(4)、(5)、(6)所得溶液在搅拌下加入步骤(3)除菌后所得的溶液中，搅拌均匀后再加纯化水至1000mL，搅拌15分钟，即得复方血三七降糖口服液。
实施例4一种复方血三七降糖口服液的制备方法，步骤如下：
(1)将经过洗净、干燥的杏香兔耳风全草，粉碎后过60目筛，备用；
(2)称取粉碎过筛后的杏香兔耳风与血三七粉末各50g共计100g作为复方原料，按照复方原料与乙醇用量比为1g：6mL的比例，向复方原料中加入70v/v％乙醇，于80℃水浴回流提取1小时，所得提取液离心后，取上清液减压浓缩得无醇水液，即复方血三七提取液，测定总黄酮以芦丁计为41.37mg/mL，4℃冰箱保存。
(3)取步骤(2)制备的复方血三七提取液10mL，加500mL水稀释，搅拌均匀后，用1％枸橼酸调节溶液pH＝3.5-4.0，再经0.22μm微孔滤器过滤除菌；
(4)将1.8g山梨酸钾置于烧杯中，加入5mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(5)将4.0g葡萄糖酸锌置于烧杯中，加入8mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(6)将0.50g甜蜜素置于烧杯中，加入5mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(7)将步骤(4)、(5)、(6)所得溶液在搅拌下加入步骤(3)除菌后所得的溶液中，搅拌均匀后再加纯化水至1000mL，搅拌15分钟，即得复方血三七降糖口服液。
实施例5一种复方血三七降糖口服液的制备方法，步骤如下：
(1)将经过洗净、干燥的血三七根茎(产自云南省玉林市的血三七干燥根茎)和杏香兔耳风全草，粉碎后分别过100目和60目筛，备用；
(2)称取粉碎过筛后的血三七与杏香兔耳风各50g共计100g作为复方原料，按照复方原料与乙醇用量比为1g：10mL的比例，向复方原料中加入70v/v％乙醇，于80℃水浴回流提取1.5小时，所得提取液离心后，取上清液减压浓缩得无醇水液，即复方血三七提取液，测定总黄酮以芦丁计为68.00mg/mL，4℃冰箱保存。
(3)取步骤(2)制备的复方血三七提取液10mL，加500mL水稀释，搅拌均匀后，用1％枸橼酸调节溶液pH＝3.5-4.0，再经0.22μm微孔滤器过滤除菌；
(4)将1.8g山梨酸钾置于烧杯中，加入5mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(5)将3.8g葡萄糖酸锌置于烧杯中，加入5mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(6)将0.15g甜蜜素置于烧杯中，加入2mL纯化水，搅拌均匀，使其完全溶解；
(7)将步骤(4)、(5)、(6)所得溶液在搅拌下加入步骤(3)除菌后所得的溶液中，搅拌均匀后再加纯化水至1000mL，搅拌15分钟，即得复方血三七降糖口服液。
(2-2)参照步骤(2)、(3)和(7)制备得到血三七提取液、杏香兔耳风提取液，具体方法为：将复方原料分别替换为粉碎过筛后的血三七、杏香兔耳风，得到过滤除菌后的血三七提取母液、杏香兔耳风提取母液，然后分别取10mL再加纯化水至1000mL得到血三七提取液、杏香兔耳风提取液。
(2-3)参照上述步骤(2)-(7)制备得到血三七口服液、杏香兔耳风口服液，具体方法为将步骤(2)的复方原料分别替换为粉碎过筛后的血三七、杏香兔耳风，其他操作相同。
(3-1)参照上述步骤(1)-(7)制备复方口服液，不同的是，省去步骤(5)，其他操作相同。
(7-7)参照上述步骤(2-2)制备血三七提取液+锌后的样品、杏香兔耳风提取液+锌后的样品，具体为：在加纯化水之前，向其中加入步骤(5)所制备的葡萄糖酸锌溶液，然后再加纯化水，最终样本中葡萄糖酸锌含量均为3.80mg/mL。
(7-8)参照上述步骤(1)-(7)制备复方提取液，不同的是，省去步骤(4)-步骤(6)，只进行步骤(1)-(3)和步骤(7)。
(7-9)参照上述步骤(1)-(7)制备复方提取液+锌后的样品，不同的是，省去步骤(4)和步骤(6)，只进行步骤(1)-(3)、(5)和步骤(7)。
实施例6
用上述实施例5制备得到的复方血三七降糖口服液进行DPPH自由基清除率实验研究，以证明本发明方法制得的复方血三七降糖口服液具有抗氧化作用，可作为抗衰老等功能性保健食品。
抗氧化活性研究的样品分别为：实施例5步骤(2-2)制备的血三七提取液(即以下所称A1样品)、杏香兔耳风提取液(即以下所称B1样品)、实施例5步骤(7-8)制备的复方提取液(即以下所称(AB)1样品)、实施例5步骤(7-9)制备的复方提取液+锌(即以下所称(AB)2样品)，其总黄酮含量以芦丁计分别为450mg/L、225mg/L、680mg/L、680mg/L，实施例5步骤(7-7)制备的各提取液+锌后的样品(葡萄糖酸锌含量均为3.80mg/mL)，即以下所称A2和B2样品；以上样品的总黄酮含量已知，分别加纯化水稀释使得以上样品中总黄酮含量为20mg/L、60mg/L和100mg/L。按照文献方法测定不同浓度提取液样品及单独检测不同浓度的葡萄糖酸锌溶液对DPPH自由基的清除率，结果见表1。
表1不同样品对DPPH自由基的清除率结果(％)
Figure BDA0003713097870000101
注：黄酮含量指以芦丁计的总黄酮含量。A1-血三七提取液；A2-血三七提取液+Zn2 +；B1-杏香兔耳风提取液；B2-杏香兔耳风提取液+Zn2+；(AB)1-复方提取液；(AB)2-复方提取液+Zn2+；-1.97(0.38)表示：单独检测浓度为0.38mg/mL葡萄糖酸锌溶液对DPPH自由基的清除率-1.97％，以此类推。
本发明中对DPPH自由基清除率的测定参考张煜(扁枝槲寄生提取物体外抗氧化、降糖、降脂效应研究[D].云南农业大学,2016)的方法，稍作改进，具体为：分别向试管中加入适量体积的已知总黄酮含量的待测溶液，加入无水甲醇稀释至8.0mL使最终检测样品中总黄酮含量分别为20mg/L、60mg/L、100mg/L后，再加入2.0mL 40μg/mL的DPPH的甲醇溶液(DPPH溶于无水甲醇中制得)，使反应体系总体积为10.0mL，摇匀，在暗处室温放置20min后，用无水甲醇进行调零，接着于514nm处测定吸光度，并根据公式(1)计算清除率：
Figure BDA0003713097870000102
式中：Ai：8.0mL待测样品+2.0mL DPPH甲醇溶液时测得的吸光度；
Aj：8.0mL待测样品+2.0mL无水甲醇时测得的吸光度；
A0：8.0mL无水甲醇+2.0mL DPPH甲醇溶液时测得的吸光度。
由表1可知，葡萄糖酸锌溶液中锌含量低于0.76mg/mL时对DPPH的清除率较低(小于20％)，各样品的DPPH清除率均随总黄酮含量增加而增加；
总黄酮含量相同时，复方提取液的DPPH清除能力均大于单方提取液，且加入葡萄糖酸锌后样品的DPPH清除率均大于未加锌时的清除率，复方提取液+Zn2+样品的DPPH自由基清除能力均大于单方提取液、单方加锌提取液及未加锌的复方提取液。
当提取液中总黄酮含量为100mg/L时，复方提取液+锌样品对DPPH自由基的清除能力分别比血三七提取液、杏香兔耳风提取液和复方提取液的DPPH自由基清除率提高了20.99％、25.76％和13.23％；复方提取液+锌样品(葡萄糖酸锌含量为0.56mg/L)比血三七提取液+锌后(葡萄糖酸锌含量为0.84mg/L)、杏香兔耳风提取液+锌后(葡萄糖酸锌含量为1.69mg/L)的DPPH自由基清除率分别提高了13.26％、7.07％。此结果表明，复方提取液抗氧化活性大于血三七或杏香兔耳风单方提取液，而葡萄糖酸锌的加入使复方提取液的抗氧化活性进一步增强，三者联用具有协同增效作用。
根据黄酮类化合物的结构及其性质，推测本发明制备的复方提取液中的黄酮类成分与锌发生了络合反应，能够协同黄酮类成分提高抗DPPH自由基的能力，使其对DPPH自由基的清除率大大提高，并使复方提取液中黄酮类成分的生物学效应稳定或加速发挥，从而显示出协同增效作用。
实施例7：
用上述实施例5制备得到的复方血三七降糖口服液进行体内、外降糖药理实验、药理结果与分析，以证明本发明方法制得的复方血三七降糖口服液具有降低血糖的作用，可以应用于糖尿病的治疗。以下实施例中所用缓冲溶液均为pH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液。
实验一：
体外降糖实验各提取液样品与实施例6中抗氧化实验的待测样品相同。
α-葡萄糖苷酶抑制率测定参考张煜(扁枝槲寄生提取物体外抗氧化、降糖、降脂效应研究[D].云南农业大学,2016)的方法，并稍作改进，具体操作如下：
在96孔板上加入pH＝6.8的磷酸盐缓冲溶液1mL，加入待检测样品溶液1.0mL，再加入1.0mL 5U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，混匀，在37℃水浴中反应15min，而后加入2.5mmol/LpNPG溶液2.0mL，继续在37℃水浴反应15min后加入5mL 0.1mol/L NaCO3溶液终止反应，然后于405nm处测定吸光度。根据公式(2)计算抑制率：
Figure BDA0003713097870000121
式中：A样品：缓冲液+α-葡萄糖苷酶溶液+待测样品溶液+pNPG溶液时的吸光度；
A背景：缓冲液+待测样品溶液+pNPG溶液+NaCO3溶液时的吸光度；
A空白：缓冲液+α-葡萄糖苷酶溶液+pNPG溶液+NaCO3溶液时的吸光度。
α-淀粉酶抑制率测定参考张煜(扁枝槲寄生提取物体外抗氧化、降糖、降脂效应研究[D].云南农业大学,2016)的方法，并稍作改进，具体操作如下：
DNS显色剂的配制：称取1％3,5-二硝基水杨酸，12％酒石酸钾钠，0.5％苯酚和0.5％无水亚硫酸钠共溶于0.4mol/L NaOH，混匀。在室温下避光放置7d后使用。
将1.0mL的待测样品溶液与1.0mL5U/mL的α-淀粉酶溶液加入具塞试管中，在37℃水浴中反应30min，再加入1％的淀粉溶液1mL，继续37℃水浴反应15min，水浴反应结束后，立即加入1mL DNS显色剂，并且沸水浴5min后冷却至室温。加蒸馏水至10mL稀释混匀，于540nm处进行吸光度的测定。利用公式(3)计算α-淀粉酶抑制率：
Figure BDA0003713097870000122
式中：A抑制：α-淀粉酶溶液+待测样品溶液+淀粉溶液+DNS的吸光度；
A背景：待测样品溶液+淀粉溶液+DNS的吸光度；
A空白：α-淀粉酶溶液+淀粉溶液+DNS的吸光度。
不同样品对α-葡萄糖苷酶抑制率测定结果见表2，不同样品对α-淀粉酶抑制率测定结果见表3。
表2不同样品的α-葡萄糖苷酶抑制率结果(％)
Figure BDA0003713097870000131
注：黄酮含量指以芦丁计的总黄酮含量。A1-血三七提取液；A2-血三七提取液+Zn2 +；B1-杏香兔耳风提取液；B2-杏香兔耳风提取液+Zn2+；(AB)1-复方提取液；(AB)2-复方提取液+Zn2+；4.55(0.38)表示：单独检测浓度为0.38mg/mL的葡萄糖酸锌溶液对DPPH自由基的清除率4.55％，以此类推。
由表2可知，在实验浓度范围内葡萄糖酸锌对α-葡萄糖苷酶抑制率较小(低于9％)；各样品的α-葡萄糖苷酶抑制率均具有一定的浓度依赖性，随总黄酮含量的增加而增加，但上升幅度不大；总黄酮含量相同时，各样品的α-葡萄糖苷酶抑制率大小顺序为：复方提取液+锌>复方提取液>血三七提取液+锌>血三七提取液>杏香兔耳风提取液+锌>杏香兔耳风提取液。
当测定样品中总黄酮含量为100mg/L时，复方提取液+锌后(葡萄糖酸锌含量为0.56mg/mL)对α-葡萄糖苷酶抑制率分别比血三七提取液+锌后(葡萄糖酸锌含量为0.84mg/mL)、杏香兔耳风提取液+锌后(葡萄糖酸锌含量为1.69mg/mL)和复方提取液的α-葡萄糖苷酶抑制率分别提高了16.12％、22.45％和10.84％。
表3不同样品的α-淀粉酶抑制率结果(％)
Figure BDA0003713097870000132
注：黄酮含量指以芦丁计的总黄酮含量。A1-血三七提取液；A2-血三七提取液+Zn2 +；B1-杏香兔耳风提取液；B2-杏香兔耳风提取液+Zn2+；(AB)1-复方提取液；(AB)2-复方提取液+Zn2+；8.25(0.38)表示：单独检测浓度为0.38mg/mL葡萄糖酸锌溶液对DPPH自由基的清除率8.25％，以此类推。
由表3可知，在实验浓度范围内葡萄糖酸锌对α-淀粉酶抑制率较小(低于10％)；各样品的α-淀粉酶抑制率均具有一定的浓度依赖性，随总黄酮含量的增加而增加，其中血三七提取液的α-淀粉酶抑制率上升幅度不大；总黄酮含量相同时，各样品的α-淀粉酶抑制率大小顺序为：复方提取液+锌>复方提取液>杏香兔耳风提取液+锌>杏香兔耳风提取液>血三七提取液+锌>血三七提取液。
当测定样品中总黄酮含量为100mg/L时，复方提取液+锌后(葡萄糖酸锌含量为0.56mg/mL)对α-淀粉酶抑制率比血三七提取液+锌后(葡萄糖酸锌含量为0.84mg/mL)、杏香兔耳风提取液+锌后(葡萄糖酸锌含量为1.69mg/mL)、复方提取液的α-淀粉酶抑制率分别提高了63.32％、12.90％和15.42％。
由表2和表3可知，将血三七与杏香兔耳风复方中药材提取液加入一定量葡萄糖酸锌制备的复方血三七降糖口服液产生了多成分协同作用，其α-葡萄糖苷酶抑制活性与α-淀粉酶抑制活性大大提高，能够减缓葡萄糖的吸收入血，从而降低血糖水平。
实验二：
在此基础上，通过糖尿病模型小鼠进行复方血三七口服液体内降糖实验研究：
体外降糖实验各口服液样品如下：
实施例5步骤(2-3)制备的血三七口服液、杏香兔耳风口服液、实施例5步骤(3-1)制备的复方口服液、实施例5步骤(7)制备的复方血三七降糖口服液，其总黄酮含量以芦丁计分别为450mg/L、225mg/L、680mg/L、680mg/L。
造模方法：选用SPF级健康昆明种小鼠(18-22g)，在第一天每尾静脉注射四氧嘧啶(ALX)120mg/kg(体重，下同)，第三天按相同方法再注射ALX 80mg/kg，72小时后测定小鼠空腹血糖。以血糖值>10.0mmol/L为造模成功。
实验方法：昆明小鼠雌雄各半。禁食12小时后，造模，取血糖值>10.0mmol/L的小鼠为糖尿病鼠。实验分为：正常组、模型组、阳性对照组(灌胃阿卡波糖，4mg/kg)和治疗组，每组10只小鼠。各治疗组灌胃(100mg/kg)不同口服液，模型组以等量蒸馏水代替，正常组为健康小鼠，按照正常方式进行喂食。各组1次/天，连续灌胃给药14天。于末次给药2小时后测定小鼠餐后血糖水平，结果见表4。
由表4可知，治疗14天后，除杏香兔耳风口服液治疗组外，其余各治疗组与模型组相比，空腹血糖值均有显著性下降(p<0.01)，且将血三七、杏香兔耳风与葡萄糖酸锌联用制备的口服液降低糖尿病小鼠空腹血糖的作用最为显著(p<0.001)，其餐后2小时血糖基本都能恢复到餐前血糖水平，比阿卡波糖效果好，且无明显的毒副作用。
表4不同样品对糖尿病小鼠血糖的影响
Figure BDA0003713097870000151
Figure BDA0003713097870000152
注：与模型组比较，***p<0.001，**p<0.01
表4结果表明，本发明制备的复方血三七降糖口服液具有较好的抑制α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶的活性，可明显降低糖尿病小鼠空腹血糖和餐后血糖，兼具有良好的抗氧化性，具备多途径降糖的基础，具有良好的降糖方向应用前景。

Claims (6)

1.一种复方血三七降糖口服液，其包括主药成分和辅料，所述主药成分包括：血三七和杏香兔耳风的混合乙醇提取物以及葡萄糖酸锌。
2.根据权利要求1所述的复方血三七降糖口服液，其特征在于，所述辅料包括防腐剂、矫味剂。
3.一种权利要求1或2所述复方血三七降糖口服液的制备方法，所述制备方法的操作步骤如下：
（1）将洁净、干燥的中药材血三七和杏香兔耳风，分别粉碎后过筛，备用；
（2）以重量比1：（1-3）的上述过筛后的血三七与杏香兔耳风为复方原料，向复方原料中加入60-90 v/v%乙醇，然后水浴回流提取0.5-2.5小时；所得提取液离心后取上清液减压浓缩得无醇水液，即复方血三七浓缩液；
（3）取步骤（2）制备的复方血三七浓缩液以复方血三七浓缩液：纯化水体积比1：（25-100）的比例加纯化水稀释，搅拌均匀，调节溶液的pH=3.5-4.0，再经微孔滤器除菌；
（4）将防腐剂、葡萄糖酸锌以及矫味剂各自分别溶于水后的溶液加入步骤（3）除菌后所得溶液中，混合均匀后，根据需要加水配置成复方血三七降糖口服液。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中过筛后的血三七与杏香兔耳风质量比为1：1；所述复方血三七降糖口服液中葡萄糖酸锌的浓度为（1-10）g/L。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的回流提取过程中，复方原料与乙醇的用量比为1g：（6-10）mL。
6.权利要求1或2所述的复方血三七口服液在制备降血糖药物中的应用。
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