CN116019880B

CN116019880B - 一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN116019880B
Application number: CN202210101757.4A
Authority: CN
Inventors: 崔龙涛; 张勇; 许家佗; 朱维良; 陈凯先; 屠立平; 马旭翔
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS; Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2022-01-27
Filing date: 2022-01-27
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2042-01-27
Also published as: CN116019880A

Abstract

本申请涉及一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物，它由下述重量配比的原料药制成：栀子4份、薏苡仁2.4份、小蓟2份、蒲公英2份、桑椹2份、黄精2份、丝茅根2份、夏枯草1份、鱼腥草1份。本发明还涉及其制备方法，原料药加水经加热回流提取浓缩得到水提浓缩液，再通过醇沉工艺获得醇上清液和固体沉淀，醇上清液经减压浓缩干燥得到水提醇沉醇上清提取物，固体沉淀干燥得到水提醇沉醇沉淀提取物。本发明制备的中药复方组合物能显著降低肝损所致的血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高，明显降低肝脏损伤程度，改善肝细胞的肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理现象，可开发成为治疗或预防肝脏损伤的药物及产品。

Description

一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及中医药技术领域，尤其是涉及一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物及其制备方法和用途。

背景技术

肝损伤是由多种因素导致肝细胞损伤，进而影响正常肝脏功能。肝损伤按发生因素主要包括化学性肝损伤、药物性肝损伤、酒精性肝损伤、脂肪性肝损伤以及自身免疫性肝损伤；按发生的缓急程度则分为急性肝损伤和慢性肝损伤。肝损伤如不及时治疗，会进一步发展成为肝纤维化、肝硬化、肝衰竭以及肝癌。

目前，通过外周血中生物标志物谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的变化情况来评价肝细胞损伤程度依然是临床上最常用的检测手段。此外，组织病理检查则是肝损伤、肝纤维化临床诊断的“金标准”，通过连续的肝穿刺活检，以及对标本的切片与染色观察，可对肝脏组织炎症、结构、纤维化变化情况做出准确判断。因此，如能开发出相关产品显著降低血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的升高，同时具有抑制肝组织坏死及炎性细胞浸润等作用，从血清学与病理学两方面均证实产品的保肝降酶活性，将具有广阔的市场前景及现实意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物。

本发明的目的之二在于提供一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物的用途。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明的形成是基于这样一个意外发现：由栀子、黄精等多味中药原料药制成的特定配方的中药复方组合物，在动物模型上具有显著的保肝降酶功效。因此，本发明的中药复方组合物可用于制备保肝降酶的药物。

本发明一方面提供了一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物，主要由以下重量配比的原料药制成：栀子3-5份，优选4份、薏苡仁2.2-2.6份，优选2.4份、小蓟1-3份，优选2份、蒲公英1-3份，优选2份、桑椹1-3份，优选2份、黄精1-3份，优选2份、丝茅根1-3份，优选2份、夏枯草0.5-1.5份，优选1份、鱼腥草0.5-1.5份，优选1份。

本发明的中药复方组合物的原料药均可通过商业途径购买获得。

栀子的重量配比典型但非限制性的例如为3、4、5份；

薏苡仁的重量配比典型但非限制性的例如为2.2、2.3、2.4、2.5、2.6份；

小蓟的重量配比典型但非限制性的例如为1、2、3份；

蒲公英的重量配比典型但非限制性的例如为1、2、3份；

桑椹的重量配比典型但非限制性的例如为1、2、3份；

黄精的重量配比典型但非限制性的例如为1、2、3份；

丝茅根的重量配比典型但非限制性的例如为1、2、3份；

夏枯草的重量配比典型但非限制性的例如为0.5、1、1.5份；

鱼腥草的重量配比典型但非限制性的例如为0.5、1、1.5份。

在一些实施方式中，本发明提供的中药复方组合物，主要包括栀子(4份)、薏苡仁(2.4份)、小蓟(2份)、蒲公英(2份)、桑椹(2份)、黄精(2份)、丝茅根(2份)、夏枯草(1份)、鱼腥草(1份)9味药食同源中药，其中栀子为君药，清泻三焦；配以小蓟、蒲公英、夏枯草、鱼腥草、丝茅根增强清热解毒之功；薏苡仁可发挥清热利湿健脾作用；佐以桑椹、黄精发挥益肾补血、滋阴功效，调和清热解毒药物的药性；上述9味药，肝脾肾同调，清热与益气滋阴共用，配伍使用，可最大程度地发挥清热解毒、保肝降酶的效果。

此外，本发明通过高效液相色谱仪对中药复方组合物中主成分进行了分析，同时与复方中每味中药的提取物进行了比较，中药复方组合物主成分主要来源于栀子和黄精两味药材，主成分分别为栀子苷和5-羟甲基糠醛(5-HMF)。其中栀子药材及其主成分栀子苷对肝脏具有双向作用，低浓度具有保肝作用，高浓度则会导致肝脏损伤。本发明提供的中药复方组合物，高、低浓度均能显著改善四氯化碳导致的小鼠肝损伤，高浓度活性更为显著，呈浓度依赖关系，因此本复方的配伍在保肝降酶方面可发挥增效减毒作用。

本发明通过动物体内拆方实验证实，中药复方组合物保肝降酶效果明显优于栀子-黄精中药组合，同时优于栀子苷单体化合物的效果。因此本发明提供的中药复方组合物是在中医理论指导下的创新组合，该复方通过多成分、多靶点可最大程度地发挥复方的保肝降酶活性。

本发明所述的“主要由……制成”，意指原料除所述原料药外，还可以包括其他原料药，除此之外，本发明所述的“主要由”，还可以替换为封闭式的“为”或“由……”等。

本发明的中药复方组合物可用本领域的常规方法制备而成，可以为水提法，例如将栀子、黄精等上述原料药一起加水、浸泡，加热回流提取两次，合并两次滤液，减压浓缩干燥即得水提物。

在一些实施方式中，本发明的中药复方组合物在水提法基础上可以进一步优化，进一步进行醇沉工艺，获得水提醇沉醇上清提取物和水提醇沉醇沉淀提取物，以进一步精制水提液。通过上述工艺优化得到的水提醇沉醇上清提取物，其保肝降酶活性优于水提物。

在一些实施方式中，本发明的药物复方组合物还包括药学上可接受的辅料。

辅料可以为本领域已知的药物辅料，如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联PVP、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)、润滑剂(如硬脂酸镁)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。

对药物复方组合物的剂型不做特别限制，可以制成口服(肠道)制剂，比如片剂、颗粒剂、悬浮液、胶囊、溶液等，也可以制成非肠道给药制剂，比如注射液等。

本发明另一方面提供了一种制备具有保肝降酶作用的中药复方组合物的方法，包括以下步骤：

(1)按照以下重量配比的原料药配料：栀子3-5份，优选4份、薏苡仁2.2-2.6份，优选2.4份、小蓟1-3份，优选2份、蒲公英1-3份，优选2份、桑椹1-3份，优选2份、黄精1-3份，优选2份、丝茅根1-3份，优选2份、夏枯草0.5-1.5份，优选1份、鱼腥草0.5-1.5份，优选1份；

(2)向配好的原料药中加水加热回流提取，浓缩，得到水提浓缩液。

步骤(1)

在该步骤中，原料药同上文所述的中药复方组合物中原料药的描述，在此不再赘述。

步骤(2)

该步骤中，配好的原料药用水提法提取，浓缩。

在一些实施方式中，步骤(2)如下进行：

(2.1)加入5-10倍重量的水，80-100℃加热回流提取，提取0.5-1.5小时后收集滤液；

(2.2)药渣重复步骤(2.1)，合并两次滤液，真空度达-0.08Mpa以上后减压浓缩，得到水提浓缩液。

步骤(2)得到水提浓缩液后可进一步干燥获得水提浓缩液的干浸膏(水提物)。

进一步地，制备具有保肝降酶作用的中药复方组合物的方法还包括：步骤(3)

将步骤(2)的水提浓缩液再通过醇沉工艺获得醇上清液和固体沉淀；

醇上清液经浓缩，干燥，得到水提醇沉醇上清提取物；

固体沉淀干燥得到水提醇沉醇沉淀提取物。

步骤(3)

在水提基础上进一步进行醇沉工艺，获得醇上清液的干燥物(水提醇沉醇上清提取物)和固体沉淀的干燥物(水提醇沉醇沉淀提取物)。

通过步骤(3)得到的醇上清液的干燥物(水提醇沉醇上清提取物)，其保肝降酶活性优于步骤(2)得到的水提浓缩液的干浸膏(水提物)。

在一些实施方式中，步骤(3)如下进行：

向步骤(2)得到的水提浓缩液中加入2-4倍体积的80-100vol％(例如95％)乙醇水溶液，充分搅拌后静置，分离乙醇上清液和固体沉淀；减压浓缩乙醇上清液，冷冻干燥，得到醇上清液的干燥物(水提醇沉醇上清提取物)；固体沉淀干燥，得到固体沉淀的干燥物(水提醇沉醇沉淀提取物)。

在一些实施方式中，具有保肝降酶作用的中药复方组合物的水提物的制备方法如下：

分别按以下剂量称取中药饮片：栀子20g、小蓟10g、蒲公英10g、桑椹10g、黄精10g、夏枯草5g、鱼腥草5g、丝茅根10g、薏苡仁12g，将上述中药饮片置于圆底烧瓶，加入饮片总质量5-10倍量的蒸馏水，浸泡30-40min后，采用加热套80-100℃加热回流提取0.5-1.5h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入5-10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得浓缩液，浓缩液低温冷冻干燥，获得水提物。

在又一些实施方式中，本发明的具有保肝降酶作用的中药复方组合物的水提醇沉醇上清提取物的制备方法如下：

分别按以下剂量称取中药饮片：栀子20g、小蓟10g、蒲公英10g、桑椹10g、黄精10g、夏枯草5g、鱼腥草5g、丝茅根10g、薏苡仁12g，将上述中药饮片置于圆底烧瓶，加入饮片总质量5-10倍量的蒸馏水，浸泡30-40min后，采用加热套80-100℃加热回流提取0.5-1.5h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入5-10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得浓缩液，加入80-100vol％乙醇水溶液450-500ml，混合均匀后置于4℃低温保存12-24小时，分离上清液和固体，上清液减压浓缩后冷冻干燥获得水提醇沉醇上清提取物，固体干燥，得到水提醇沉醇沉淀提取物。

本发明再一方面提供了本发明的具有保肝降酶作用的中药复方组合物或上述方法制备的具有保肝降酶作用的中药复方组合物在制备具有保肝降酶作用的药物中的用途。

本发明又一方面提供了本发明的具有保肝降酶作用的中药复方组合物或上述方法制备的具有保肝降酶作用的中药复方组合物在制备治疗和/或预防肝损伤药物中的应用。

优选地，肝损伤为四氯化碳诱导的肝损伤；

优选地，所述中药复方组合物通过降低血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高，以及抑制肝组织坏死及炎性细胞浸润来治疗和/或预防肝损伤。

本发明的中药复方组合物或上述方法制备的中药复方组合物可以施用于哺乳动物，包括但不限于，人，鼠，马，猪，狗，牛，羊，等等。

本发明通过实验证实，本发明的中药复方组合物具有显著降低四氯化碳诱导的急性肝损伤后血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高，具有抑制四氯化碳诱导的小鼠肝损伤作用；同时，该中药复方组合物具有抑制肝组织坏死及炎性细胞浸润，具有保肝作用。

有益效果

本发明制备得到的中药复方组合物(水提物，醇上清提取物，醇沉淀提取物)能显著降低肝损所致的血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的升高，明显降低肝脏损伤程度，改善肝细胞的肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理现象，可开发成为治疗或预防肝脏损伤的药物及产品。

在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。

除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。

附图说明

图1示出本发明实施例3血清肝功能指标结果，其中A为谷丙转氨酶结果，B为谷草转氨酶结果。

图2示出本发明实施例3病理切片结果。

图3示出本发明实施例4血清肝功能指标结果，其中A为谷丙转氨酶结果，B为谷草转氨酶结果。

图4示出本发明实施例4病理切片结果。

图5示出本发明实施例5的HPLC分析结果。

图6示出本发明实施例6血清肝功能指标结果，其中A为谷丙转氨酶结果，B为谷草转氨酶结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，需要说明的是，提供以下实施例仅出于说明目的并不构成对本发明要求保护范围的限制。

除特殊说明外，在实施例中所采用的原料、试剂、方法等均为本领域常规的原料、试剂、方法。

下列实施例中所使用的材料、试剂与仪器如下：

材料

实验动物：C57BL小鼠，雄性，SPF级，体质量20g±2g，由上海中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(沪)2018-0006。饲养温度：21～24℃，相对湿度：45％～55％，光暗周期12h。标准饲料饲养，自由饮水，取材前23h禁食不禁水。研究中的动物实验操作流程，均通过上海中医药大学伦理委员会的审核。

试剂

主要试剂及材料如下表1中所列出。

表1中药饮片来源

表2相关试剂

纯净水	娃哈哈
		色谱甲醇、色谱乙腈	国药集团化学试剂有限公司
乙醇、四氯化碳(CCl₄)、冰醋酸	国药集团化学试剂有限公司
		奥贝胆酸	上海士锋生物科技有限公司
栀子苷	上海士锋生物科技有限公司
		5-羟甲基糠醛	上海士锋生物科技有限公司
花生油	嘉里粮油(青岛)有限公司

仪器

主要仪器设备如下表3中所列出。

表3

实施例1：水提物样品制备

分别按以下剂量称取中药饮片：栀子20g、小蓟10g、蒲公英10g、桑椹10g、黄精10g、夏枯草5g、鱼腥草5g、丝茅根10g、薏苡仁12g，将上述中药饮片置于5L圆底烧瓶，加入饮片总质量10倍量的蒸馏水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得食源性复方9味浓缩液100ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得水提物(YS-9)(干浸膏)14.5g。

实施例2：水提醇沉醇上清提取物样品制备

分别按以下剂量称取中药饮片：栀子20g、小蓟10g、蒲公英10g、桑椹10g、黄精10g、夏枯草5g、鱼腥草5g、丝茅根10g、薏苡仁12g，将上述中药饮片置于5L圆底烧瓶，加入饮片总质量10倍量的蒸馏水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得食源性复方9味浓缩液150ml，加入95vol％乙醇水溶液450ml，混合均匀后置于4℃低温保存12小时，分离上清液和固体，上清液减压浓缩后冷冻干燥后获得上清液固体样品(YS-SQ)9.8g，固体样品(YS-GT)4.6g，上清液固体样品即为水提醇沉醇上清提取物。

实施例3：中药复方组合物小鼠体内保肝降酶活性评价

试验药物：奥贝胆酸(阳性药)、复方(YS-9)高剂量、复方(YS-9)低剂量。

动物分组与给药：取C57小鼠40只，按体重梯度分成5组，每组8只，分别为正常组、模型组、阳性对照组(30mg/kg)、复方高剂量组(500mg/kg)、复方低剂量组(250mg/kg)，自造模前1周起，按20mL/kg体积分别给予不同剂量药物，灌胃给药，每天1次，连续7d；正常组和模型组给予等量PBS溶液。

动物造模：最后一次给药2h后，除正常组外，其他各组小鼠腹腔注射0.5％CCl₄10mL/kg造模，正常组注射相应体积的花生油，造模完成后禁食不禁水。23h后，把小鼠麻醉后眼球摘除取血，解剖取肝脏。

全自动化分析法检测血清肝功能指标：将血清样本振荡混匀，按标号依次放入全自动生化分析仪样品盘中，分析仪检测试剂盘中加入相应的ALT、AST试剂，按照试剂盒说明书步骤检测小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平。

苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理学变化取正常组、模型组、阳性药组、药物干预组小鼠肝脏组织最大叶，置于4％多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，二甲苯和梯度乙醇对切片进行脱蜡和透明处理，HE染色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，用中性树胶封固，光镜下观察肝脏病理变化。

统计学分析：所有数据采用SPSS20.0软件进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

实验结果：

血清肝功能指标结果如图1所示，其中(A)模型组和正常组血清中谷丙转氨酶具有非常显著差异(****P<0.0001)，证明造模成功；阳性药组(++++P<0.0001)、复方高剂量组(++P<0.01)与模型组比较均能显著改善四氯化碳导致的小鼠血清中谷丙转氨酶的升高；(B)模型组与正常组比较谷草转氨酶水平具有非常显著差异(***P<0.001)，证明造模成功；阳性药组(+++P<0.001)、复方高剂量组(+P<0.05)与模型组比较均能显著改善四氯化碳导致的小鼠血清中谷草转氨酶的升高。

病理切片结果如图2所示，HE病理切片结果显示：正常组肝小叶结构完整清晰，肝索结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状，肝组织未见炎症反应，细胞形态正常；模型组小鼠肝组织出现明显的以中央静脉为中心的出血和变性坏死，可见广泛片状坏死，部分呈现桥接样坏死，肝细胞核溶解消失，周围可见炎性细胞浸润；阳性药组、复方高剂量组均可明显降低肝脏损伤程度，肝细胞排列整齐，明显改善了肝细胞的肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理现象。

结论：

(1)血清肝功能指标分析结果显示，模型组与正常组相比ALT和AST均出现了非常显著的升高，说明造模成功；阳性药奥贝胆酸可显著降低四氯化碳所致小鼠血清中ALT和AST的升高。中药干预组YS-9高、低剂量均能改善四氯化碳所致小鼠血清中ALT和AST的升高，YS-9高剂量组对ALT和AST指标的改善与模型组比较具有显著差异，其效果与复方给药浓度成正相关。

(2)病理切片结果显示，正常组肝小叶结构完整清晰，肝索结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状，肝组织未见炎症反应，细胞形态正常；模型组小鼠肝组织出现明显的以中央静脉为中心的出血和变性坏死，可见广泛片状坏死，部分呈现桥接样坏死，肝细胞核溶解消失，周围可见炎性细胞浸润；阳性药组、复方高剂量组均可明显降低肝脏损伤程度，肝细胞排列整齐，明显改善了肝细胞的肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理现象。

综上，通过小鼠体内肝损伤模型证实，复方高剂量组对四氯化碳所致的小鼠肝损伤具有显著保护作用，能通过降低血清中ALT和AST的升高，从而起到降酶保肝的作用。

实施例4：中药复方提取物小鼠体内保肝降酶活性评价

试验药物：奥贝胆酸(阳性药)、复方组(YS-9)、固体组(YS-GT)、上清高剂量(YS-SQ-H)、上清低剂量(YS-SQ-L)。

动物分组与给药：取C57小鼠56只，按体重梯度分成7组，每组8只，分别为正常组、模型组、阳性对照组(30mg/kg)、YS-9组(480mg/kg)、YS-GT组(480mg/kg)、YS-SQ-H组(480mg/kg)、YS-SQ-L组(160mg/kg)，自造模前1周起，按20mL/kg体积分别给予不同剂量药物，灌胃给药，每天1次，连续7d；正常组和模型组给予等量PBS溶液。

全自动化分析法检测血清肝功能指标：将血清样本振荡混匀，按标号依次放入全自动生化分析仪样品盘中，分析仪检测试剂盘中加入相应的ALT、AST试剂，按照试剂盒说明书步骤检测小鼠血清中ALT、AST水平。

HE染色观察肝组织病理学变化取正常组、模型组、阳性药组、药物干预组小鼠肝脏组织最大叶，置于4％多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片，二甲苯和梯度乙醇对切片进行脱蜡和透明处理，HE染色，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，用中性树胶封固，光镜下观察肝脏病理变化。

统计学分析：所有数据采用SPSS20.0软件进行统计分析，多组间比较采用One-wayANOVA，组间两两比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

实验结果：

血清肝功能指标结果如图3所示，其中，(A)模型组和正常组血清中谷丙转氨酶具有非常显著差异(***P<0.001)，证明造模成功；阳性药组(++++P<0.0001)、复方组(++P<0.01)、上清高剂量组(+++P<0.001)、上清低剂量组(++P<0.01)、固体组(++P<0.01)与模型组比较均能显著改善四氯化碳导致的小鼠血清中谷丙转氨酶的升高；(B)模型组与正常组比较谷草转氨酶水平具有非常显著差异(**P<0.01)，证明造模成功；阳性药组(+++P<0.001)、复方组(+P<0.05)、上清高剂量组(+++P<0.001)、上清低剂量组(++P<0.01)、固体组(+P<0.05)与模型组比较均能显著改善四氯化碳导致的小鼠血清中谷草转氨酶的升高。

病理切片结果如图4所示，HE病理切片结果显示：正常组肝小叶结构完整清晰，肝索结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状，肝组织未见炎症反应，细胞形态正常；模型组小鼠肝组织出现明显的以中央静脉为中心的出血和变性坏死，可见广泛片状坏死，部分呈现桥接样坏死，肝细胞核溶解消失，周围可见炎性细胞浸润；阳性药组、复方组、固体和上清高低剂量组均可明显降低肝脏损伤程度，肝细胞排列整齐，明显改善了肝细胞的肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理现象。

结论：

(1)血清肝功能指标分析结果显示，模型组与正常组相比ALT和AST均出现了非常显著的升高，说明造模成功；阳性药奥贝胆酸可显著降低四氯化碳所致小鼠血清中ALT和AST的升高。复方组、固体和上清高、低剂量组均能显著改善四氯化碳所致小鼠血清中ALT和AST的升高；其中上清高剂量组降酶效果优于复方、固体和上清低剂量组。

(2)病理切片结果显示，正常组肝小叶结构完整清晰，肝索结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状，肝组织未见炎症反应，细胞形态正常；模型组小鼠肝组织出现明显的以中央静脉为中心的出血和变性坏死，可见广泛片状坏死，部分呈现桥接样坏死，肝细胞核溶解消失，周围可见炎性细胞浸润；阳性药组、复方组、固体和上清高低剂量组均可明显降低肝脏损伤程度，肝细胞排列整齐，明显改善了肝细胞的肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理现象。

综上，通过小鼠体内肝损伤模型证实，复方组、固体组和上清高剂量组对四氯化碳所致的小鼠肝损伤均有显著保护作用，其中上清高剂量组效果更为突出，能通过降低血清中ALT和AST的升高，从而起到降酶保肝的作用。

实施例5：中药复方主成分分析

1、单味中药饮片样品准备：

(1)、称取栀子饮片20g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得栀子水提浓缩液20ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得栀子水提物样品(ZZ)。

(2)、称取小蓟饮片10g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得小蓟水提浓缩液10ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得小蓟水提物样品(XJ)。

(3)、称取蒲公英饮片10g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得蒲公英水提浓缩液10ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得蒲公英水提物样品(PGY)。

(4)、称取桑椹饮片10g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得桑椹水提浓缩液10ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得桑椹水提物样品(SS)。

(5)、称取黄精饮片10g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得黄精水提浓缩液10ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得黄精水提物样品(HJ)。

(6)、称取夏枯草饮片5g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得夏枯草水提浓缩液5ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得夏枯草水提物样品(XKC)。

(7)、称取鱼腥草饮片5g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得鱼腥草水提浓缩液5ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得鱼腥草水提物样品(YXC)。

(8)、称取丝茅根饮片10g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得丝茅根水提浓缩液5ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得丝茅根水提物样品(SMG)。

(9)、称取薏苡仁饮片12g至于1L圆底烧瓶，加入10倍重量的水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得薏苡仁水提浓缩液12ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得薏苡仁水提物样品(YYR)

2、复方及单味饮片水提液主成分HPLC分析

(1)分别称取ZZ、XJ、PGY、SS、HJ、XKC、YXC、SMG、YYR中药提取物各10mg，置于2ml容量瓶中，加水定容，充分溶解后取适量采用0.22μm微孔滤膜过滤后得到分析样品。

(2)称取YS-9样品10mg，置于2ml容量瓶中，加水定容，充分溶解后取适量采用0.22μm微孔滤膜过滤后得到复方提取物分析样品。

(3)分别称取栀子苷、5-HMF标准品各1mg，置于2ml容量瓶中，加水定容，充分溶解后取适量采用0.22μm微孔滤膜过滤后分别得到栀子苷和5-HMF标准样品。

(4)上述样品，采用HPLC对其主成分进行分析比对，分析方法如下：

色谱柱：安捷伦ZORBAX SB-C18,5μm；检测波长：190-400nm，优选254nm进行监测；进样量：10μl。

色谱方法：采用色谱甲醇-水(含0.2％冰醋酸)体系，梯度洗脱，洗脱时间35min；0-5min采用5％甲醇-水洗脱，5-8min甲醇浓度5％→15％，8-13min采用15％甲醇-水洗脱，13-15min甲醇浓度15％→20％，15-20min甲醇浓度20％→40％，20-35min甲醇浓度40％→95％。

上述样品通过HPLC分析，同时与化合物标准品进行比对，确认YS-9复方中栀子苷和5-HMF两个单体化合物是复方中主成分，分别来源于栀子、黄精两味中药。同时，通过复方共同煎煮，栀子单味药材中栀子苷类似物(t_R＝22.8min)含量显著减少，栀子苷类似物主要通过与栀子苷的紫外特征吸收峰比较，其具有与栀子苷相同的紫外吸收特征，该现象可能与复方配伍后降低栀子单味药材的苦寒之性有关。具体分析结果如图5所示。

实施例6：中药复方拆方保肝降酶活性评价

1、实验分组：通过采用实施例3的动物体内模型，评价复方组合物(栀子20g、小蓟10g、蒲公英10g、桑椹10g、黄精10g、夏枯草5g、鱼腥草5g、丝茅根10g、薏苡仁12g)、栀子-黄精(栀子20g、黄精10g)、栀子苷高剂量组、栀子苷低剂量组的保肝降酶及抗炎活性。

2、样品制备：

(1)中药组合物样品制备：中药组合物样品制备参考实施例1，获得中药组合物(复方)干浸膏。

(2)栀子-黄精样品制备：称取中药饮片栀子20g、黄精10g，将上述两味中药饮片置于1L圆底烧瓶，加入饮片总质量10倍量的蒸馏水，浸泡30min后，采用加热套100℃加热回流提取1h，趁热过滤，收集滤液，药渣再次加入10倍量的蒸馏水，提取方法如上，合并2次滤液，减压浓缩获得食源性复方栀子-黄精药对的浓缩液50ml，浓缩液低温冷冻干燥，获得栀子-黄精药对样品(ZZ-HJ)。

(3)栀子苷样品：栀子苷样品购于上海士锋生物科技发展有限公司，批号：2020723，规格：800mg。

3、具体实验内容：

(1)动物实验方案设计：取C57小鼠56只，按体重梯度分成7组，每组8只，分别为正常组、模型组、阳性对照组(30mg/kg)、复方组(480mg/kg)、ZZ-HJ组(160mg/kg)、栀子苷高剂量组(60mg/kg)、栀子苷低剂量组(30mg/kg)，自造模前1周起，按20mL/kg体积分别给予不同剂量药物，灌胃给药，每天1次，连续7d；正常组和模型组给予等量PBS溶液。

(2)动物造模：最后一次给药2h后，除正常组外，其他各组小鼠腹腔注射0.5％CCl410mL/kg造模，正常组注射相应体积的花生油，造模完成后禁食不禁水。23h后，把小鼠麻醉后眼球摘除取血，解剖取肝脏。

(3)全自动化分析法检测血清肝功能指标：将血清样本振荡混匀，按标号依次放入全自动生化分析仪样品盘中，分析仪检测试剂盘中加入相应的ALT、AST试剂，按照试剂盒说明书步骤检测小鼠血清中ALT、AST水平。

(4)统计学分析：所有数据采用SPSS20.0软件进行统计分析，多组间比较采用One-way ANOVA，组间两两比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

4、实验结果：

血清肝功能指标结果如图6所示，其中，(A)模型组和正常组血清中谷丙转氨酶具有非常显著差异(****P<0.0001)，证明造模成功；阳性药组(+++P<0.001)、复方组(+P<0.05)与模型组比较均能显著改善四氯化碳导致的小鼠血清中谷丙转氨酶的升高；栀子-黄精组、栀子苷高、低剂量组均未显著改善小鼠血清中谷丙转氨酶的升高；(B)模型组与正常组比较谷草转氨酶水平具有非常显著差异(***P<0.001)，证明造模成功；阳性药组(+++P<0.001)、复方组(++P<0.01)、栀子-黄精组(++P<0.01)、栀子苷低剂量组(+P<0.05)与模型组比较均能显著改善四氯化碳导致的小鼠血清中谷草转氨酶的升高，栀子苷高剂量组未改善小鼠血清中谷草转氨酶的升高。

结论：

血清肝功能指标分析结果显示，模型组与正常组相比ALT和AST均出现了非常显著的升高，说明造模成功；阳性药奥贝胆酸、复方给药组可显著降低四氯化碳所致小鼠血清中ALT和AST的升高。栀子-黄精药物组、栀子苷高、低剂量组均无明显的改善作用。

上述结果证明，复方给药组可显著改善四氯化碳导致的血清中ALT和AST的升高，同时可明显改善肝细胞的肿胀、坏死、炎性细胞浸润等病理现象，复方组通过组方配伍其保肝降酶效果显著优于君药栀子-黄精药对，同时优于栀子苷的效果。

以上各实施例仅用以举例说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：在没有脱离本发明权利要求所限定的精神和实质的范围内，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换仍然在本发明权利要求所限定的范围内。

Claims

1.一种具有保肝降酶作用的中药复方组合物，由以下重量配比的原料药制成：栀子3-5份、薏苡仁2.2-2.6份、小蓟1-3份、蒲公英1-3份、桑椹1-3份、黄精1-3份、丝茅根1-3份、夏枯草0.5-1.5份、鱼腥草0.5-1.5份。

2.根据权利要求1所述的中药复方组合物，其特征在于，由以下重量配比的原料药制成：栀子4份、薏苡仁2.4份、小蓟2份、蒲公英2份、桑椹2份、黄精2份、丝茅根2份、夏枯草1份、鱼腥草1份。

3.根据权利要求1所述的中药复方组合物，其特征在于，所述中药复方组合物还包括药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求3所述的中药复方组合物，其特征在于，所述辅料包括选自粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的中药复方组合物，其特征在于，所述中药复方组合物为肠道给药制剂或非肠道给药制剂。

6.根据权利要求5所述的中药复方组合物，其特征在于，所述肠道给药制剂包括片剂、颗粒剂、悬浮液、胶囊或口服液，所述非肠道给药制剂包括注射液。

7.一种制备权利要求1或2所述的具有保肝降酶作用的中药复方组合物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）按照重量配比的原料药配料；

（2）向配好的原料药中加水加热回流提取，浓缩，得到水提浓缩液。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤（2）包括：

（2.1）加入5-10倍重量的水，80-100℃加热回流提取，提取0.5-1.5小时后收集滤液；

（2.2）药渣重复步骤（2.1），合并两次滤液，减压浓缩，得到水提浓缩液。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）还包括：

（2.3）将步骤（2.2）的水提浓缩液干燥，得到水提物。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

步骤（3）：将步骤（2）的水提浓缩液再通过醇沉工艺获得醇上清液和固体沉淀；

醇上清液经浓缩，干燥，得到水提醇沉醇上清提取物；

固体沉淀干燥得到水提醇沉醇沉淀提取物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤（3）包括：

水提浓缩液加入2-4倍体积的80-100vol%乙醇水溶液，充分搅拌后静置，分离乙醇上清液，减压浓缩乙醇上清液，冷冻干燥，得到水提醇沉醇上清提取物。

12.根据权利要求1-6任一项所述的具有保肝降酶作用的中药复方组合物或根据权利要求7-11任一项所述的方法制备的具有保肝降酶作用的中药复方组合物在制备治疗和/或预防肝损伤药物中的应用。

13.根据权利要求1-6任一项所述的具有保肝降酶作用的中药复方组合物或根据权利要求7-11任一项所述的方法制备的具有保肝降酶作用的中药复方组合物在制备具有保肝降酶作用的药物中的应用，其中，所述酶为谷丙转氨酶和谷草转氨酶。