CN112057510B - 栀子提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种栀子提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其中，所述栀子提取物的制备方法为：以栀子为原料、低碳醇为溶媒进行提取，提取液浓缩至浸膏；所得浸膏经大孔树脂柱层析，用乙醇洗脱，收集30～50v/v％乙醇洗脱部位，回收溶剂，干燥，得到栀子提取物；所述的低碳醇为含1～6个碳原子的醇中的一种或两种以上的组合。申请人通过实验发现，栀子醇提物作为唯一活性成分可明显减轻TNBS诱导的肠炎模型小鼠体重降低，抑制结肠炎模型小鼠疾病活动指数评分的升高，减轻结肠炎模型结肠组织炎性细胞浸润。

Description

栀子提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及植物提取物的应用，具体涉及栀子提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因尚不十分清楚的结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病，病变局限于大肠黏膜及黏膜下层。病变多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠。UC作为一种典型的炎症性肠病，好发于30～40岁青壮年，且无性别差异，临床主要表现为腹痛伴腹泻、粪便隐血严重且有化脓、患者体重日渐减轻、精神状况萎靡等，而且该病病程长、易复发，较难治愈，多并发肠穿孔、息肉、溃疡等，严重影响患者生活质量和生存。现代研究表明该病有较高的几率转化为结肠癌。流行病学研究表明，欧洲地区的UC发病率高达505/100,000，加拿大地区的发病率为248/100,000，美国的发病率为214/100,000。随着生活方式、饮食规律的改变，亚洲和中东等地区的UC发病率呈逐年增高的趋势。

目前，药物治疗和手术切除是控制UC的主要方法，常用治疗药物有以下5类：(1)氨基水杨酸类，如柳氮磺胺吡啶和美莎拉嗪；(2)糖皮质激素类，如地塞米松和二丙酸倍氯米松；(3)免疫抑制剂，如6-巯基嘌呤和环孢素；(4)生物制剂，如TNF-α抑制剂英夫利昔单抗；(5)抗感染药物，如抗菌素甲硝唑和环丙沙星。这些药物主要是通过抑制异常的免疫应答，减轻结肠局部炎症，阻止病情进展，但存在疗效不稳定、不良反应多、耐受性差和不适合长期用药或价格昂贵等不足。因此，从中药中寻找疗效确切、不良反应少，且质量可控的抗UC药物具有重要的价值。

栀子是茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，性寒、味苦，是我国卫生部第Ⅰ批药食两用资源，具有护肝、利胆、降压、镇静、止血、消肿等作用，在中医临床常用于治疗黄疸型肝炎、扭挫伤、高血压、糖尿病等症。经检索，发现将栀子应用于治疗肠炎的代表性专利有：

公开号为CN102727622A和CN105535893A发明专利，均采用含有栀子等十余味中药的复方制成的治疗结肠炎的中药灌肠剂。虽然都具有一定的治疗效果，但由于是外用灌肠剂，存在使用不方便及使用过程中患者较为痛苦的不足。

公开号CN111281921A公开了一种含有栀子或栀子花等中药的治疗感冒、肺炎、肠炎、肾炎的肺形草银翘解毒消炎组合物，具体是由下列质量百分比的肺形草10-20份、金银花10-20份、连翘20-40份、栀子或栀子花10-20份、杜仲或杜仲叶10-20份、三白草10-20份、代代花10-20份，并添加适量药用辅料。该药物组合物可以是内服或外用，虽能克服灌肠剂使用痛苦的不足，但其同样是复方药物，而且针对的仅是普通伴有腹泻(肠炎)症状的病患(实施例12)，对溃疡性结肠炎没有针对性。

公开号为CN109568418A的发明专利，公开了栀子水提取物在抑制LPS(脂多糖)诱导的肠粘膜损伤中的应用。虽然该发明仅以栀子为原料提取而得，试验结果也表明栀子水提物能显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-6和IL-1的产生(P<0.05)，但抑制效果并不是极为显著；另一方面，与正常对照组相比，LPS模型组和栀子水提物低剂量组的T-AOC(总抗氧化能力)、T-SOD(总超氧化物歧化酶)和GSH-PX(谷胱甘肽过氧化物酶)活性显著降低，但高剂量组除T-AOC显著降低外，T-SOD和GSH-PX无显著差异。

目前，尚未见有以栀子醇提物应用于治疗TNBS(2,4,6-三硝基苯磺酸)诱导的溃疡性结肠炎中的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供栀子提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

本发明的技术方案为：栀子提取物作为唯一活性成分在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其中，所述栀子提取物的制备方法为：以栀子为原料、低碳醇为溶媒进行提取，提取液浓缩至浸膏；所得浸膏经大孔树脂柱层析，用乙醇洗脱，收集30～50v/v％乙醇洗脱部位，回收溶剂，干燥，得到栀子提取物；所述的低碳醇为含1～6个碳原子的醇中的一种或两种以上的组合。

本申请中，所述的溃疡性结肠炎为2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的溃疡性结肠炎。

本申请中涉及的栀子提取物的制备方法中，作为溶媒的低碳醇优选为甲醇、乙醇或正丙醇，最优选为乙醇；所述低碳醇的浓度优选为50～90v/v％，更优选为60～80v/v％。所述的提取的方式可以是现有常规的浸提或加热提取，优选采用加热提取，此时，提取优选在50℃至溶媒的沸点温度范围内进行。更优选的，提取的方式优选为回流提取，提取的次数可根据需要进行，通常为1～3次；每次提取时所用溶剂的量与现有常规提取操作相同，具体可以是原料重量的3～12倍；每次提取的时间可以是0.5～3h，也可以是更长的时间；为了更有利于提取，优选是将栀子粉碎后再进行提取操作。所述大孔树脂的型号为现有技术中的常规选择，优选为HPD600、D101、D102、HP-20或AB-8等。在洗脱时，更优选是收集35v/v％乙醇洗脱部位。

采用本申请所述方法制得的栀子提取物，经检测(HPLC法)，其中京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷的含量≥90mg/g，京尼平苷的含量≥320mg/g，6″-对-香豆酰京尼平龙胆双糖苷的含量的含量≥30mg/g。

本发明还包括一种治疗溃疡性结肠炎的药物，含有治疗上有效剂量的栀子提取物；其中，所述栀子提取物的制备方法为：以栀子为原料、低碳醇为溶媒进行提取，提取液浓缩至浸膏；所得浸膏经大孔树脂柱层析，用乙醇洗脱，收集30～50v/v％乙醇洗脱部位，回收溶剂，干燥，得到栀子提取物；所述的低碳醇为含1～6个碳原子的醇中的一种或两种以上的组合。所述栀子提取物的制备方法中涉及低碳醇、大孔树脂、提取方式等的选择与前述相同。

上述治疗溃疡性结肠炎的药物的剂型可以是药学上可接受的剂型，如胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂、针剂、缓释剂、软膏剂或雾化剂等常规剂型。

申请人通过实验发现，栀子醇提物作为唯一活性成分可明显减轻TNBS诱导的肠炎模型小鼠体重降低，抑制结肠炎模型小鼠疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分的升高，减轻结肠炎模型结肠组织炎性细胞浸润。而且，栀子醇提物低、中、高剂量组均能显著降低模型小鼠结肠组织促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量(中、高剂量组具有极显著差异性)。因此，栀子醇提物可以减轻TNBS诱导的炎症性肠病模型小鼠炎症反应，改善炎症性肠病疾病严重程度，可用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。

附图说明

图1为本发明实施例制得的栀子提取物高效液相色谱图；其中，(a)为混合对照品，(b)为栀子提取物；图中横坐标为min，纵坐标为mAU，1号峰表示京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷；2号峰表示京尼平苷；3号峰表示6″-对-香豆酰京尼平龙胆双糖苷。

图2为栀子提取物对UC模型大鼠的生理指标的影响；其中(a)为各组大鼠的体重变化曲线，(b)为各组大鼠DAI评分，(c)为各组大鼠结肠外观，(d)外观评分；图中，Control表示对照组，TNBS表示模型组，SASP表示阳性组，HIG表示栀子提取物高剂量给药组，MIG表示栀子提取物中剂量给药组，LIG表示栀子提取物低剂量给药组。

图3为各组大鼠结肠组织的H&E切片图，其中，A表示对照组(即Control)，B表示模型组(即TNBS)，C表示阳性组(即SASP)，D表示栀子提取物高剂量给药组(即HIG)，E表示栀子提取物中剂量给药组(即MIG)，F表示栀子提取物低剂量给药组(即LIG)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述，以更好地理解本发明的内容，但本发明并不限于以下实施例。

以下各实施例中所用的栀子采收于江西省樟树GAP基地，经江西中医药大学范崔生教授鉴定为栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥果实。

实施例1

将栀子粉碎成粗粉(20目)，取1000g置于提取罐中，加入70v/v％乙醇回流提取2次(每次提取时溶媒的加入量依次分别为栀子重量的8倍量和5倍量，2次的提取时间均为2小时)；合并提取液，过滤，将滤液浓缩至浸膏(无醇味)，得到浸膏；所得浸膏加水成混悬液，上HPD600大孔树脂柱(树脂用量为浸膏重量的10倍，吸附流速为2BV/h)，先用8倍柱体积的水洗脱，然后用4倍柱体积的35v/v％乙醇洗脱，收集35v/v％乙醇洗脱部位，减压浓缩至无醇味后冷冻干燥，得到栀子提取物70g。

精密称取本实施例制得的栀子提取物0.2g，置100ml具塞锥形瓶中，精密加入70v/v％乙醇25ml，于30℃下超声30min，放冷后称重，用70v/v％乙醇补足减失的重量，离心(3000r/min，10min)，取上清液过0.22μm微孔滤膜后进行高效液相色谱检测。色谱条件如下(色谱条件中涉及的百分比均为体积百分比)：色谱条色谱柱Agilent C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为乙腈(A)-0.2％磷酸溶液(B)；梯度洗脱：0～10min(7％A)，10～13min(7～10％A)，13～22min(10％A)，22～28min(20％A)，28～40min(20％A)，40～50min(30％A)，50～65(30％A)；流速1mL/min；进样量5μL；柱温30℃；DAD检测器采集范围：195～700nm；检测波长为238nm。检测京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷、6″-对-香豆酰京尼平龙胆双糖苷的含量分别为91.086mg/g、326.359mg/g、35.384mg/g。高效液相色谱图如图1所示。

实施例2

将栀子粉碎成粗粉(20目)，取1000g置于提取罐中，加入80v/v％甲醇回流提取3次(每次提取时溶媒的加入量依次分别为栀子重量的的10倍量、8倍量和5倍量，3次的提取时间依次分别为2小时、1.5小时和1小时)；合并提取液，过滤，将滤液浓缩至浸膏(无醇味)，得到浸膏；所得浸膏加水成混悬液，上D101大孔树脂柱(树脂用量为浸膏重量的8倍，吸附流速为2BV/h)，先用6倍柱体积的水洗脱，然后用3倍柱体积的50v/v％乙醇洗脱，收集50v/v％乙醇洗脱部位，减压浓缩至无醇味后冷冻干燥，得到栀子提取物75g。

实施例3

将栀子粉碎成粗粉(40目)，取1000g置于提取罐中，加入50v/v％正醇回流提取2次(每次提取时溶媒的加入量均为栀子重量的8倍量，2次的提取时间依次分别为2小时和1小时)；合并提取液，过滤，将滤液浓缩至浸膏(无醇味)，得到浸膏；所得浸膏加水成混悬液，上AB-8大孔树脂柱(树脂用量为浸膏重量的10倍，吸附流速为2BV/h)，先用8倍柱体积的水洗脱，然后用3倍柱体积的40v/v％乙醇洗脱，收集50v/v％乙醇洗脱部位，减压浓缩至无醇味后冷冻干燥，得到栀子提取物72g。

实施例4

重复实施1，不同的是，用HP-20大孔树脂柱代替HPD600大孔树脂柱；在洗脱时，用40v/v％乙醇代替35v/v％乙醇。

最后得到栀子提取物72g。

下面结合具体实验以说明栀子提取物对治疗炎症性肠病的应用。

1实验材料

1.1药物

取按本发明实施例1所述方法制备的栀子提取物，用0.5％羧甲基纤维素钠溶液制备栀子提取物高、中、低剂量组(其中栀子提取物高剂量组为200mg/kg，栀子提取物中剂量组为100mg/kg，栀子提取物低剂量组为50mg/kg)，保存备用。

柳氮磺吡啶(SASP)肠溶片购于上海信谊天平药业有限公司。

1.2动物

SPF级雄性SD大鼠42只，体重(180±20)g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK(湘)2016-0004。饲养条件：实验室温度控制在20～25℃，湿度50～60％，喂以大鼠标准饲料，自由饮水。

1.3试剂

2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)(购自于Sigma aldrich分装)；NO检测试剂盒、MDA检测试剂盒、总SOD活性检测试剂盒均购买于上海碧云天生物技术有限公司；髓过氧化物酶(MPO)检测试剂盒购于南京建成生物科技有限公司；大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α试剂盒均购买于杭州联科生物技术股份有限公司；粪便隐血定性检测试剂盒(邻联甲苯胺法购于北京百奥莱博科技有限公司。

2实验方法

2.1动物分组、UC模型的建立及给药

将42只SD雄性大鼠随机分为6组，即对照组、模型组、SASP组(也称阳性组，200mg/kg)、栀子提取物低、中、高(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg)剂量组。适应性喂养1周后，采用文献(Huang Y,Yin J,Gao JP,Wang Y,Dong L,Zhao JH(2018)Portulacaoleracealextract alleviates trinitrobenzene sulfonic acid-inducedcolitis inrats.Biomed Pharmacotherapy 105:434-439，TNBS诱导)报道方法制备大鼠UC模型，大鼠禁食24h后一次性将TNBS/50％乙醇溶液混合溶液(1:1混合)用橡胶输液管缓慢注入肛门约8cm处肠腔内，捏紧肛门，倒置几分钟，造模剂量为0.5ml/100g，对照组注入相同体积生理盐水。造模后第2天开始给药，按上述剂量灌胃给药，对照组和模型组均予以蒸馏水，以上各组每天给药1次，共给药7天。

2.2一般体征观察

自建立大鼠溃疡性结肠炎模型之日起直至灌胃给药结束，每天观察各组大鼠状态(包括精神、活动以及体毛等)，每天在同一时间给大鼠称重并记录，观察各组大鼠的粪便情况(包括颜色、性状)，并蘸取粪便通过隐血试剂盒测定有无隐血情况，对大鼠进行DAI评定，参照文献(Cooper H S,Murthy S N,Shah R S,et al.Clinicopathologic study ofdextran sulfate sodium experimental murine colitis[J].Lab.Invest.1993,69,238–249)所描述的评分标准进行评分。

2.3标本采集

治疗7d后处死大鼠，取近肛门8cm处结肠，去除粪便，同时进行结肠组织形态宏观观察并对其进行评分(评分参考Zhou J T,Wang T T,Dou Y X,Huang Y F,Qu C,Gao J S,Huang Z J,Xie Y L,Huang P,Lin Z X,Su Z R(2018)Brusatol ameliorates 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid-induced experimental colitis in rats:Involvementof NF-κB pathway and NLRP3 inflammasome.Int Immunopharmacology 64:264-274)。最后将结肠剪成两段，一部分用甲醛固定后，经脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色，显微镜下观察结肠病理情况；另一部分根据试剂盒要求制备组织匀浆液，离心后提取上清液，置于-80℃冻存后按照试剂盒说明书的步骤测定各组大鼠结肠MPO、NO、SOD、MDA、IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

3实验结果

3.1大鼠一般体征观察

如图2(a)、图2(b)所示，对照组的大鼠饮水、进食正常，无明显体质量下降，无腹泻、便血等异常改变。模型组的大鼠出现饮食减少，出现不同程度的腹泻、便血、肛门血染等症状，体重下降趋势高于对照组(^##P<0.01)，模型组DAI评分明显高于对照组(^##P<0.01)。药物治疗后，SASP组、栀子提取物不同剂量组饮食饮水状态逐渐恢复，大便腹泻、便血现象逐渐消失，与模型组相比，栀子提取物不同剂量组的大鼠体重逐渐恢复(^*P<0.05，^**P<0.01)，SASP组，栀子提取物高、中剂量组的DAI评分显著降低(^*P<0.05，^**P<0.01)。

3.2大鼠结肠观形态观察及评分

如图2(c)所示，正常组的大鼠结肠颜色新鲜，没有出现水肿、充血和溃疡现象，结肠表面光滑、有弹性，黏膜皱襞清晰。模型组的大鼠结肠水肿、充血、肠壁增厚、粘膜糜烂、溃疡和与邻近组织的粘连短。SASP组、栀子提取物不同剂量组的结肠颜色得到改善，结肠粘膜基本无充血、淤血、水肿，糜烂和溃疡面积明显减少。按结肠宏观评分标准进行评分，与对照组相比，模型组评分显著性升高(^##P<0.01)；与模型组相比较，SASP组、栀子提取物不同剂量组评分显著性下降(^*P<0.05，^**P<0.01)，见图2(d)。

3.3大鼠结肠组织病理学观察

光镜下观察各组大鼠结肠组织切片发现：对照组结肠表面上皮、隐窝、粘膜肌层、粘膜下层和杯状细胞完整；模型组可见大量上皮破坏，杯状细胞丢失和隐窝脓肿，大量炎性细胞浸润、充血；栀子提取物进行干预后，溃疡性结肠炎大鼠的腺体结构逐渐恢复正常，隐窝和杯状细胞逐渐增多，炎性细胞浸润程度减弱。表明栀子提取物能够有效改善TNBS诱导的大鼠肠粘膜损伤、炎症细胞浸润。见图3。

3.4对结肠组织中SOD(超氧化物歧化酶)、MDA(丙二醛)的影响

与对照组相比，模型组MDA水平显著升高(P<0.01)，SOD水平显著降低(^##P<0.01)。与模型组相比，SASP组、栀子提取物中、高组的MDA水平显著降低(^**P<0.01)，SOD水平显著升高(^**P<0.01)，但低剂量组的MDA和SOD水平均无显著性差异。结果见表1。

表1栀子提取物对结肠组织中SOD、MDA的影响

实验结果说明，栀子提取物能显著提高SOD活性，降低MDA含量，表明该部位改善结肠损伤的原因可能与其抗氧化作用有一定联系。

3.5对结肠组织中MPO(髓过氧化物酶)、NO(一氧化氮)、IL-1β、IL-6、TNF-α的影响

与对照组相比，模型组MPO、NO、IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(^##P<0.01)。与模型组相比，SASP组、栀子提取物不同剂量组的MPO、NO、IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低(^*P<0.05，^**P<0.01)。结果见表2。

表2栀子提取物对结肠组织中IL-1β、IL-6、TNF-α的影响

实验结果说明，栀子提取物对TNBS诱导的结肠炎起保护作用可能是通过抑制中性粒细胞浸润作用，抑制炎症因子释放，从而起到限制炎症的发生和发展作用。

Claims (3)

1.栀子提取物作为唯一活性成分在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用，其中，所述栀子提取物的制备方法为：以栀子为原料、低碳醇为溶媒进行提取，提取液浓缩成浸膏；所得浸膏经大孔树脂柱层析，用乙醇洗脱，收集35~50v/v%乙醇洗脱部位，回收溶剂，干燥，得到栀子提取物；在栀子提取物的制备方法中，所述的低碳醇为乙醇，低碳醇的浓度为50~90v/v%，所述大孔树脂的型号为HPD600、D101、HP-20或AB-8，所述提取为加热回流提取。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，所述的溃疡性结肠炎为2 ,4 ,6-三硝基苯磺酸诱导的溃疡性结肠炎。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征是，在栀子提取物的制备方法中，所述提取是在50℃至溶媒的沸点温度范围内进行。

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