CN111991525B - 一种四妙丸的有效成分组及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种四妙丸的有效成分组及其制备方法和该成分组在预防和治疗糖尿病中的应用，该有效成分组主要包括组分1和组分2，所述组分1为分子量在300‑10 KDa的多糖类物质，所述组分2为生物碱类成分；按重量百分比计，分子量在300‑10 KDa的多糖类物质40‑70%，生物碱类大于15%；采用膜分离结合大孔树脂获得有效成分组，该有效成分组在制备预防和/或治疗糖尿病相关疾病的药物中皆可应用。本发明制备得到产品由组分1及组分2两部分组成，两部分具有显著协同效应，可以多组分多靶点发挥降糖作用，具有广泛的应用价值。

Description

一种四妙丸的有效成分组及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于中药制备及应用领域，具体涉及一种四妙丸的有效成分组及其制备方法和该成分组在预防和治疗糖尿病中的应用。
背景技术
糖尿病是一种以慢性血糖增高为特征，并伴有脂肪、蛋白质等物质代谢异常的一类代谢疾病，其中2型糖尿病(T2DM)占群体的大多数。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，糖尿病的发病率日益增高，已成为全球性严重公共卫生问题。由于遗传、自身免疫、环境等多种因素所导致的靶器官胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)、胰腺胰岛素分泌功能减退及肝葡萄糖生成过度等病理事件的发生及发展是糖尿病主要的发病机制。目前，在饮食治疗和运动治疗的基础上，临床上主要依赖于口服降糖药和胰岛素治疗，口服药物有硫脲类(促进胰腺细胞分泌胰岛素)、甲福明(降低肝糖输出)、PPARγ激动剂如噻唑烷二酮类(增加胰岛素敏感性)、α-糖苷酶抑制剂(抑制小肠对单糖的吸收)、GLP-1类似物或DPP-Ⅳ抑制剂等。然而，这些口服降糖药物疗效有限而且有明显的副作用。因此，寻找效果好、副作用小、预防或治疗糖尿病的药物是目前临床上亟待解决的问题。
四妙丸源于《成方便读》，由黄柏、苍术、牛膝、薏苡仁组成，是治疗湿热痿证的经典名方，具有清热祛湿，解毒消肿，化瘀止痛的功效。其中，苍术苦温而能燥湿；黄柏苦寒，入下焦而祛湿热毒邪；牛膝活血化瘀通络，且能补肝肾强筋骨；薏苡仁祛湿热而利筋络。目前该方用于湿热下注所致的痹病，症见足膝红肿，筋骨疼痛。黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinense Schneid.的干燥树皮，主要含有生物碱类成分，如小檗碱、木兰花碱、黄柏碱等；苍术为菊科植物茅苍术Atractylodes lancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodes chinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎，主要含挥发油(如苍术酮、茅术醇、榄香醇等)类及多糖类成分；牛膝为苋科植物牛膝Achyranthes bidentata Bl.的干燥根，主要含有三萜皂苷、蜕皮甾酮及多糖类成分。薏苡仁为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁，主要含挥发油类成分及多糖类成分。由此可见，四妙丸中所含化学成分复杂，既包含挥发油、生物碱等小分子化合物，又包含多糖等大分子物质。我们采用膜分离联合大孔树脂技术，制备得到了四妙丸中的有效物质组。迄今为止，未见到该有效物质组的分离制备方法及治疗糖尿病的应用报道。
发明内容
针对现有问题的不足，本发明的第一个目的是提供一种四妙丸的有效成分组；本发明的第二个目的是提供一种四妙丸的有效成分组的制备方法，本发明的第三个目的是提供上述有效成分组在预防和治疗糖尿病中的应用；本发明制备得到产品由组分1及组分2两部分组成，两部分具有显著协同效应，组分1能抑制胰脂肪酶(PTL)活性，从而抑制外源性脂肪的吸收；组分2能改善肝细胞的糖摄取，减少脂肪细胞的脂解。因而，该产品中多组分多靶点发挥降糖作用，具有广泛的应用价值。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种四妙丸的有效成分组，包括组分1和组分2，所述组分1为分子量在300-10KDa的多糖类物质，所述组分2为生物碱类成分；按重量百分比计，分子量在300-10KDa的多糖类物质40-70％，生物碱类大于15％。
一种四妙丸的有效成分组的制备方法，采用膜分离联合大孔树脂分离出300-10KDa的多糖类物质和生物碱类，并进行复合即可。
作为本申请的优选技术方案，所述制备方法包括如下具体步骤：
(1)药材提取：首先按照质量比1：2混合苍术和薏苡仁药材、润透、加溶剂加热回流提取2h，趁热过滤，弃去提取液；药渣与另外两味药材牛膝和黄柏(质量比1:2)用水加热回流提取2h后，过滤，取上清液，即得四妙丸提取液原液；
(2)微滤：将步骤(1)中所得的原液经过压力泵注入微滤系统，去除溶液中的大分子物质，得到透过液；
(3)一级膜分离：将步骤(2)中所得透过液经压力泵输入超滤系统，通过300KDa膜的液体为300KDa透过液；
(4)二级膜分离：将步骤(3)中所得300KDa透过液经压力泵输入超滤系统，通过10KDa膜的液体为10KDa透过液；不能通过10KDa膜的液体为截留液，即为组分1(分子量在300-10KDa之间的多糖组分)；
(5)大孔树脂富集：将步骤(4)的透过液部分，过大孔树脂，吸附12h后，依次经过水、30％乙醇和60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱，即得组分2(生物碱部分)；
(6)浓缩干燥：将步骤(4)得到的组分1与步骤(5)中得到的组分2合并，减压浓缩，干燥，即得产品。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(1)中，料液重量比1：10～40；所用溶剂为乙醇或甲醇溶液。
优选的，所述步骤(1)中，用水加热回流后，调节pH值为6-8，再离心得上清液，即得四妙丸提取液原液。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(2)中，微滤膜为有机微滤膜或者无机陶瓷、金属滤膜中的任一种，孔径为0.2～0.45μm，输入压力为0.05～0.2MPa。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(3)和步骤(4)中，膜组件材料为无机陶瓷、金属滤膜或有机滤膜。
优选的，所述膜组件材料选自聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)、聚砜(PS)或聚丙稀腈(PAN)中的任一种或多种。
优选的，所述步骤(3)中超滤系统的输入压力为0.05～0.2MPa，截留体积为原溶液总体积的1/5～4/5。
更优选的，截留体积为原溶液总体积的3/5。
优选的，所述步骤(4)中超滤系统的输入压力为0.15～0.3MPa，截留体积为原溶液总体积的1/5～4/5。
更优选的，截留体积为原溶液总体积的1/2。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(5)中，大孔吸附树脂选自HPD-100、D101或AB-8中的任一种。
作为本申请的优选技术方案，所述步骤(6)中减压浓缩温度为40～60℃。
优选的，所述步骤(6)中干燥方式为真空干燥或冷冻干燥。
本发明还保护上述四妙丸的有效成分组在制备预防和/或治疗糖尿病相关疾病的药物中的应用。
本发明得到的有效成分组可以显著改善口服糖耐量及胰岛素耐量，降低甘油三酯及游离脂肪酸，因此，本发明进一步提供所述有效成分组在制备抗糖尿病药物中的用途。
根据本发明的实施方案，所述药物可以制成适当的药物制剂形式，可口服或肠胃外施用。适于口服给药的药物制剂，例如固体口服制剂包括片剂、包衣剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、丸剂、粉剂等，或液体口服制剂包括溶液剂、糖浆剂、混悬剂、乳液剂等。适于肠胃外给药的药物制剂，例如静脉滴注制剂，肌肉或皮下注射制剂，经直肠给药的栓剂，经鼻内给药的吸入制剂，或局部给药的透皮贴剂形式。配方可制成适于活性成分的快速释放、延迟释放或调节释放的形式。
有益效果
本发明提供的一种四妙丸的有效成分组及其制备方法和应用，与现有技术相比，具有以下有益效果：(1)本发明的制备方法为条件温和、高效、环保的膜分离和大孔树脂相结合的方式，该方法可以根据分子量将总提物进行分段，具有很强的推广应用价值；(2)本发明制备得到产品由组分1及组分2两部分组成，两部分具有显著协同效应，组分1能抑制胰脂肪酶(PTL)活性，从而抑制外源性脂肪的吸收；组分2能改善肝细胞的糖摄取，减少脂肪细胞的脂解。因而，该产品中多组分多靶点发挥降糖作用，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例4中所得产品的色谱图(A：组分1色谱图；B：组分2色谱图)。
图2为本发明实施例5、6中不同组分对口服糖耐量(A)及丙酮酸耐量(B)的影响。
图3为本发明实施例7、8中组分1、组分2及两者联用对口服糖耐量(A)及丙酮酸耐量(B)的影响。
图4为本发明实施例9、10、11中组分1体外对PTL活性的影响(A)，组分2对脂肪细胞脂解作用(B)和对肝细胞葡萄糖消耗(C)的影响。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
实施例1四妙丸有效成分组的制备
(1)按照质量比1：2比例混合苍术和薏苡仁药材饮片，用10倍量乙醇加热回流提取2h，趁热过滤，乙醇液减压浓缩得到挥发油部位；药渣与另外两味药材牛膝和黄柏(质量比1：2)用30倍水加热回流提取2h后，调节pH为8，12000rpm离心10min得上清液，即得四妙丸提取液原液；
(2)将原液过0.22μm微滤系统；
(3)将得到的透过液过300K Da超滤膜，压力为0.15MPa，超滤至截留体积为原溶液的60％，得到300K Da截留液部位；
(4)将相对分子质量小于300KDa的透过液过10K Da超滤膜，压力为0.15Mpa，超滤至截留体积为原溶液的50％，得到10K截留液部位(即组分1)和10K透过液部位；
(5)将10K透过液部分，过AB-8型大孔树脂，吸附12h后，依次经过3BV水、2BV 30％乙醇和4BV 60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液(即组分2)；
(6)合并10K截留液及60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，干燥，即得产品。产品中多糖的含量为47.6％，生物碱的含量为21.7％。
实施例2四妙丸有效成分组的制备
(1)按照质量比1：2比例混合苍术和薏苡仁药材饮片，用10倍量乙醇加热回流提取2h，趁热过滤，乙醇液减压浓缩得到挥发油部位；药渣与另外两味药材牛膝和黄柏(质量比1：2)用40倍水加热回流提取2h后，调节pH为6，12000rpm离心10min得上清液，即得四妙丸提取液原液；
(2)将原液过0.22μm微滤系统；
(3)将得到的透过液过300K Da超滤膜，压力为0.05MPa，超滤至截留体积为原溶液的60％，得到300K截留液部位；
(4)将相对分子质量小于300KDa的透过液过10KDa超滤膜，压力为0.2MPa，超滤至截留体积为原溶液的50％，得到10K截留液部位(即组分1)和10K透过液部位；
(5)将10KDa透过液部分，过D101型大孔树脂，吸附12h后，依次经过3BV水、2BV30％乙醇和4BV 60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液(即组分2)；
(6)合并10KDa截留液及60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，干燥，即得产品。产品中多糖的含量为61.0％，生物碱的含量为10.6％。
实施例3四妙丸有效成分组的制备
(1)按照质量比1：2比例混合苍术和薏苡仁药材饮片，用10倍量乙醇加热回流提取2h，趁热过滤，乙醇液减压浓缩得到挥发油部位；药渣与另外两味药材牛膝和黄柏(质量比1：2)用20倍水加热回流提取2h后，调节pH为8，12000rpm离心10min得上清液，即得四妙丸提取液原液；
(2)将原液过0.22μm微滤系统；
(3)将得到的透过液过300K Da超滤膜，压力为0.2MPa，超滤至截留体积为原溶液的60％，得到300K截留液部位；
(4)将相对分子质量小于300K Da的透过液过10K Da超滤膜，压力为0.3MPa，超滤至截留体积为原溶液的50％，得到10K截留液部位(即组分1)和10K透过液部位；
(5)将10KDa透过液部分，过HPD100型大孔树脂，吸附12h后，依次经过3BV水、2BV30％乙醇和4BV 60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液(即组分2)；
(6)合并10KDa截留液及60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，干燥，即得产品。产品中多糖的含量为57.3％，生物碱的含量为13.9％。
实施例4所得产品中化学成分分析
4.1组分1的化学成分分析
色谱条件：Agilent 1100高效液相色谱仪；流动相：蒸馏水；色谱柱：TSKgelG4000PWXL；检测器：ELSD；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；进样量：10uL；
如图1(A)所示为组分1的液相图，已知标准单糖80kDa、270KDa在相同条件下的峰保留时间为别为：18.365min、15.967min；根据已有的标准单糖绘制标准曲线，算得10KDa分子量截留液在15-20min内所出峰，对应的多糖分子量范围在为300-10KDa之间。
4.2组分2的化学成分分析
色谱条件：Agilent 1290Infinity II系统；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100×2.1mm，1.7μm)；流动相：A相(0.1％甲酸水，v/v)，B相(乙腈，v/v)；柱温30℃；流速0.3mL/min；进样体积2μL。流动相洗脱梯度：0～15min，5％～35％(B)；15～30min，35％～50％(B)；30～45min，50％～70％(B)；45～47min，70～85％(B)；47～55min，85％～95％(B)；55～58min，95％～100％(B)；58～60min，100％(B)。
质谱条件：检测器：6545Q-TOF MS，Agilent Technologies；离子源：Dual AJS；电离方式：ESI，分别采集正负、离子模式下的样品信息；脱溶剂气温度：320℃；脱溶剂气流速，8L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min；毛细管电压：3500V；裂解电压：120V；碰撞能量：10/30/50eV；锥孔电压：65V；参比：m/z 121.0509，922.0098(pos.)，119.0363，1033.9881(neg.)。质量扫描范围：50-1550m/z。
组分2的UHPLC-Q-QTOF MS/MS正负离子模式下TIC图如图1(B)所示，鉴定出生物碱类成分如表1所示。
表1组分2中的化合物信息
Figure BDA0002663024760000071
Figure BDA0002663024760000081
实施例5本发明中所得组分1及组分2改善口服糖耐量的作用
5.1实验动物
SPF级C57BL/6J雄性小鼠80只，体重18-22g，6-7周龄，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于中国药科大学SPF级动物实验中心。饲养条件：湿度50-60％，温度22-24℃，12h光照/黑暗循环采光环境，自由饮水。动物饲养及处理均按照江苏省《实验动物管理条例》进行。
5.2药物配制
称取二甲双胍及四妙丸各分离部位浸膏溶于3％泊洛沙姆中，超声溶解，使最终动物给药浓度为阳性对照组(二甲双胍，200mg/kg)、总提物组(2129.3mg/kg)、挥发油组(332.9mg/kg)、300KDa截留液组(983.38mg/kg)、组分1组(10KDa截留液，247.78mg/kg)、组分2组(生物碱，181.28mg/kg)。以上四妙丸给药组均等同于生药量7743.16mg/kg(挥发油组和300KDa截留液组为制备工艺中去除的成分)。
5.3糖耐量实验
动物禁食不禁水16h，给药2h后，除空白组给生理盐水外，其余组灌胃给葡萄糖溶液(2g/kg)，分别于0、30、60、90、120min测定血糖值，用酒精棉片擦拭尾尖，消毒剪刀剪尾尖，取1滴尾尖血于试纸上测量并记录血糖值。并以时间为横轴，血糖浓度为纵坐标，做不同处理组小鼠的血糖浓度变化曲线，并量化计算曲线下面积(AUC)。
5.4数据分析方法
采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析处理，实验数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用单因素方差分析法进行统计学分析。*P＜0.05则组间差异具有统计学意义，**P＜0.01。
血糖下降率＝(模型组血糖-给药组血糖)/(模型组血糖-空白组血糖)*100％
5.5实验结果
空白组小鼠血糖值变化较为平稳，模型组小鼠在给葡萄糖溶液后血糖值显著升高，30min时达到峰值，之后缓慢降低，模型组较空白组AUC明显增大；给药组小鼠在给葡萄糖溶液后，峰值均有不同程度的降低。通过比较各组曲线下面积(AUC)，如图2(A)及表2所示，组分1(10K截留液组)和组分2(生物碱组)的血糖下降率分别为40.9％和38.1％。挥发油组及300K截留液组为本工艺中去除掉的组分，挥发油组及300KDa截留液两组虽也能降低AUC，但效果不及组分1和组分2，该实验证明了本方法保留组分1和组分2作为最终产品的合理性。
实施例6本发明中所得组分1及组分2改善丙酮酸耐量的作用
6.1实验动物
同5.1。
6.2药物配制
同5.2。
6.3丙酮酸耐量实验
动物禁食不禁水16h，给药2h后，除空白组给生理盐水外，其余组腹腔注射丙酮酸溶液(2g/kg)，分别于0、30、60、90、120min测定血糖值，用酒精棉片擦拭尾尖，消毒剪刀剪尾尖，取1滴尾尖血于试纸上测量并记录血糖值。并以时间为横轴，血糖浓度为纵坐标，做不同处理组小鼠的血糖浓度变化曲线，并量化计算曲线下面积(AUC)。
6.4数据分析方法
同5.4。
6.5实验结果
空白组小鼠血糖值变化较为平稳，模型组小鼠在给丙酮酸溶液后血糖值显著升高，AUC明显增大，表明糖异生增加；给药组小鼠在给丙酮酸后，峰值均有不同程度的降低。通过比较各组曲线下面积(AUC)，如图2(B)及表2所示，组分1(10K截留液组)和组分2(生物碱组)的血糖下降率分别为50.0％和42.2％。挥发油组及300K截留液组为本工艺中去除掉的组分，挥发油组没有改善糖异生的作用，300K截留液组虽也能降低AUC，但效果不及组分1和组分2，该实验证明了该工艺以保留组分1和组分2作为最终产品的合理性。
表2不同组分对口服糖耐量及丙酮酸耐量的影响
Figure BDA0002663024760000101
实施例7产品(组分1与组分2联合应用)对口服糖耐量的改善作用
7.1实验动物
同5.1。
7.2药物配制
称取二甲双胍及四妙丸各分离部位浸膏溶于3％泊洛沙姆中，超声溶解，使最终动物给药浓度为阳性对照组(二甲双胍，200mg/kg)、总提物组(2129.3mg/kg)、组分1组(10K截留液，247.78mg/kg)、组分2组(生物碱，181.28mg/kg)、组分1+组分2高剂量组(组分1：247.78mg/kg+组分2：181.28mg/kg)、组分1+组分2低剂量组(组分1：123.89mg/kg+组分2：90.64mg/kg)。
7.3口服糖耐量实验
同5.3。
7.4数据分析方法
同5.4。
联合指数(combined index，CI)计算方法：采用金正均法进行判定，CI值由以下的公式求得：CI＝Ea+b/(Ea+Eb-Ea×Eb)。式中Ea、Eb和Ea+b分别是a药组、b药组和两药联用组的降糖率。CI<1说明两药联用后产生拮抗作用；CI＝1，说明两药联用后产生相加作用；CI>1，说明两药联用后产生协同作用。
7.5实验结果
空白组小鼠血糖值变化较为平稳，模型组小鼠在给葡萄糖溶液后血糖值显著升高，30min时达到峰值，之后缓慢降低，模型组较空白组AUC明显增大；给药组小鼠在给葡萄糖溶液后，峰值均有不同程度的降低。通过比较各组曲线下面积(AUC)，如图3(A)及表3所示，组分1(10K截留液组)和组分2(生物碱组)联用后血糖下降率显著提高，联合指数为1.18，表明两种成分之间具有显著的协同作用。
实施例8产品(组分1与组分2联合应用)对丙酮酸耐量的改善作用
8.1实验动物
同5.1。
8.2药物配制
同7.2。
8.3丙酮酸耐量实验
同6.3。
8.4数据分析方法
同7.4。
8.5实验结果
空白组小鼠血糖值变化较为平稳，模型组小鼠在给丙酮酸溶液后血糖值显著升高，AUC明显增大，表明糖异生增加；给药组小鼠在给丙酮酸后，峰值均有不同程度的降低。通过比较各组曲线下面积(AUC)，如图3(B)及表3所示，组分1(10K截留液组)和组分2(生物碱组)联用后血糖下降率显著提高，联合指数为1.09，表明两种成分之间具有显著的协同作用。
表3组分1、组分2及两者联用对口服糖耐量及丙酮酸耐量的影响
Figure BDA0002663024760000111
Figure BDA0002663024760000121
实施例9组分1对胰脂肪酶(PTL)活性的抑制作用
9.1药物配制
将奥利司他和组分1溶于DMSO中，超声溶解，使药物浓度分别为250mg/mL和10mg/mL。用水分别稀释为100、50、25、10、1mg/mL和100、50、10、5、0.25、0.1μg/mL。
9.2脂质乳剂配制
将5mL橄榄油和10mL1％吐温-20混合，超声10min制备脂质乳剂。用0.1mol/LTris-HCl缓冲溶液(pH 8.4)将脂质乳剂稀释4倍，得到脂质乳剂稀释液。
9.3体外测PTL活性
将50μL不同浓度的奥利司他和组分1与20μL胰脂肪酶(1mg/mL)预孵育10min，再加50μL脂肪酶底物即脂质稀释乳剂，在37℃下孵育10min后，根据脂肪酶活性试剂盒说明书测定脂肪酶活性。
9.4数据分析方法
采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析处理，实验数据用平均值±标准差(Mean±SD)表示，采用单因素方差分析法进行统计学分析。*P＜0.05则组间差异具有统计学意义，**P＜0.01。
9.5实验结果
如图4(A)和表4所示，阳性药奥利司他和组分1均不同程度地抑制了胰脂肪酶活性。组分1的浓度和胰脂肪酶活性呈线性相关，线性方程为Y＝-0.4152X+113.3(R2＝0.9755)，阳性药奥利司他与胰脂肪酶活性线性关系为Y＝-1096X+110.1(R2＝0.9831)，其中组分1的IC50值为107.2mg/mL，奥利司他IC50值为0.02821mg/mL。实施例7及实施例8证明了产品(组分1及组分2)的联合增效作用，但两者之间具有联合增效的原因尚不清楚。考虑到组分1为多糖类大分子，无法被人体吸收进入血液或细胞，因此主要在肠道发挥作用。PTL酶为肠道中调控脂肪吸收的关键酶，该实验证明了组分1能调节PTL酶的活性，进而抑制脂肪的吸收，发挥降血糖的功效。
表4组分1和奥利司他体外对胰脂肪酶活性的影响
Figure BDA0002663024760000131
实施例10组分2对脂肪细胞脂解的作用
10.1药物配制
二甲双胍：称取82.8mg二甲双胍，加入1mL DMSO溶液配成0.5M二甲双胍母液，临用前用培养基稀释，使得细胞培养液中二甲双胍终浓度为0.5mM。
组分2：称取适量生物碱部位提取物溶于DMSO溶液中使其浓度为100mg/mL(生药量)，临用前用培养基稀释，使得细胞培养液中组分2终浓度为200μg/mL(高剂量)、100μg/mL(中剂量)、50μg/mL(低剂量)。
10.2脂肪细胞培养及诱导分化
3T3-L1前脂肪细胞培养于10％FBS的高糖DMEM培养基，接种于细胞培养瓶中。当细胞状态良好且细胞密度融合到70％左右时，更换含有0.5mM IBMX、1μM地塞米松、10μg/mL胰岛素和10％FBS的高糖DMEM培养基诱导分化液1，培养48h后，更换只含有10μg/mL胰岛素和10％FBS的高糖DMEM培养基诱导分化液2，培养48h后，换用正常10％FBS的高糖DMEM培养基培养，两天换一次液，待细胞分化8-12天后，细胞呈成熟脂肪细胞表型时，即可用于后续实验。
10.3棕榈酸(PA)刺激脂肪细胞脂解水平的测定
选择分化状态良好的3T3-L1脂肪细胞均匀的接种在六孔板中，分为空白组、模型组(PA 150μM)、阳性药组(PA+二甲双胍0.5mM)、组分2高剂量组(PA+生物碱200μg/mL)、组分2中剂量组(PA+生物碱100μg/mL)、组分2低剂量组(PA+生物碱50μg/mL)，按分组给予刺激和药物处理12h后，换无酚红DMEM培养基继续孵育24h，收集上清，按照甘油测定试剂盒说明书方法测定甘油含量。
10.4数据分析方法
同7.4。
10.5实验结果
如图4(B)所示，PA造模后模型组细胞释放甘油量显著增高，给药后抑制甘油释放，且呈剂量依赖，表明组分2对脂肪细胞脂解有抑制作用。与组分1不同，组分2主要是小分子化合物，可在人体中以原型或代谢产物的形式发挥作用，该实验证明了组分2可以通过抑制脂肪细胞脂解发挥降血糖作用。
实施例11组分2对肝细胞葡萄糖消耗的影响
11.1药物配制
二甲双胍：称取82.8mg二甲双胍，加入1mL DMSO溶液配成0.5M二甲双胍母液，临用前用培养基稀释，使得细胞培养液中二甲双胍终浓度为1mM。
组分2：称取适量生物碱部位提取物溶于DMSO溶液中使其浓度为100mg/mL(生药量)，临用前用培养基稀释，使得细胞培养液中组分2终浓度为100μg/mL。
11.2细胞培养与PA造模
HepG2细胞用10％FBS的DMEM培养基接种于细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养。HepG2细胞分为空白组、模型组(PA 250μM)、阳性药组(PA+二甲双胍1mM)、组分2给药组(PA+生物碱100μg/mL).当细胞状态良好且细胞密度融合到70％左右时，接种到六孔板中，待细胞生长至密度约为70％左右，换新鲜培养基，除空白组用低糖DMEM培养基外，其余组均换高糖DMEM培养基，按分组给予刺激和药物处理24h。
11.3 2-NBDG葡萄糖摄取实验
细胞造模给药后，用PBS洗三次，每孔加入含100nM胰岛素和50uM2-NBDG的PBS，孵箱中孵育1小时后，吸掉上清，用预冷的PBS洗三次，于倒置显微镜下拍照。
11.4数据分析方法
同7.4。
11.5实验结果
如图4C所示，与空白组相比，模型组的荧光强度显著下降，表明PA使肝细胞摄取葡萄糖的能力降低；组分2及阳性药干预后，荧光强度明显强于模型组，证明组分2可显著改善肝细胞糖摄取能力。与组分1不同，组分2主要是小分子化合物，可在人体中以原型或代谢产物的形式发挥作用，该实验证明了组分2可以通过改善肝细胞糖摄取能力发挥降血糖作用。因此，实施实例9,10,11证明了组分1通过抑制PTL酶的活性发挥作用，而组分2通过抑制脂肪细胞脂解及改善肝糖摄取发挥作用。组分1和组分2两者联合用药时，能通过多靶点发挥增效作用。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (10)

1.一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，由组分1和组分2组成，所述组分1为分子量在300-10 KDa的多糖类物质，所述组分2为生物碱类成分；按重量百分比计，分子量在300-10 KDa的多糖类物质40-70%，生物碱类大于15%；所述四妙丸的有效成分组合物用于制备预防和/或治疗糖尿病的药物中；
所述四妙丸的有效成分组合物的制备方法如下：提取四妙丸原液后，采用膜分离联合大孔树脂分离出300-10 KDa的多糖类物质和生物碱类，并进行复合；具体包括如下步骤：
（1）药材提取：首先按照质量比1：2混合苍术和薏苡仁药材、润透、加溶剂加热回流提取，趁热过滤，弃去提取液；药渣与另外两味药材牛膝和黄柏用水加热回流提取后，过滤，取上清液，即得四妙丸提取液原液；
（2）微滤：将步骤（1）中所得的原液经过压力泵注入微滤系统，去除溶液中的大分子物质，得到透过液；
（3）一级膜分离：将步骤（2）中所得透过液经压力泵输入超滤系统，通过300KDa膜的液体为300 KDa透过液；
（4）二级膜分离：将步骤（3）中所得300 KDa透过液经压力泵输入超滤系统，通过10 KDa膜的液体为10 KDa透过液；不能通过10 KDa膜的液体为截留液，即为组分1；
（5）大孔树脂富集：将步骤（4）的透过液部分，过大孔树脂，吸附12 h后，依次经过水、30%乙醇和60%乙醇洗脱，收集60%乙醇洗脱，即得组分2；
（6）浓缩干燥：将步骤（4）得到的组分1与步骤（5）中得到的组分2合并，减压浓缩，干燥，即得产品。
2.根据权利要求1所述的一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，所述步骤（1）中，料液重量比1：10～40；所用溶剂为乙醇或甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，所述步骤（2）中，微滤膜为有机微滤膜或者无机陶瓷、金属滤膜中的任一种，孔径为0.2～0.45 μm，输入压力为0.05～0.2 MPa。
4.根据权利要求1所述的一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中，膜组件材料为无机陶瓷、金属滤膜或有机滤膜。
5.根据权利要求4所述的一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，所述膜组件材料选自聚偏氟乙烯、聚醚砜、聚丙烯、聚乙烯、聚砜或聚丙烯腈中的任一种或多种。
6.根据权利要求3-5任一所述的一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，所述步骤（3）中超滤系统的输入压力为0.05～0.2 MPa，截留体积为原溶液总体积的1/5～4/5。
7.根据权利要求6所述的一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，所述步骤（4）中超滤系统的输入压力为0.15～0.3MPa，截留体积为原溶液总体积的1/5～4/5。
8.根据权利要求 2所述的一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，所述步骤（5）中，大孔吸附树脂选自HPD-100、D101或AB-8中的任一种。
9.根据权利要求3所述的一种四妙丸的有效成分组合物，其特征在于，所述步骤（6）中减压浓缩温度为40～60 ℃。
10.权利要求1所述的一种四妙丸的有效成分组合物在制备预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用。
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