CN1778332B - 一种制备肝脏疾病的药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药领域，具体涉及一种由丹参、三七制成的药物组合物及其用途。本发明药物组合物可以减轻慢性肝损伤，抑制肝纤维化的发生和发展，本发明药物组合物可用于治疗肝纤维化和肝硬化的药物，通过动物实验证明，该药物具有明显的抗肝纤维化利肝硬化的作用。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种制备肝脏疾病药物组合物及其用途。
背景技术
肝炎是一种常见病、多发病，我国是病毒性肝炎高发区，这些患者如不能得到有效治疗，就有可能发生肝纤维化，进而肝硬化。“肝炎、肝纤维化、肝硬化”组成的“三步曲”是各种慢性肝病导致严重后果的共同途径。由于肝硬化是肝脏实质性病变，普遍认为较难逆转，因而在治疗上除对症外，缺乏其他有效措施。而对于病毒性肝炎的治疗，目前虽有少数药物具一定疗效，但治愈率不理想，且费用昂贵。因此国内外学者不约而同把目光转向“三步曲”的中间环节--肝纤维化。肝纤维化是指肝内不同部位有不等量胶原纤维增生，代表了肝损伤后不完全修复过程。如果能有效地阻遏肝纤维化的发生、发展，甚至使其逆转，将改善慢性肝病的预后，延长患者的生命。
近年来，国内外学者针对胶原代谢的诸个环节，提出了一系列抗肝纤维化的药物和疗法。①抑制胶原合成：a、肾上腺皮质激素。b、干扰素。c、前列腺素类似物。d、类固醇类物质。e、前胶原肽。②作用于前胶原的mRNA转译后：a、秋水仙碱。b、金属离子结合剂。c、脯氨酸一4一羟化酶抑制剂。d、脯氨酸类似物。e、前胶原向胶原后转化的抑制剂。f、山黎豆等。③促进胶原降解的治疗。以上药物和疗法有的因毒副作用较大或尚处于实验阶段，其确切疗效尚待进一步观察和探讨。西药联苯双酯有快速、显著的降酶作用，但停药后“反跳”(即肝功能异常指标加倍升高)，而且药物对肝脏病理组织的恢复也难说有确切效果。对病毒抑制方面，比较公认有效的药物是干扰素及其诱导剂阿糖腺苷等，但价格昂贵、副作用大，且对人体的神经系统、消化系统、心血管系统、泌尿系统及造血系统等均可造成不同程度的损害，还有过敏反应。由于西药抗肝纤维化疗效的局限性，中药抗肝纤维化研究日益受到广泛重视，中药复方有多途径、多层次、多靶点的综合药理作用，这可能是中药复方抗肝纤维化、调控细胞功能及有关功能性基因的优势所在。
目前常见的治疗肝纤维化和早期肝硬化的中药制剂多为复方制剂，中药复方是中医的特点及临床疗效的重要基础，具有综合的药理学效应，但由于生药产地及成分的复杂性，在研究过程中制剂稳定性及可控性较差，因此尽可能减少药物组成是目前治疗肝纤维化和肝硬化的趋势，本发明正是在此基础上形成的，尽量使药物中的有效成分明确，疗效确定，质量可控，更加符合现代药物的要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备肝纤维化和肝硬化疾病的药物组合物及其用途。
本发明的药物组合物通过抑制肝纤维化的发生，进一步抑制肝硬化得发生，以达到治未病的目的。
本发明通过大量实验、在众多中药中筛选出丹参、三七制成具有抗肝纤维化作用的复方制剂药物，并通过丹参/三七不同配比的药效实验确立了丹参/三七的最佳配比。
以下所述的药物组合物的组成和配比都有较好的治疗和预防肝纤维化和肝硬化的疗效：丹参、三七；优选的各组分为丹参提取物、三七提取物；优选的各组分配比为丹参提取物0.5～7份、三七提取物0.1～5份；进一步优选的各组分配比为丹参提取物1～5份、三七提取物0.5～3份；最佳的各组分配比为丹参提取物2.5～3份、三七提取物1份。
本发明药物组成成分丹参提取物中含有丹酚酸B镁盐、丹参素钠、丹酚酸类成分，三七提取物中含有三七总皂苷；优选的本发明药物组合物中丹参提取物中的丹酚酸的含量为丹参提取物重量的30％以上，和/或三七提取物中三七总皂苷含量为三七提取物重量的30％以上；进一步优选的本发明药物组合物中丹参提取物中的丹酚酸的含量为丹参提取物重量的40％以上，和/或三七提取物中三七总皂苷含量为三七提取物重量的40％以上；最佳的本发明药物合物中丹参提取物中的丹酚酸的含量为丹参提取物重量的47～60％，和/或三七提取物中三七总皂苷含量为三七提取物重量的47～60％。
本发明药物中的丹酚酸包括丹酚酸B镁盐、丹参素钠、丹酚酸A和丹酚酸B。
本发明药物中含有丹酚酸的丹参提取物可以将原料药丹参采用中药常规方法制备。例如，可将这些原料药采用水提法、水提醇沉法、萃取法、浸渍法、渗漉法、回流提取法、连续回流提取法、大孔树脂吸附法制备，也可以采用Takashi Tanaka等报道的丹参多酚酸盐的提取方法(Chemical Pharmaceutical Bulletin，1989，37(2)，340～344)；Koji Hase等(Planta Medica，1997，63，22～26)、徐亚明等(中国专利CN1247855A，2000年3月公开)、刘平等(中国专利CN1270809A，2000年10月公开)、黎莲娘等(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)等方法从丹参中提取酚酸类化合物；但是为了使该药物各原料药更好地发挥药效，优选对丹参原料采用下述方法制备，但是这不能限制本发明的保护范围。
本发明药物组合物中丹参提取物通过下述技术方案予以实施：
丹参加水提取；提取液减压浓缩，醇沉，静置过夜；过滤，醇沉上清液，减压浓缩至无醇味，上大孔吸附树脂，水冲洗；乙醇洗脱；洗脱液减压浓缩，干燥，制成丹参提取物。
优选的丹参提取物制备方法为：取丹参加水提取2次，第一次2小时，6倍量水；第二次1小时，4倍量水；提取液减压浓缩，至密度1.05～1.10(60度)，醇沉50％，静置过夜；过滤，醇沉上清液，减压浓缩至无醇味，上大孔吸附树脂(生药∶树脂＝1∶1)；水冲洗，3～6倍量；50％乙醇洗脱3～4倍量；洗脱液减压浓缩，干燥，制成丹参提取物。
或者本发明药物组合物中丹参提取物也可以通过下述技术方案予以实施：
(a)丹参去杂质、切成小块或粉碎成粗粉，用水热提，提取液调pH至酸性后，滤过；
(b)滤液上聚酰胺柱，用水冲洗至pH值为中性，再用弱碱性水溶液洗脱，收集碱洗脱液；
(c)碱洗脱液调PH值到酸性后，上大孔吸附树脂柱，先用水冲洗至pH值为中性，再用含水或无水低级醇洗脱，收集洗脱液；
(d)洗脱液减压浓缩至无醇，干燥，即得丹参提取物。
其中：步骤(a)中，用水加热提取2～4次，每次0.5小时～2小时，提取的温度为60)～100℃(最佳为90～100℃)；提取液用酸调pH值至4以下(最佳为2以下)。
步骤(b)中，洗脱液弱碱性水溶液的浓度优选范围为0.01％～2％(最佳范围为0.08％～0.5％)；聚酰胺材料为聚己内酰胺(尼龙-6)。
步骤(c)中，大孔吸附树脂为苯乙烯型；碱洗脱液用酸调pH值到4以下(最佳为2以下)；低级醇的碳原子范围为C1～C5，如甲醇、乙醇等，其洗脱浓度为40％～95％(最佳为60％～95％)，从工业化生产的安全、低成本和工艺简化上考虑，采用95％乙醇进行洗脱，实际效果也令人满意。
三七提取物可以可利用现有技术的制备方法获得，例如可利用中国专利ZL1095363C、中国专利申请CN1352985A、钱天香等(国外医学·植物药分册，1997，12(4))、唐第光(中成药1990，12(8)：5)、中华人民共和国国家部颁标准WS3-B-3590-2001(Z)的制备方法获取三七提取物。也可以自行摸索制备工艺提取三七提取物。还可以直接从市场上购得三七提取物，例如含量为95％(UV测定)的三七总皂苷(其中Rb1≥30％、Rg1≥20％、R1≥5％，HPLC测定)。也可以采用向三七细粉中加入药材重量的13倍的、浓度为30％乙醇提取溶剂，提取温度为70℃，加热时间为40分钟，用乙醇加热回流提取2次，过滤，合并滤液，减压回收乙醇至一定量，加入适量水，继续回收至无醇味，加水使成每2ml药液相当于1g生药，药液通过预处理的大孔吸附树脂校，水洗至流出液无色，改用55％乙醇洗脱，用TCL检查洗脱终点，洗脱液加入1.1％活性炭(按投料量计)，回流脱色30min，趁热过滤，冷却，滤液通过铺有少量中性氧化铝的漏斗，减压回收乙醇，流浸膏于水浴上蒸至枯稠状，真空干燥，即得三七提取物。
本发优选采用从市场购得三七总皂苷，经进一步精制，得三七提取物。所得三七提取物中三七总皂苷的含量至少为三七提取物重量的30％以上。
本发明药物组合物的制备方法如下：
取上述方法所得到的丹参提取物和三七提取物，将上述丹参提取物：三七提取物按2.5～3∶1混合均匀，与适量辅料混合均匀，加热熔融，保温滴制，滴入常见冷凝剂中，制成滴丸即得。
本发明药物中的辅料可以是目前常见的滴丸剂常用辅料，例如聚乙二醇-6000，聚乙二醇-4000，聚乙二醇-1500，或者是聚乙二醇-6000、聚乙二醇-4000、聚乙二醇-1500的任意混合物。
本发明药物中的辅料也可以是木糖醇和淀粉，木糖醇与淀粉的重量之比为1∶0.2～1∶0.3；或者是乳糖醇和淀粉，乳糖醇与淀粉的重量之比为1∶0.2～1∶0.3；或者是木糖醇和阿拉伯胶，木糖醇和阿拉伯胶的重量之比为1∶0.2～1∶0.4。
本发明药物组合物还可以采用上述组方和常用的制剂方式制成目前其它常见的剂型，所制成的剂型可以是：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、软膏剂、硬膏剂、喷雾剂、崩解剂、泡腾剂。
以上组成在生产时可按照相应的比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤或以吨为单位，小规模生产也可以以克为单位，重量可以增大或减小，但各组成之间的生药材料重量配比比例不变。
以上各组成中的单味中药，尤其是佐药、使药或佐药与使药，可以单独或同时被适当的具有相同药性、功效的中药替换，替换后中药制剂及其药物作用不变。
本发明的药物在使用时可根据病人的情况确定用法用量，可每日1-3次，每日各生药用量以国家药典用药量为准，不超过药典规定量。
为了更好地理解本发明的实质，下面通过观察本药物组合物在预防大鼠肝纤维化作用研究得结果，说明其在治疗和预防肝纤维化和肝硬化药物中的应用，为方便叙述，下面将本发明称为软肝滴丸。
实验例：软肝滴丸防治大鼠肝纤维化作用研究
实验目的：考察软肝滴丸对CCl4所致大鼠肝硬化模型的预防和治疗作用。
实验材料：
受试动物：Wistar种大鼠，雌雄各半，体重180-230g。购自军事医学科学院9所动物实验中心，合格证号医动第05号。为二级清洁动物。饲养在天津药物研究院动物实验室。
受试药物：软肝滴丸的浸膏液，样品批号000519，由天士力研究院提供。+4℃冰箱保存。临用前A样品直接用蒸馏水稀释成40mg/ml浓度给大鼠灌胃。阳性对照药选用秋水仙碱片。昆明制药股份有限公司生产，批号990101。
试剂盒：HA放免疫测定试剂由上海海军医学研究所提供，pcIII放免测定和由重庆肿瘤研究所提供。SOD、MDA、Hyp生化测定盒由南京建成生物工程研究所提供。
实验方法
一、动物及实验分组
选用180-230g健康Wistar种大鼠，雌雄各半。随机分成正常对照组、CCl4模型组、软肝滴丸300mg/kg组、100mg/kg组及秋水仙碱0.1mg/kg组。每一给药组中再分成预防给药和治疗给药。
二、模型的建立
大鼠肝纤维化模型选用CCl4为诱导剂，CCl4小剂量长期注射(3个月)可造成肝纤维化模型。为加速纤维化的形成，我们选用特殊饲料，使造模周期缩短为6周[1]。除正常对照组外，其余动物均饲以单纯玉米面(前两周加20％猪油)加胆固醇0.5％、食盐1％、饮自来水。实验第1天背部皮下注射CCl4原液5ml/kg体重，以后每隔3天皮下注射40％CCl4-橄榄油3ml/kg体重，6周后将40％CCl4-橄榄油的用量降为1.5mg/kg体重，同时给动物恢复正常的营养饲料。分别于实验的3周末、6周末和8周处死动物。取血离心，收集血清，定位取肝组织进行肝纤维化指标的测定及病理组织学检查。
三、对大鼠肝纤维化的预防作用
大鼠注射CCl4造模的同时开始给予药物样品灌胃给药，剂量分别为软肝滴丸300mg/kg和100mg/kg，秋水仙碱0.1mg/kg，每日一次，连续给药48天。每一给药组动物数均为16只，雌雄各半。CCl4模型组86只(包括治疗给药的48只)和正常对照组10只大鼠灌蒸馏水。除正常对照组外，其余各组动物每天给予特配饲料，饮自来水，加速肝纤维化的形成。每天观察动物的行为状态，记录死亡动物。于实验的第48天(6周末)，腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉动物，断颈取全血，离心收集血清，-20℃冷冻保存备用。定位取肝组织，固定于20％福尔马林液中，常规石蜡包埋切片，HE、Masson染色，显微镜下双盲法观察记录肝纤维化的增生程度。其余的肝组织用生理盐水洗净血污后独立分装，-20℃冷冻保存，以备制成匀浆测定SOD和MDA，或脱水、脱脂、水解处理后测定Hpy。
四、对大鼠肝纤维化的治疗作用
用加速法成功造模31天后，将48只肝纤维化大鼠随机分成CCl4模型组，300mg/kg，100mg/kg，和秋水仙碱0.1mg/kg组，每组12只，雌雄各半。开始进行治疗给药，每日一次，连续一个月。继续给予CCl4刺激，6周后将40％CCl4-橄榄油的注射剂量下调为1.5ml/kg体重，同时恢复正常营养饲料。实验结束时(8周)大鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，断颈取全血，离心收集血清，测定HA，pcIII含量，定位取肝组织，固定于20％福尔马林液中，常规石蜡包埋，切片，HE、Masson染色、显微镜下双盲法观察记录肝纤维化增生程度。剩余的肝组织用生理盐水洗净血污后独立分装，-20C冷冻保存，以备SOD、MDA和Hpy的测定。
五、检测项目及指标
1.血清III型前胶原(pcIII)的测定：按照试剂盒的要求进行标准操作。由于该试剂盒适用于人的临床检验，应用到大鼠血清后反应不佳，测定值偏低，因此将操作体系加以修正，改为200μl加样量进行测定。
2.血清透明质酸(HA)的测定：按说明书操作。
3.肝组织匀浆中SOD、MDA的测定：用生理盐水将肝组织制成10％的匀浆，3500转/分离心10分钟。取上清液进行测定，按SOD、MDA测定盒的说明书操作。
4.肝组织中羟脯氨酸(Hpy)含量的测定：先将肝组织进行脱水、脱脂、水解处理。肝组织称重，按重量体积比加入无水乙醇(1∶9w/v)进行匀浆，取匀浆旋涡混匀1分钟，静置2分钟，反复2次(充分脱水)，3500转/分离心10分钟。弃上层无水乙醇，留下层沉淀。在沉淀中加2ml丙酮，旋涡混匀1分钟，静置2分钟，3500转/分离心5分钟，弃上层丙酮得沉淀，重复上述步骤一次(充分脱脂)。取丙酮脱脂后的肝组织沉淀加2ml乙醚，旋涡混匀1分钟，静置5分钟，吸弃上层乙醚，自然挥发待干，最后研成粉末。取20mg肝粉加6mol/L HCl 3ml，放磨口试管中加盖，95℃或沸水中水浴5小时。冷却后将水解液移入10ml刻度试管中，用6MNaOH调pH至6，然后稀释至10ml，3500转/分离心10分钟，取上清液2ml检测，后面的操作按Hyp测定盒说明书。
5.病理组织学观察：HE、Masson染色的组织学切片在显微镜下双盲法观察，记录各实验组大鼠肝纤维化增生程度，肝纤维化和肝硬化分级标准参照Reober[2]和王宝恩[3]的方法将肝纤维化及肝硬化程度分为五级：
0级(-)：无纤维组织增生
I级(+)：汇管区和肝窦隙少量纤维组织增生
II级(++)：汇管区和肝窦隙多量纤维组织增生伴分隔趋势
III级(H+)：汇管区和肝窦隙多量纤维组织增生伴假小叶形成
IV级(++++)：肝硬化基础上，纤维组织弥漫性增生伴淋巴细胞、单核细胞浸润
将各实验组动物肝纤维化程度按分级打分值，(-)为0分，(+)为1分，依此类推。求分值的平均数，进行统计分析(t检验)。
实验结果
一、一般观察及对肝纤维化大鼠存活率的影响
造模大鼠注射CCl4后明显消瘦，毛色干枯。一方面是由于CCl4的毒性所致，另一方面由于特殊配比饲料，大鼠不适应，造成日进食量减少。各实验组均有动物状态不佳，甚至出现死亡。濒死动物剖腹可见有肝腹水。实验5周前预防给药组动物的整体状态要好于CCl4模型组。实验期间各组动物的存活情况见表1和表2。发现预防给药前3周，给药组动物均未出现死亡，而CCl4模型组死亡4只；5周时，给药组的存活率高于CCl4模型组；6周时给药组与CCl4模型组的这种差异逐渐缩小。治疗给药1月后100mg/kg组的动物存活率明显高于模型组及秋水仙碱0.1mg/kg组。该结果提示软肝滴丸对CCl4造成的肝损伤有一定的保护作用，可延缓毒性出现的时间，预防给药较治疗给药的效果明显。
表1：预防给药对大鼠存活率的影响
表内数字表示存活动物数，括号里表示存活率。
表2：治疗给药1个月后各组动物的存活率
二、对肝纤维化大鼠血清HA、pcIII含量的影响
软肝滴丸预防给药和治疗给药后对纤维化大鼠血清HA、pcIII的测定结果见表3、表4。CCl4模型组(p＜0.01，p＜0.05)预防给药和治疗给药HA含量平均值较CCl4模型组虽有降低，但无统计学意义(P＞0.05)。从所测得的数据来看，似乎治疗给药的疗效更好，尤其是300mg/kg组，HA含量较接近正常对照组，且软肝滴丸的治疗效果优于秋水仙碱(三个组的p值均小于0.01)。pcIII指标的测定结果表明模型复制是成功的，但给药组与模型组未见有何差异。
表3：预防给药48天对肝纤维化大鼠血清指标的影响
△△p＜0.01 △p＜0.05(与正常对照比较)
注：括号内的数字表示样本数
表4：软肝滴丸治疗给药对肝纤维化大鼠血清指标的影响
△p＜0.05(与正常对照比较) **p＜0.01(与秋水仙碱比较)
三、对肝组织中SOD、MDA和Hpy含量的测定
软肝滴丸预防给药和治疗给药对肝脏组织SOD、MDA和Hpy的含量测定结果见表5、表6。可见CCl4模型组动物肝组织中SOD活性及Hpy的含量与正常对照比较明显降低(p＜0.001)。同时MDA含量升高，表明模型动物的肝脏细胞已受到有害自由基的严重损伤，继而造成纤维增生，反映胶原蛋白的Hpy含量升高。从测得的数据来看，软肝滴丸和秋水仙碱，无论是预防给药还是治疗给药均在一定程度上有逆转上述异常指标的趋势，与CCl4模型组比较，无统计学意义，这可能与肝硬化模型过重有关。软肝滴丸与阳性药秋水仙碱之间也无明显差异。
表5：软肝滴丸预防给药对肝纤维化大鼠肝组织中SOD、MDA、Hpy的影响
△△△p＜0.001(与正常对照比较) *p＜0.05(与CCl4模型比较)
表6软肝滴丸治疗给药1个月对肝纤维大鼠肝组织中SOD、MDA、Hpy的影响
△△p＜0.01 △p＜0.05(与正常对照比较)
四、病理组织中检查
肝组织切片经HE及Masson染色，显微镜下双盲法观察其病理改变，发现除肝纤维化和肝硬化病变外，各组均呈现肝细胞脂肪变性，且尤以预防给药阶段为著，而随着肝硬化的形成，脂肪变性程度减轻。肝纤维化形成以肝窦隙和汇管区纤维组织增生为主要表现，肝窦隙纤维化呈现肝细胞周围，尤以中央静脉周围肝窦隙纤维化为著，逐渐融合成分隔带，加之汇管区纤维组织增生向小叶内穿插，逐渐将原正常肝组织分隔、包绕、形成假小叶。各实验组的典型病理照片见附件，按照肝纤维化分级评分制，将各实验组动物的分级结果列于表7、表8。发现软肝滴丸预防给药300mg/kg，与CCl4模型组比较，肝纤维化程度明显减轻(p＜0.05)。CCl4模型动物的病理损伤程度处于(++)级以上，而给药组还有部分动物为(+)级，占15.4-25％。治疗给药与模型组比较，虽无统计学的明显差异，但从评分的平均值来看，软肝滴丸两个组均低于模型组，尤以300mg/kg更为明显。从表7中可以看出CCl4造模6周的纤维化程度分值为2.64，我们在CCl4造模31天(5周)开始治疗给药1个月后，软肝滴丸得分值为2.28-2.67，与造模6周时(2.64，见表7)基本一致，而模型组动物的肝纤维化程度进一步加重，分值达3.0。说明经软肝滴丸治疗后能在一定程度上阻止肝纤维化向肝硬化的进一步发展，该药的治疗效果不亚于秋水仙碱。
表7：软肝滴丸预防给药48天对大鼠肝纤维化程度的影响
*p＜0.05(与CCl4模型比较)
表8：软肝滴丸治疗给药1个月对大鼠肝纤维化程度的影响
本实验结果表明软肝滴丸预防给药和治疗给药300mg/kg组HA水平接近正常值，且疗效优于秋水仙碱组。该药显示出了一定的抗肝纤维化的作用。pcIII的测定结果给药组与模型组比较未见差异，分析原因有：1.pcIII测试盒是用于人临床实验，造成结果偏差。2.pcIII指标适用于肝纤维化的形成时期，对于肝硬化或陈旧纤维化不一定升高。本实验在CCl4造模6周末和8周时取血测定pcIII，此时经病理检查已处于纤维化中期，因此各组间的pcIII含量相差不多，CCl4模型组不会再升高，今后在观察pcIII指标时可适当提前取血的时间，血清学的变化是先于病理改变的。
大鼠注射CCl4造成的肝损伤直至演变为肝纤维化或肝硬变，主要是由自由基损伤引起的，若药物具有直接或间接的抗氧化、抗自由基功效(降低MDA含量，增加SOD活性)，即能保护组织，减轻这种损伤，阻止或延缓肝纤维化的形成。肝组织中SOD活性，降低MDA和Hpy含量的作用趋势，与CCl4模型比较无统计学意义，可能与模型过重有关，掩盖了部分药效，但该药对大鼠肝纤维化的防治作用是不容忽视的。
病理组织学检查结果表明，CCl4注射3周即可造成大鼠肝脂肪病变，形成了空泡，约1/4动物已出现早期肝纤维组织增生，6周末大部分动物已处于肝纤维化(++)级，为重度纤维化或硬化。软肝滴丸预防给药48天可使大鼠肝纤维化程度明显减轻。当大鼠已形成中度纤维化时，开始治疗给药，1个月后软肝滴丸治疗组基本阻止了肝纤维化的进一步发展。若将治疗给药的开始时间提前(造模3周)，即在肝纤维化初期应用此药，相信其治疗效果会更加明显。
结论：软肝滴丸能提高CCl4造模大鼠的存活率，对肝损伤有一定的保护作用；该药可改善肝病变大鼠血清及肝组织中异常的生理及生化指标，具有一定的抗纤维化作用；软肝滴丸预防给药48天，大鼠肝脏的病理组织学改变程度比CCl4模型组显著减轻，对于中度肝纤维化大鼠，软肝滴丸治疗1个月有阻止肝纤维化进一步发展的趋势；软肝滴丸(100-300mg/kg)对大鼠肝纤维化的防治作用不亚于秋水仙碱，甚至在某些测定指标还优于秋水仙碱，尤其是治疗给药，软肝滴丸的效果要好于秋水仙碱。
本发明药物是通过以下实施例制备而成，以下具体实施例是对本发明的解释，并不能限制本发明。
具体实施方式
实施例1：丹参提取物的制备方法
取丹参加水提取2次，第一次2小时，6倍量水；第二次1小时，4倍量水；提取液减压浓缩，至密度1.05～1.10(60度)，醇沉50％，静置过夜；过滤，醇沉上清液，减压浓缩至无醇味，上大孔吸附树脂(生药∶树脂＝1∶1)；水冲洗，3～6倍量；50％乙醇洗脱3～4倍量；洗脱液减压浓缩，干燥，制成丹参提取物。
实施例2：丹参提取物的制备方法
(a)丹参去杂质、切成小块或粉碎成粗粉，用水热提，提取液调pH至酸性后，滤过；
(b)滤液上聚酰胺柱，用水冲洗至pH值为中性，再用弱碱性水溶液洗脱，收集碱洗脱液；
(c)碱洗脱液调PH值到酸性后，上大孔吸附树脂柱，先用水冲洗至pH值为中性，再用含水或无水低级醇洗脱，收集洗脱液；
(d)洗脱液减压浓缩至无醇，干燥，即得丹参提取物。
其中：步骤(a)中，用水加热提取2～4次，每次0.5小时～2小时，提取的温度为6(0～100℃(最佳为90～100℃)；提取液用酸调pH值至4以下(最佳为2以下)。
步骤(b)中，洗脱液弱碱性水溶液的浓度优选范围为0.01％～2％(最佳范围为0.08％～0.5％)；聚酰胺材料为聚己内酰胺(尼龙-6)。
步骤(c)中，大孔吸附树脂为苯乙烯型；碱洗脱液用酸调pH值到4以下(最佳为2以下)；低级醇的碳原子范围为C1～C5，如甲醇、乙醇等，其洗脱浓度为40％～95％(最佳为60％～95％)，从工业化生产的安全、低成本和工艺简化上考虑，可采用95％乙醇进行洗脱。
实施例3：三七提取物的制备方法
取三七细粉中加入药材重量的13倍的、浓度为30％乙醇提取溶剂，提取温度为70℃，加热时间为40分钟，用乙醇加热回流提取2次，过滤，合并滤液，减压回收乙醇至一定量，加入适量水，继续回收至无醇味，加水使成每2ml药液相当于1g生药，药液通过预处理的大孔吸附树脂校，水洗至流出液无色，改用55％乙醇洗脱，用TCL检查洗脱终点，洗脱液加入1.1％活性炭(按投料量计)，回流脱色30min，趁热过滤，冷却，滤液通过铺有少量中性氧化铝的漏斗，减压回收乙醇，流浸膏于水浴上蒸至枯稠状，真空干燥，即得三七提取物。
实施例4
从市场购得三七总皂苷，经进一步精制，得三七提取物。所得三七提取物中三七总皂苷的含量至少为三七提取物重量的30％以上。
实施例5
丹参5kg粉碎成粗粉，加去离子水在100℃微沸状态下加热提取3次。第一次5.5倍水，加热1小时；第二、三次各加3倍量水分别加热0.5小时。提取液用10％盐酸调PH值为2后，滤过，滤液上聚酰胺柱(干树脂量为生药量2/3)。用5倍量去离子水洗，继续用0.1％碳酸氢钠水溶液洗脱，用量为柱体积的5倍。收集洗脱液，用10％盐酸调PH到2后上D101大孔吸附树脂，用去离子水冲洗至中性，继续用95％乙醇洗脱，待色带下来即收集此色带。减压浓缩收集液至尽干，用适量水溶解后冰箱冷藏过夜，通过0.3μm混合纤维素微孔滤膜过滤即得丹参总酚酸提取液，以2％氢氧化钠调节PH值到6.0后立即冷冻干燥，得丹参总酚酸原料冻干粉221g，成品收率为生药量的4.4％。.按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法进行测定，成品含总酚酸83.94％，丹酚酸B为53.73％。
实施例2
丹参5kg粉碎成粗粉，加去离子水在80℃加热提取3次。第一次5.5倍水，加热2小时；第二、三次各加3倍量水分别加热1小时。提取液用5％硫酸调PH值为1后，滤过，滤液上聚酰胺柱(干树脂量为生药量2/3)。用5倍量去离子水洗，继续用0.2％碳酸氢钠水溶液洗脱，用量为柱体积的4倍。收集洗脱液，用5％硫酸调PH到1后上AB-8大孔吸附树脂，用去离子水冲洗至中性，继续用60％乙醇洗脱，待色带下来即收集此色带。减压浓缩收集液至无醇味，冰箱冷藏过夜，通过0.3μm混合纤维素微孔滤膜过滤即得丹参总酚酸提取液，以2％氢氧化钠调节PH值到6.0后立即冷冻干燥，得丹参总酚酸原料冻干粉227g，成品收率为生药量的4.5％。按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法进行测定，成品含总酚酸83.15％，丹酚酸B为54.03％。
实施例3
丹参5kg粉碎成粗粉，加去离子水在100℃微沸状态下加热提取3次。第次5.5倍水，加热1小时；第二、三次各加3倍量水分别加热0.5小时。提取液用10％盐酸调PH值为2后，滤过，滤液上聚酰胺柱(干树脂量为生药量2/3)。用5倍量去离子水洗，继续用0.1％碳酸氢钠水溶液洗脱，用量为柱体积的5倍。收集洗脱液，用10％盐酸调PH到2后上RA大孔吸附树脂，用去离子水冲洗至中性，继续用60％甲醇洗脱，待色带下来即收集此色带。减压浓缩收集液至无醇味，冰箱冷藏过夜，通过0.3μm混合纤维素微孔滤膜过滤即得丹参总酚酸提取液，以2％氢氧化钠调节PH值到6.0后立即冷冻干燥，得丹参总酚酸原料冻干粉224g，成品收率为生药量的4.5％。按专利申请文献(中国专利，申请号01142288.2，申请日2001年9月)的方法进行测定，成品含总酚酸84.02％，丹酚酸B为54.17％。
实施例4
取丹参5kg加水提取2次，第一次2小时，6倍量水；第二次1小时，4倍量水；提取液减压浓缩，至密度1.05～1.10(60度)，醇沉50％，静置过夜；过滤，醇沉上清液，减压浓缩至无醇味，上大孔吸附树脂(生药∶树脂＝1∶1)；水冲洗，3～6倍量；50％乙醇洗脱3～4倍量；洗脱液减压浓缩，干燥，制成丹参提取物。
实施例5
取三七细粉5kg，向三七细粉中加入药材重量的13倍的、浓度为30％乙醇提取溶剂，提取温度为70℃，加热时间为40分钟，用乙醇加热回流提取2次，过滤，合并滤液，减压回收乙醇至一定量，加入适量水，继续回收至无醇味，加水使成每2ml药液相当于1g生药，药液通过预处理的大孔吸附树脂校，水洗至流出液无色，改用55％乙醇洗脱，用TCL检查洗脱终点，洗脱液加入1.1％活性炭(按投料量计)，回流脱色30min，趁热过滤，冷却，滤液通过铺有少量中性氧化铝的漏斗，减压回收乙醇，流浸膏于水浴上蒸至枯稠状，真空干燥，即得三七总皂苷。
实施例6
取按照实施例1方法获得的丹参提取物2.5g，实施例3方法获得的三七提取物1g，混合均匀，与15g聚乙二醇6000混合均匀，加热至温度85～90℃，化料40～80分钟后，移至罐温保持在85～90℃的滴丸机滴罐中。药液滴至7～8℃甲基硅油中，取出滴丸，除油，筛网选丸，即得。
实施例7
取按照实施例2方法获得的丹参提取物3g，实施例3方法获得的三七提取物1g，混合均匀，与聚乙二醇-600018g混和均匀，加热至温度85～90℃，化料20～120分钟后，移至罐温保持在85～90℃的滴丸机滴罐中。药液滴至7～8℃液体石蜡中，取出滴丸，除油，筛网选丸，即得。
实施例8
取按照实施例4方法获得的丹参提取物1g，实施例3方法获得的三七提取物9g，混合均匀，与15g聚乙二醇4000混合均匀，加热熔融，保温滴制，滴入常见冷凝剂中，制成1000粒滴丸即得。
实施例9
取按照实施例3方法获得的丹参提取物7g，实施例3方法获得的三七提取物3g，混合均匀，与15g聚乙二醇6000和聚乙二醇4000混合物混合均匀，加热熔融，保温滴制，滴入常见冷凝剂中，制成1000粒滴丸即得。
实施例10
取按照实施例1方法获得的丹参提取物3g，实施例3方法获得的三七提取物7g，混合均匀，与15g聚乙二醇6000和聚乙二醇1500混合物混合均匀，加热熔融，保温滴制，滴入常见冷凝剂中，制成1000粒滴丸即得。
实施例11
取按照实施例4方法获得的丹参提取物9.9g，实施例3方法获得的三七提取物0.1g，混合均匀，与15g聚乙二醇4000和聚乙二醇1500混合物混合均匀，加热熔融，保温滴制，滴入常见冷凝剂中，制成1000粒滴丸即得。
实施例12
取按照实施例1方法获得的丹参提取物5g，实施例3方法获得的三七提取物5g，混合均匀，与15g聚乙二醇6000和聚乙二醇1500混合物混合均匀，加热熔融，保温滴制，滴入5～10℃液体石蜡中，制成1000粒滴丸即得。
实施例13
取按照实施例1方法获得的丹参提取物5.5g，实施例3方法获得的三七提取物4.5g，混合均匀，与20g聚乙二醇6000混合均匀，加热至温度85～90℃，化料80～100分钟后，移至罐温保持在85～90℃的滴丸机滴罐中。药液滴至0～5℃液体石蜡中，取出滴丸，除油，筛网选丸，即得。
实施例14
取按照实施例4方法获得的丹参提取物7.5g，实施例3方法获得的三七提取物2.5g，与16.5g聚乙二醇4000混合均匀，加热熔融，保温滴制，滴入常见冷凝剂中，制成1500粒滴丸即得。
实施例15
取按照实施例3方法获得的丹参提取物5g、实施例3方法获得的三七提取物0.1g、木糖醇15g、淀粉4g，备用；
将丹参提取物和三七提取物加入木糖醇和淀粉混合物中，搅拌均匀，保温，在55～75℃温度下滴制、滴管口径为1.30～4.0毫米，以每分钟30～60滴的速度滴制，滴入甲基硅油中，制成1000粒滴丸，成形后，将丸取出，用吸水纸拭干滴丸表面，即得。
实施例16
取按照实施例2方法获得的丹参提取物7g、实施例3方法获得的三七提取物5g、木糖醇25g、淀粉6g备用；
将丹参提取物和三七提取物加入水浴融化的木糖醇和淀粉混合物中，保温，在65～95℃温度下滴制、滴管口径为1.10～3.0毫米，以每分钟20～50滴的速度滴制，滴入植物油中，制成1000粒滴丸，成形后，将丸取出，用吸水纸拭干滴丸表面，即得。
实施例17
取按照实施例2方法获得的丹参提取物5g、实施例3方法获得的三七提取物5g、乳糖醇17.5g、阿拉伯胶5.5g备用；
将丹参提取物和三七提取物加入乳糖醇和阿拉伯胶混合物中，混合物在50～95℃加热熔融，搅拌均匀，搅拌时间为10～30分钟，保温，在60～85℃温度下滴制、滴管口径为1.1～3.5毫米，以每分钟50～60滴的速度滴制，滴入甲基硅油中，制成1000粒滴丸，成形后，将丸取出，用吸水纸拭干滴丸表面，即得。
实施例18
取按照实施例2方法获得的丹参提取物1g、实施例3方法获得的三七提取物10g、木糖醇20.7、阿拉伯胶8.3g备用；
将丹参提取物和三七提取物加入木糖醇和阿拉伯胶的混合物中，充分混合，混合物在50～115℃加热熔融，搅拌均匀，搅拌时间为10～30分钟，保温，在60～85℃温度下滴制、滴管口径为1.1～3.5毫米，以每分钟20～60滴的速度滴制，滴入0～18℃的液体石蜡中，待干燥后分装，制成1000粒滴丸，成形后，将丸取出，用吸水纸吸去丸表面的液状石蜡，即得。
实施例19
取按照实施例1方法获得的丹参提取物7g、实施例3方法获得的三七提取物2g、乳糖醇16g、阿拉伯胶4g备用；
将丹参提取物和三七提取物加入乳糖醇与阿拉伯胶的混合物中，混合物在64℃加热熔融，搅拌均匀，搅拌时间为10～30分钟，保温，在64℃温度下滴制、滴管口径为1.2～2.5毫米，以每分钟20～60滴的速度滴制，滴入0℃的甲基硅油中，制成1000粒滴丸，将形成的滴丸沥尽并擦去冷却液，待干燥后分装，制成1000粒滴丸，即得
实施例20
取按照实施例2方法获得的丹参提取物6g、实施例3方法获得的三七提取物4g、木糖醇14g、阿拉伯胶6g备用；
将丹参提取物和三七提取物加入木糖醇和阿拉伯胶的混合物中，混合物在64℃加热熔融，搅拌均匀，搅拌时间为10～30分钟，保温，在64℃温度下滴制，滴管口径为1.2～2.5毫米，以每分钟20～40滴的速度滴制，滴入10℃的甲基硅油中，将形成的滴丸沥尽并擦去冷却液，待干燥后分装，制成1000粒滴丸，即得。
Claims (5)
1.一种治疗肝纤维化和早期肝硬化的药物组合物，其特征在于该药物组合物组成为：丹参提取物0.5～7份和三七提取物0.1～5份，所述丹参提取物中含有丹酚酸、丹酚酸B镁盐、丹参素钠，所述三七提取物中含有三七总皂甙，其中所述丹参提取物中的丹酚酸的含量为丹参提取物重量的47～60％，和/或三七提取物中三七总皂苷含量为三七提取物重量的47～60％。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于该组合物的组成为：丹参提取物1～5份、三七提取物0.5～3份。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于该组合物的组成为：丹参提取物2.5～3份、三七提取物1份。
4.如权利要求1所述的药物组合物的应用，其特征在于该药物组合物在制备治疗乙肝、慢性乙肝和脂肪肝所导致的肝纤维化和早期肝硬化药物中的应用。
5.如权利要求1所述的药物组合物的应用，其特征在于该药物组合物在制备治疗慢性肝损伤，抑制肝纤维化药物中的应用。
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