KR101090319B1

KR101090319B1 - 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR101090319B1
Application number: KR1020090026466A
Authority: KR
Inventors: 유 선 정; 철 기 박
Original assignee: 유 선 정
Priority date: 2009-03-27
Filing date: 2009-03-27
Publication date: 2011-12-07
Also published as: KR20100108031A

Abstract

본 발명은 만삼, 단삼, 반하, 황련, 오수유, 음양곽, 대황, 소엽, 감초, 인진, 택사, 백복령, 백출, 저령 및 계지로 이루어진 한약재의 혼합 추출물을 포함하는 당뇨병의 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 상기 약제학적 조성물을 사용함으로 인해, 혈당의 증가 및 인슐린 농도의 감소 등과 같은 일차적인 당뇨병의 증상 뿐만 아니라, 신부전, 부종, 족부괴저, 백내장, 녹내장, 대혈관 합병증인 관상동맥 질환이나 뇌졸중, 당뇨병성 신경병증 등과 같은 이차적인 당뇨합병증을 예방 및 치료할 수 있게 된다.

만삼, 단삼, 반하, 황련, 오수유, 음양곽, 대황, 소엽, 감초, 인진, 택사, 백복령, 백출, 저령, 계지, 당뇨병, 합병증

Description

당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물{A composition having an effect of curing and preventing diabetes mellitus}

본 발명은 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 만삼, 단삼, 반하, 황련, 오수유, 음양곽, 대황, 소엽, 감초, 인진, 택사, 백복령, 백출, 저령 및 계지로 이루어진 한약재의 혼합 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

당뇨병(糖尿病)은 혈액 내에 존재하는 포도당이 소변을 통해 배출되는 질환으로써 현대인에게 가장 많이 발생되는 비전염성 만성질환이자 근본적인 치유가 되지 않는 만성 퇴행성 질환 중의 하나이며, 인슐린 작용과 인슐린 분비에 의해 발생하는 고혈당을 특징으로 하는 대사장애 증후군으로써 자가면역기전에 의해서 췌장의 베타세포가 파괴되면서 인슐린이 절대적으로 부족하게 되는 것에서부터 인슐린의 작용에 대한 저항성에 이르기까지 다양한 원인으로 발병하게 된다.

이러한 당뇨병은 고혈당이 만성으로 지속되게 하면서 당질대사 뿐만 아니라 지질이나 단백질 대사장애를 유발하게 하여 망막, 신장, 신경, 심혈관계 등의 합병증을 유발시키는 심각한 질병이며 다양한 합병증으로 인해 수명이 5~10년 정도 단 축될 수 있고, 현재 우리나라에서도 사망원인 중 4번째의 질병이다.

최근 급속한 경제발전에 따른 식생활의 변화로 당뇨병 유병율은 해마다 증가하여 국내의 경우 약 5~10%에 달하고 있으며, 2004년 당뇨병 환자는 인구 200명 중 8.3명이었다. 이렇게 당뇨병 환자는 급속히 증가하고 있는 반면, 지속적이고 적절한 치료가 어려운 상황이기 때문에 이런 당뇨병 치료제 개발에 대한 중요성이 강조되고 있다.

현재 당뇨병의 약물치료에는 설폰요소제(sulfonyluresa), 비구아니드(biguanides)계 약물, 알파-글루코시데이즈 억제제(a-glucosidase inhibitors), 티아졸리딘다이온(thiasolidinedion)계 등의 경구혈당강하제와 인슐린 요법, 췌장이식 등을 사용하고 있는데, 모두 지속적으로 사용하게 될 경우 저혈당, 간독성 등의 부작용이 발생할 수 있으며, 근본치료방법이 되지 못하고 있다.

이에, 본 발명자들은 부작용이 없는 천연재료를 사용하여 당뇨병의 예방 및 치료제를 개발하기위해 예의 연구노력한 결과, 만삼, 단삼, 반하, 황련, 오수유, 음양곽, 대황, 소엽, 감초, 인진, 택사, 백복령, 백출, 저령 및 계지로 이루어진 한약재의 혼합 추출물이 당뇨병의 예방 및 치료에 탁월한 효과가 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 부작용이 없는 천연 한약재로부터 추출된 혼합 추 출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 만삼 6~10 중량%, 단삼 6~10 중량%, 반하 4~8 중량%, 황련 3~5 중량%, 오수유 3~5 중량%, 음양곽 8~12 중량%, 대황 4~8 중량%, 소엽 4~8 중량%, 감초 2~4 중량%, 인진 12~20 중량%, 택사 10~14 중량%, 백복령 4~6 중량%, 백출 4~6 중량%, 저령 4~6 중량% 및 계지 2~3 중량%로 이루어진 한약재의 혼합 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물에서, 상기 혼합 추출물은 만삼 150g, 단삼 150g, 반하 100g, 황련 60g, 오수유 60g, 음양곽 160g, 대황 100g, 소엽 100g, 감초 50g, 인진 300g, 택사 200g, 백복령 80g, 백출 80g, 저령 80g 및 계지 40g으로 이루어진 한약재의 혼합 추출물인 것이 바람직하다.

본 발명의 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물에서, 상기 추출물은 한약재의 열수 추출액을 동결건조한 것이 바람직하다.

이하, 본 발명의 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명한다.

이때, 사용되는 기술용어 및 과학용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

또한, 종래와 동일한 기술적 구성 및 작용에 대한 반복적인 설명은 생략하기 로 한다.

본 발명은 직접적인 당뇨병의 증상 뿐만 아니라, 당뇨병의 발병으로 인해 발생하는 합병증을 예방 및 치료할 수 있는 만삼, 단삼, 반하, 황련, 오수유, 음양곽, 대황, 소엽, 감초, 인진, 택사, 백복령, 백출, 저령 및 계지의 15가지 한약재로 이루어진 혼합 추출물을 포함하는 약제학적 조성물을 개발한 것이다.

특히, 본 발명의 약제학적 조성물은 천연물로부터 추출하여 장기간 복용해도 부작용이 미미하고, 당뇨병으로 인해 발생하는 혈당의 증가 및 인슐린의 감소현상을 제어하는 효과에 의하여 당뇨병을 예방 및 치료할 수 있을 뿐만 아니라, 췌장 및 신장의 조직 손상을 방지하는 효과에 의하여 당뇨병이 오래 지속됨으로 인한 합병증을 예방하거나 치료할 수 있다.

이때, 본 발명에서 상기 혼합 한약재를 열수 추출하기 위해 사용되는 물은 보건부 기준하여 음용 기준에 적합한 물을 말하는 것으로, 일반적으로 여과기나 정수기 등으로 여과시킨 정제수, 멸균수, 음이온수 등의 물이나 수돗물, 생수 등을 사용할 수 있다. 하지만, 본 발명에서 혼합 한약재의 유효 성분을 추출하기 위해 사용하는 용매는 물에 한정되는 것은 아니며, 인체에 해롭지 않을 정도로 제거하는 장치를 사용한다면 메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸에테르 등의 유기 용매를 사용할 수 있다.

그리고, 본 발명에서는 만삼 6~10 중량%, 단삼 6~10 중량%, 반하 4~8 중량%, 황련 3~5 중량%, 오수유 3~5 중량%, 음양곽 8~12 중량%, 대황 4~8 중량%, 소엽 4~8 중량%, 감초 2~4 중량%, 인진 15~20 중량%, 택사 10~14 중량%, 백복령 4~6 중량%, 백출 4~6 중량%, 저령 4~6 중량% 및 계지 2~3 중량%를 사용하는데, 이는 각 한약재당 상술한 최대 사용량을 초과하여 사용하면 다른 필요 성분을 충분하게 사용하지 못하고, 최소 사용량 미만을 사용하면 각 한약재의 유효 효과가 저감되고, 상술한 각 한약재당 사용 범위가 당뇨병에 대한 최대의 효과를 나타내는데 바람직하기 때문이다. 이때, 구체적으로 더 바람직하게는 만삼 150g, 단삼 150g, 반하 100g, 황련 60g, 오수유 60g, 음양곽 160g, 대황 100g, 소엽 100g, 감초 50g, 인진 300g, 택사 200g, 백복령 80g, 백출 80g, 저령 80g 및 계지 40g로 이루어지는 혼합 한약재와 물을 첨가하여 열수 추출한 것을 사용한다.

하지만, 본 발명에서는 물 이외에도 당뇨병을 예방 또는 치료하기 위하여 상기 한약재의 유효 성분을 충분히 추출하면서 인체에 전혀 무해하다면 유기 용매를 사용하여 추출한 다음, 유기 용매를 제거하는 공정을 거치게 할 수도 있다.

이와 같이, 본 발명에 따른 혼합 한약재의 추출물은 상술한 바와 같이 상호 효능 간의 적절한 조화로 인하여 당뇨병과 관련한 전반적인 병증에 대하여 부작용은 최소화하면서 예방 또는 치료의 시너지 효과를 제공할 수 있게 된 것이다.

본 발명에서는 상기 혼합 한약재 추출물을 응용하여 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 이때, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학적 제제로의 제형화 기준에 의거하여 제형화 할 수 있다.

상기 혼합 한약재 추출물은 그 자체를 사용하거나 약제학적 제제로의 제형화 기준에 허용이 가능한 부형제, 예를 들어 미결정셀룰로오즈, 콜로이드성 이산화규 소, 옥수수전분 및 붕해제, 예를 들어 옥수수전분, 크로스포비돈, 전젤라틴화전분 및 활택제, 예를 들어 글리세릴베헤네이트 및 제피제, 예를 들어 오파드라이 등과 함께 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 한약재 추출물 및 제형화 된 제제는 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.

상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 물, 링거액 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제 등과 같은 제형으로 제조한다. 다만, 본 발명의 담체가 상기의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효 성분의 투여를 의미한다.

상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 본 발명의 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 체중 1㎏ 당 100㎎ 내지 200mg을 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 본 발명의 한약재 혼합 추출물의 제조

[표 1]

약제명	학명 및 부위	사용중량(g)
만삼	radices of Codonopsis pilosula (FR.) NANNF ; Codonopsis pilosulae radix	150
단삼	radices of Salvia miltiorrhiza BGE ; Salviae miltiorrhizae radix	150
반하	rhizome of Pinellia ternata (THUNB.) BREIT. ; Pinelliae rhizoma	100
황련	rhizome of Coptis chinensis FRANCH. ;Coptis rhizoma	60
오수유	fructus of Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. ; Evodiae fructus	60
음양곽	leaves of Epimedium koreanum NAKAI ;Epimedii herba	160
대황	rhizome of Rheum palmatum L. ; Rhei radix et rhizoma	100
소엽	leaves of Perilla frutescens (L.)BRITT. ; Perillae folium	100
감초	radices of Glycyrrhiza uralensis FISCH. ; Glycyrrhizae radix	50
인진	leaves of Artemisia capillaris THUNB. ; Artemisiae capillaris herba	300
택사	rhizome of Alisma plantago-aquatica var. orientale SAMUELS. ; Alismatis rhizoma	200
백복령	whole fungi of Poria cocos(SCHW.) ; Poria	80
백출	rhizome of Atractylodes macrocephala KOIDZ. ; Atractylodis macrocephalae rhizoma	80
저령	whole fungi of Polyporus umbellatus(PERS.) FRIES. ; Polyporus	80
계지	branches of Cinnamomum cassia PRESL. ; Cinnamomi ramulus	40

상기 표 1의 천연 한약재를 각 사용중량에 맞게 준비한 혼합 한약재 1,710g에 한약재 부피 두 배 정도의 물을 넣고, 5시간동안 가열하여 열수 추출한 다음, 상기 추출물을 거어즈로 여과하여 수득한 추출액을 동결건조함으로써 본 발명의 한약재 혼합 추출물을 제조하였다. 이때, 수율은 23.7%였다.

상기 추출물을 WHW 추출물이라 명명하였으며, 이를 4℃에 보관하면서 효과 검증을 위한 약제로 사용하였다.

실험예 1. 동물실험을 통한 WHW 추출물의 항당뇨 효과

1) 당뇨병 유발 동물모델의 제작

가. 실험동물의 준비

실험동물은 평균 200g, 8주령의 Sprague-Dawley계 수컷을 샘타코(Ilsan, Korea)로부터 구입하여 사용하였다. 전체 실험 기간 동안 일반 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 삼양유지사료, Seoul, Korea)와 물을 충분히 공급하였으며 실내온도는 22±2℃, 습도는 55±5%, 명암은 12시간(Day light 06:00~18:00)을 주기로 실험 종료 시까지 일정한 사육조건을 유지시켰다.

나. 실험동물의 당뇨병 유발

Streptozotocin(STZ)을 0.01M citrate buffer(pH 4.5)에 즉시 녹여서 60㎎ STZ/㎏(body weight) 용량으로 실험동물의 체중 100g당 0.1㎖을 단회 복강투여 하였다. 당뇨가 유발된 것을 확인하기 위해 STZ 투여 72시간 후 12시간 절식시킨 다음, 꼬리로부터 혈액을 채집하여 혈당 농도가 300 ㎎/dL 이상 되는 쥐들만 선별하여 실험에 사용하였다.

2) 실험군의 선정 및 WHW 추출물의 투여

실험군은 각 그룹간의 혈당 수치의 평균값을 맞추어 생리식염수 대조 군(Saline-Control; Saline-C), Streptozotocin 대조군(Streptozotocin Control, STZ-C) 및 본 발명의 WHW 투여군(W100; WHW 100㎎/㎏)으로 나누었다. 투여 기간은 4주로 하였으며, Saline-C군과 STZ-C군은 체중 100g당 0.1 ㎖의 생리식염수를 하루 1회 경구 투여하였고, W100군은 WHW 추출물을 100㎎/㎏의 농도로 하루 1회 경구 투여하였다.

3) 실험동물의 체중 측정

실험기간 동안 매주 1회 체중 변화를 측정하였고, 투여 0일째 체중을 초기(initial) 체중으로, 28일째 체중을 마지막(final) 체중으로 하였다.

이의 결과, 도 1에서와 같이, 0주째의 체중은 Saline-C군이 276.31±12.56g 이었고, STZ-C군이 273.33±14.53g, W100군이 283.33±16.67g로 측정되어 모든 군이 유사하게 나타났다. 반면, 2주째에는 Saline-C군에서만 310.01±2.66g으로 체중이 증가되었으며, STZ-C군은 275.05±1.45g, W100군이 276.67±23.33g로 감소되었다. 또한, 4주째에도 Saline-C군은 330.0±14.63g으로 정상적으로 체중이 증가되었으나, STZ-C군이 238.0±17.89g, W100군이 274.3±31.02g으로 감소되었다. 그러나 최종 4주째 W100군이 STZ-C군에 비해 체중이 유의적으로(p<0.05) 증가된 것으로 나타났다.

STZ 처리군(STZ-C군, W100군)의 경우, 췌장의 손상에 의한 당뇨병 발병으로 인하여 정상적인 포도당 대사를 하지 못하기 때문에 생리식염수 정상 대조군에 비해 초기 체중이 증가하지 못했지만, 이중 WHW 추출물 처리군(W100군)의 경우 WHW 추출물의 항당뇨효과로 인해 인슐린 분비에 의한 포도당 대사가 정상적으로 회복되어 4주째 STZ-C군에 비해 체중이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 WHW 추출물에 대한 항당뇨효과를 확인하였다.

4) 실험동물의 혈액수집

투여 0, 7, 14, 21, 27일째에 12시간 절식한 후 꼬리 정맥으로부터 혈액을 수집하였으며 6,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 -20℃에 보관하였으며, 혈청 분석을 위한 시료로 사용하였다.

또한 모든 실험동물은 최종 부검일에 Rompun(xylazine hydrochlroride, 유한양행) 0.2㎎/㎏을 복강에 주사하여 진정시키고, Ketalar(ketamine hydrochlroride, 유한양행) 1㎎/㎏을 복강에 주사하여 마취시킨 후 개복하여 복대정맥으로부터 5㎖의 혈액을 채혈하였다. 채혈된 혈액으로부터 1시간 이내에 6,000rpm으로 5분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.

5) 혈청의 성분 분석

WHW 추출물의 항당뇨효과를 확인하기 위해 각 대조군으로부터 수집한 실험동물의 혈청을 분석하였다.

가. 혈청내 포도당(glucose) 농도 분석

당뇨병의 특징인 고혈당 증상에 대한 본 발명의 WHW 추출물의 효과를 확인하기 위하여 혈청내의 포도당 농도를 분석하였다.

혈청 포도당 농도는 포도당 산화효소(glucose oxidase) 반응을 이용한 효소시약(아산제약, Korea)을 사용하여 500nm에서 흡광도로 측정하였다.

이의 결과, 도 2에서와 같이 Saline-C군의 혈청 포도당 농도는 116.8±7.85㎎/dl, STZ-C군은 443.4±23.76 ㎎/dl, W100군은 344.01±33.96 ㎎/dl로 측정되어, 본 발명의 WHW 추출물에 의하여 혈청 포도당 농도가 STZ-C군에 비해 유의적으로(p<0.01) 감소된 것을 확인하였다. 이는 당뇨병으로 인한 고혈당 증상을 본 발명의 WHW 추출물이 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 의미한다.

나. 혈청내 인슐린(insulin) 농도 분석

당뇨병의 증상인 췌장으로부터 인슐린 분비량의 감소에 대한 본 발명 WHW 추출물의 효과를 확인하기 위하여 혈청내의 인슐린 농도를 분석하였다.

혈청 인슐린 농도는 rat insulin ELISA kit(중앙실험동물, Japan)를 이용하여 450nm에서 흡광도로 측정하였다.

이의 결과, 도 3에서와 같이 Saline-C군의 혈청 인슐린 농도는 0.44±0.02ng/㎖, STZ-C군은 0.209±0.007ng/㎖, W100군은 0.286±0.021ng/㎖로 측정되어, 본 발명의 WHW 추출물에 의하여 혈청 인슐린 농도가 STZ-C군에 비해 유의적으로(p<0.01) 증가된 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 WHW 추출물을 사용함으로써 당뇨병으로 인해 감소되는 췌장으로 부터의 인슐린 분비를 효과적으로 회복시켜 당뇨병을 치료할 수 있다는 것을 의미한다.

다. 혈청내 tryglyceride(TG) 농도 분석

당뇨병의 증상인 중성지방의 증가에 대한 본 발명 WHW 추출물의 효과를 확인 하기 위하여 혈청내의 중성지방의 농도를 분석하였다.

TG의 농도는 Kinetic alkaline picrate 방법으로 TG 진단시약(아산제약, 서울)을 이용하여 450nm에서 흡광도로 측정하였다.

이의 결과, 도 4에서와 같이 Saline-C군의 TG 농도는 131.3±35.56㎎/dl, STZ-C군은 226.8±18.28 ㎎/dl, W100군은 179.2±17.51 ㎎/dl로 측정되어, 본 발명의 WHW 추출물에 의하여 TG 농도가 STZ-C군에 비해 유의적으로(p<0.01) 감소된 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 WHW 추출물을 사용함으로써 당뇨병으로 인해 증가되는 중성지방을 감소시킴으로써 인슐린의 표적기관에서의 작용을 회복시켜 당뇨병을 치료할 수 있다는 것을 의미한다.

라. 혈청내 Blood Urea Nitrogen(BUN) 농도 분석

당뇨병의 계속적인 진행으로 당뇨병 합병증인 신장의 손상이 동반되는데 신장기능의 감퇴로 인해 혈액내의 BUN 농도가 증가하게 된다. 이러한 증상에 대한 본 발명 WHW 추출물의 효과를 확인하기 위하여 혈청내 BUN 농도를 분석하였다.

혈청 BUN 농도는 Quanti Chrom^TM Urea Assay Kit(Bioassay systems)를 사용하여 520nm에서 흡광도로 측정하였다.

이의 결과, 도 5에서와 같이 Saline-C군의 BUN 농도는 29.49±3.85㎎/dl, STZ-C군의 BUN 농도는 107.9±6.008 ㎎/dl, W100군의 BUN 농도는 79.68±8.279 ㎎/dl로 측정되어, 본 발명의 WHW 추출물에 의하여 혈청 BUN의 농도가 STZ-C군에 비해 유의적으로(p<0.001) 감소된 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 WHW 추출물이 당 뇨병 치료 효과로 인해 당뇨병의 증상이 완화되어 신장의 기능이 회복됨으로써 혈액 내 BUN 농도가 감소하였다는 것을 의미한다.

마. 혈청내 creatine 농도 분석

당뇨병의 계속된 진행으로 신장이 손상되면 신장 기능의 감퇴로 인해 혈액내의 크레아티닌(creatinine) 농도가 증가하게 되는데, 이러한 증상에 대한 본 발명 WHW 추출물의 효과를 확인하기 위하여 혈청내 creatinine 농도를 분석하였다.

혈청 Creatinine 농도는 QuantiChrom^TM Creatinine Assay Kit(Bioassay systems)를 사용하여 510nm에서 흡광도로 측정하였다.

이의 결과, 도 6에서와 같이 Saline-C군의 혈청 creatinine 농도는 0.55±0.11㎎/dl, STZ-C군은 3.34±0.190㎎/dl, W100군은 1.133±0.347㎎/dl로 측정되어, 본 발명의 WHW 추출물에 의하여 혈청 creatinine 농도가 STZ-C군에 비해 유의적으로(p<0.01) 감소된 것을 확인하였다. 이는 본 발명 WHW 추출물의 당뇨병 치료 효과로 인해 당뇨병의 증상이 완화되어 신장의 기능이 회복됨으로써 혈액내 creatinine 농도가 감소하였다는 것을 의미한다.

6) Oral glucose tolerance test(OGTT)

WHW 추출물을 투여했을 때, 경구 포도당의 체내 흡수 효율의 변화를 확인하기 위해 OGTT 실험을 수행하였다.

실험동물에 4주간 생리식염수 또는 WHW 추출물(100㎎/㎏)을 투여한 후 최소 12시간 절식시키고 증류수 또는 WHW(W100㎎/㎏)를 1㎖씩 투여하였다. 10분 후 포도당(1 g/㎏/㎖)을 경구 투여하였으며, 30분, 60분, 90분, 120분에 꼬리정맥으로부터 혈액을 채집하여 혈청을 분리한 다음 상기 혈청내 포도당 농도 측정과 동일한 방법으로 생리식염수 대조군(Saline-C), STZ 대조군(STZ-C)과 WHW 처리군(W100)에서 각각 OGTT를 실시하였다.

이의 결과, 도 7에서와 같이 Saline-C군은 0분, 30분, 60분, 90분, 120분에 포도당 농도가 106±5.2 ㎎/dl, 156±11.8 ㎎/dl, 148±18.4 ㎎/dl, 137±18.2 ㎎/dl, 118±20.1 ㎎/dl로 측정되었고, STZ-C군은 0분, 30분, 60분, 90분, 120분에 포도당 농도가 400±24.7 ㎎/dl, 480±27.9 ㎎/dl, 441±26.2 ㎎/dl, 416±28.9 ㎎/dl, 421±24.4 ㎎/dl로 측정되었다. 이에 W100군은 0분, 30분, 60분, 90분, 120분에 포도당 농도가 407±11.7 ㎎/dl, 455±17.9 ㎎/dl, 362±13.6 ㎎/dl, 353±15.1 ㎎/dl, 344±19.4 ㎎/dl로 측정되어 STZ-C군에 비해 60분과 90분에서 포도당 농도가 유의적(p<0.05)으로 감소된 것을 확인하였다.

7) Hematoxylin & Eosin 조직 염색

WHW 추출물을 투여했을 때, 당뇨병에 의해 손상되는 췌장과 신장 조직의 변화를 확인하기 위해 H&E 조직 염색을 수행하였다.

4주간 각 실험동물군에 생리식염수 또는 WHW를 100㎎/㎏ 투여한 후, Rompun 0.2㎎/㎏을 복강에 주사하여 진정시키고, Ketalar 1㎎/㎏을 복강에 주사하여 마취시킨 후 개복하여 생리식염수를 심장으로 관류하여 혈액을 제거하였고, 췌장 및 신 장을 절취하여 4% paraformaldehyde 용액에서 하루 동안 고정하였다. 고정된 조직은 10-30% sucrose 용액으로 가라앉힌 후 OCT compound를 이용하여 드라이아이스 위에서 완전히 포매시켰다. 포매된 조직은 -70℃에서 냉동 건조시켰으며, 냉동절편기를 이용하여 30-40㎛ 두께의 연속절편을 제작하였다. 이후 Harris hematoxylin 용액에 3분간 염색하였으며, 1% HCl alcohol, Ammonia 순으로 행군 다음, eosin으로 3분간 감별염색을 시행하였다. 이후에 다시 알코올 농도(70-100%)의 상순으로 탈수시켰고 염색된 조직절편을 mounting medium을 이용하여 mounting한 후 염색결과를 검경하였다.

가. 췌장조직의 형태 변화

췌장조직의 형태를 관찰한 결과, 도 8에서와 같이 정상군(Normal-C)의 경우, 붉은색의 혈관 주변에 정상적인 내분비기관인 랑게르한스섬(islets of Langerhans)과 인슐린을 분비하는 베타세포들이 관찰되었고, STZ 대조군(STZ-C)은 STZ로 유발된 당뇨병에 의해 췌장이 심하게 파괴되어 구조적인 변화가 나타났으며, 정상적인 형태의 랑게르한스섬을 거의 볼 수 없었다. 본 발명의 WHW 투여군(W100)의 경우, 정상군에 비해서는 다소 조직학적 변성을 나타내었으나, STZ 대조군에 비해서는 췌장의 형태가 복구되는 것을 확인하였다.

나. 신장조직의 형태 변화

신장조직의 형태를 관찰한 결과, 도 9에서와 같이 Normal-C군의 경우, 피질(cortex) 부분에서 정상적인 사구체(glomerular), 원위(distal tuble) 및 근위 곡세관(proximal tubule) 등으로 구성된 전형적인 nephron 구조가 인정되었으며, 피질 부분으로 신장되어 집합 세뇨관으로 구성된 수질방사(medullary ray) 역시 정상적으로 관찰되었다. 그러나 STZ-C군에서는 세뇨관 상피세포의 공포화 및 괴사, 세뇨관의 섬유화와 함께 현저한 사구체의 모세혈관 확장성 위축(vasodilated atrophy) 등 전형적인 STZ-당뇨병성 신증의 소견을 나타내었다. 이에 대해 W100군에서는 STZ에 의한 세뇨관 및 사구체의 조직학적 변화가 감소되고, 정상군과 비슷한 형태학적 특징을 나타내는 것으로 관찰되었다.

8) 인슐린(insulin)에 대한 면역조직화학염색

WHW 추출물을 투여했을 때, 당뇨병에 의해 손상되는 췌장조직 내 베타세포의 인슐린 분비의 기능적 변화를 확인하기 위해 면역조직화학염색을 수행하였다.

먼저, 췌장조직절편을 PBS로 3회 세척한 후 5% normal goat serum과 0.3% Triton X-100이 포함된 PBS로 실온에서 1시간 동안 blocking 하였다. 이를 2% normal goat serum과 0.15% Triton X-100이 포함된 PBS에 1,000배로 희석한 anti-insulin monoclonal antibody를 넣어 4℃에서 overnight 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하였다. 이를 biotinylated secondary antibody(goat anti-rat, 1:1000)로 실온에서 1시간 반응시킨 후 PBS로 3회 세척하여 avidine-biotin-horseradish peroxidase complex(Vectastain Elite)와 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 조직 절편을 0.1M Tris buffer(TB, pH 7.4)로 다시 3회 세척한 후, 0.004% H₂O₂와 0.05% DAB(Sigma)가 포함된 TB에 넣어 2-5분 반응시켰다. 이를 100% alcohol 과 xylene에 담갔다가 mounting medium을 이용하여 mounting한 후 면역염색결과를 검경하였다.

이의 결과, 도 10에서와 같이 Normal-C군의 경우, 정상적인 랑게르한스섬 안에 인슐린을 분비하는 베타세포들이 인슐린 항체에 의해 염색되어 관찰되는 반면, STZ-C은 STZ에 의해 베타세포가 파괴되어 인슐린이 분비되지 못하므로 인슐린 항체에 염색되지 않는 것으로 나타났다. 이러한 STZ에 의한 랑게르한스섬의 기능적인 변화는 정상군과 같이 회복되지는 않았지만, W100군에 의해서 인슐린 항체에 염색되는 베타세포가 증가하였고 정상적인 랑게르한스섬이 많이 관찰되었다. 따라서, WHW는 STZ에 의해 유발되는 베타세포 손상으로부터 베타세포를 보호함으로써 인슐린 분비를 증가시키는 것으로 나타났다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 만삼, 단삼, 반하, 황련, 오수유, 음양곽, 대황, 소엽, 감초, 인진, 택사, 백복령, 백출, 저령 및 계지로 이루어진 한약재의 혼합 추출물을 사용함으로 인해, 혈당의 증가 및 인슐린 농도의 감소 등과 같은 일차적인 당뇨병의 증상 뿐만 아니라, 신부전, 부종, 족부괴저, 백내장, 녹내장, 대혈관 합병증인 관상동맥 질환이나 뇌졸중, 당뇨병성 신경병증 등과 같은 이차적인 당뇨합병증을 예방 및 치료할 수 있게 된다.

도 1은 본 발명 조성물의 투여군(W100)을 포함한 각 실험군(생리식염수 대조군:Saline-C 및 Streptozotocin 대조군:STZ-C)의 체중을 2주 간격으로 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 2는 각 실험군의 혈청내 포도당 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 3은 각 실험군의 혈청내 인슐린 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 4는 각 실험군의 혈청내 TG(tryglyceride) 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 5는 각 실험군의 혈청내 BUN(blood urea nitrogen) 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 6은 각 실험군의 혈청내 creatinine 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 7은 OGTT 실험을 통해 각 실험군의 혈청내 포도당 농도를 측정하여 나타낸 그래프이다.

도 8은 각 실험군의 췌장을 Hematoxylin & Eosin 조직 염색한 후 현미경을 통해 관찰한 사진이다.

도 9는 각 실험군의 신장을 Hematoxylin & Eosin 조직 염색한 후 현미경을 통해 관찰한 사진이다.

도 10은 각 실험군의 췌장을 인슐린에 대한 면역조직화학염색한 후 현미경을 통해 관찰한 사진이다.

Claims

만삼 6~10 중량%, 단삼 6~10 중량%, 반하 4~8 중량%, 황련 3~5 중량%, 오수유 3~5 중량%, 음양곽 8~12 중량%, 대황 4~8 중량%, 소엽 4~8 중량%, 감초 2~4 중량%, 인진 12~20 중량%, 택사 10~14 중량%, 백복령 4~6 중량%, 백출 4~6 중량%, 저령 4~6 중량% 및 계지 2~3 중량%로 이루어진 한약재의 혼합 추출물을 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 만삼 150g, 단삼 150g, 반하 100g, 황련 60g, 오수유 60g, 음양곽 160g, 대황 100g, 소엽 100g, 감초 50g, 인진 300g, 택사 200g, 백복령 80g, 백출 80g, 저령 80g 및 계지 40g으로 이루어진 한약재의 혼합 추출물인 것을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 추출물은 한약재의 열수 추출액을 동결건조한 것임을 특징으로 하는 당뇨병 예방 및 치료용 약제학적 조성물.