CN1939348A - 一种中药有效成分的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然药物领域，具体涉及中药有效成分的筛选方法，其特征是：将待测的中药提取液和血清白蛋白溶液混合均匀，通过平衡透析或微透析取样并收集反应透析液，将待测的中药提取液和不含血清白蛋白空白的溶液混合均匀，通过平衡透析或微透析取样收集空白透析液，再将上述反应透析液和空白透析液在相同的条件下进行高效液相色谱分析，再计算出各药物成分的蛋白结合率。本发明的有效成分活性筛选方法合理可行，通过本发明筛选方法不仅可以筛选出真正起效的有效成分，还可以发现其它的具有适中蛋白结合率的成分，进行深入研究有可能发现潜在的新药。

Description

一种中药有效成分的筛选方法

技术领域

本发明涉及天然药物领域，具体涉及中药有效成分的筛选方法，具体为建立通过中药各成分与蛋白相互作用的信息，对不同的成分进行活性筛选的方法。

背景技术

传统中药活性成分的筛选，通常是采用植物化学的方法提取其中的有效部位化合物群或单体化合物，再经药理实验进行确定。但由于中药及其复方中的化学成分极其复杂，传统的筛选方法需要消耗大量的样品和实验动物，且筛选的效率不高。现代药物筛选除通过特定靶点来筛选有作用的活性化合物外，还通过化合物药代动力学、毒性等多方面的性质进行筛选，因为理想的候选药物不仅需要较强的药理活性，还必须有良好的药物动力学性质和代谢稳定性，很大一部分候选药物由于药物动力学性质的原因而失败，因此在药物发现过程中的较早时期进行药物动力学，代谢稳定性的研究，将会降低后期临床前试验失败的发生率，节省开发经费，是化合物优化过程重要的组成部分。

目前，药物动力学性质的药物筛选主要有体内和体外两方面，体内药物动力学筛选主要是通过口服、注射等不同途径给药后的体内药代动力学研究获得候选化合物的药物动力学参数；体外药代动力学筛选主要是通过各种药物的吸收、分布和代谢的体外筛选模型来进行，如Caco-2细胞通透性筛选和平行的人工膜通透性检测(PAMPA)来评价侯选化合物的口服吸收的程度；生物色谱技术如蛋白生物色谱技术来评价被选化合物与蛋白的相互作用和体内的分布；用微粒体、肝切片、原代培养肝细胞、肝细胞系等体外模型来评价侯选化合物的代谢稳定性。通过药物动力学筛选可以获得化合物的各项药动学参数，为后期的药物开发提供了有益的参考，但在实际应用中仍有诸多不足。如体内药代动力学筛选费时费力，样品和实验动物的消耗量大，研究费用很高；而各种体外药代动力学筛选方法由于受种属差异、体外系统的非生理特性和体内药代动力学等因素的影响，预测准确性尚不令人满意；现在的药物动力学筛选几乎都应用于合成化合物及天然化合物单体的活性筛选。传统中药由于成分复杂，若将有效成分提取后再进行上述筛选则成本过高，实用性差。

发明内容

本发明无需将中药有效成分进行分离，而是通过直接将中药提取物与蛋白结合来筛选中药有效成分。通过研究中药中各成分与蛋白相互作用的信息(如蛋白结合率)来对其进行活性评价，尽可能地避免因蛋白的生物学特征受到影响而影响到活性评价的准确性，并且在活性评价的同时获得其结构信息，以便快速的从中寻找可能具有活性的先导化合物或化合物群，同时该方法相对简单、成本较低，并可以作为中药质量控制的补充手段。

血浆白蛋白是血浆中最丰富的蛋白，能与绝大部分药物发生定量的可逆性结合并形成的蛋白一药物复合物，作为循环药物的“储存库”，对药物的代谢具有重要的生理意义。药物在体内的分布，新陈代谢和药效都能在其与血浆蛋白结合的基础上发生改变。此外，许多化合物出现无效的情况是因为它们与很多的蛋白质有过低或过高的亲和力，因为与蛋白的结合力过低，在体内很快被代谢；与蛋白的结合力过高，在体内很难被代谢，甚至会产生毒性。因此我们可以根据不同化合物与蛋白相互作用的信息(如蛋白结合率)来对其进行活性评价，如那些结合率过低或过高的成分就可能是无活性的成分。

本发明的中药有效成分的筛选方法包括以下步骤：

a、将待测的中药提取液和血清白蛋白溶液混合均匀，通过平衡透析或微透析取样并收集反应透析液。

所述检测方法中，待测中药是单味中药或中药复方；具体提取中药的溶剂优选水、C₁-C₅的低级醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它们的混合物；C₁-C₅的低级醇优选甲醇，乙醇、正丁醇；提取中药的溶剂是中性、酸性或碱性；选用无机酸、无机碱、有机酸或有机碱中和酸性或碱性的中药提取液。更优选的提取中药的溶剂是水和/或乙醇；对含有机溶剂提取液，浓缩去除全部有机溶剂后，用缓冲液或低于3％的增溶剂溶解，制成中药提取液备用。按中药提取液的体积加入0.1-3％体积的增溶剂，增溶剂选自吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇、曲拉通或它们的混合物。

本发明的检测方法中：中药提取液优选水和/或乙醇提取制备的中药提取液；缓冲液优选PH6.0-7.4的磷酸盐或醋酸盐缓冲液。

前述检测方法特征在于：血浆蛋白优选人血浆白蛋白或牛血浆白蛋白，用PH7.0-7.4的磷酸盐制备浓度为0.6mM/L的溶液；将待研究中药提取物与血浆白蛋白溶液混合形成均相的混合体系，根据药材成分的稳定性可选择不同的反应温度(4℃或25℃)。如果药材中含有较多的挥发性成分，则可选择4℃的反应温度，如果药材中无挥发性成分或者较少，则可选择25℃的反应温度。运用平衡透析、微透析取样方法结合高效液相色谱法检测中药各成分的蛋白结合率。

前述检测方法中平衡透析是将中药提取液与血浆蛋白溶液的透析袋置于缓冲液中透析，透析时温度和时间成反比，温度越低，膜两侧达到平衡所需的时间越长，透析温度为4-25℃时，透析时间为12-24小时。微透析相对于平衡透析它是一种动态取样技术，该系统基本由微量注射泵、微透析探针、连接管和灌流液组成探针，常是将一管式透析膜装于由钢、石英毛细管或塑料等材料制成的双层套管内构成，灌流液由微量注射泵以低流速(1-2μL/min)注入探针，当到达透析管处，与被取样的基体发生物质交换，透过膜的化学物质被连续流动的灌流液带出探针。

b、在与上述步骤相同的条件下，将待测的中药提取液和不含血清白蛋白空白的溶液混合均匀，通过平衡透析或微透析取样收集空白透析液。

C、将上述反应透析液和空白透析液在相同的条件下进行高效液相色谱分析

通过计算反应透析液中药物成分的峰面积和空白透析液中药物成分的峰面积，可以推算出各药物成分的蛋白结合率。具体公式如下：蛋白结合率(％)＝(空白透析液中药物成分的峰面积—反应透析液中药物成分的峰面积)/空白透析液中药物成分的峰面积。由于微透析是一种连续、动态的取样过程，其透析液中的药物浓度总低于实际反应体系中药物的浓度，因此，需用相对回收率(％)来进行校对，具体公式如下：相对回收率(％)＝微透析液中药物成分的峰面积/反应体系中药物成分的峰面积。通过各成分的蛋白结合率可以预测各成分在体内的代谢分布情况，通常情况下，药物成分的蛋白结合力过低，在体内很快被代谢；与蛋白的结合力过高，在体内很难被代谢，甚至会产生毒性。因此，活性成分在体内都会有一个合适的蛋白结合率，即蛋白结合率不会太高也不会太低。因此，本发明可通过中药中各成分与蛋白相互作用的信息，可对各成分进行活性筛选，同时透析或微透析可与LC/MS联用，在筛选活性成分的同时获得其结构信息，可以快速的从中药中寻找可能具有活性的先导化合物或化合物群。同时本发明方法相对简单、成本较低，从中药中筛选有效成分的效率显著提高，并可作为中药质量控制的补充手段。中药指纹图谱是中药质量控制的一个关键技术，但现行指纹图谱存在的一个突出问题就是不能提供该中药的药理信息。例如，图1-a中表示的当归补血汤的A图谱即是当归补血汤的指纹图谱，它仅能提供中药材所含成分的化学信息，应用本发明方法将当归补血汤与牛血清白蛋白作用后再做指纹图谱，如图1-a中当归补血汤的B图谱，可看出共有20个峰的峰面积发生了不同程度的变化。药物与血浆蛋白的结合对药物的代谢具有重要的生理意义，药物在体内的分布，新陈代谢和药效都能在其与血浆蛋白结合的基础上发生改变。图1-b是当归补血汤中20个成分的蛋白结合率的柱状图，从图中可看出各成分的蛋白结合率的差异，其中有的成分的蛋白结合率较低(如1号成分的蛋白结合率只有6.93％)，有的成分的蛋白结合率较高(如19号成分的蛋白结合率达到86.6％)。而有部分蛋白结合率适中的成分经结构鉴定，结合参考文献已证明为活性物质(详见具体实施方式)。这进一步说明了本发明筛选中药有效成分的可行性。

以下是对本发明中药有效成分筛选方法的进一步描述：

透析膜的选择：

本发明所述透析膜是指具有一定截留分子量的半透膜，可用不同的材料制作，如再生纤维素，聚醚砜等材料。目前市售的透析膜有若干种规格，其型号标准可用截留分子量来划分，如截留分子量12000的透析膜可允许分子量低于12000的分子通过，而高于12000的分子则不能通过。根据实验要求可选择不同截留分子量的透析膜，中药成分复杂，如大分子的蛋白质、多糖、肽类及各种小分子物质，如果研究对象是中药中的大分子物质，则需要截留分子量大一点的半透膜；如果是中药中的小分子物质，则可选截留分子量小一点的半透膜，透析膜能保证中药中与蛋白等生物大分子结合后的分子不能通过透析膜，而没有结合的可以自由通过。

血浆蛋白溶液的制备：血浆蛋白可选择人源性的人血浆白蛋白或牛血浆白蛋白，用PH6.0-7.4的磷酸盐缓冲液充分溶解，浓度不宜过大，实验浓度一般选择0.6mM/L(生理状态下血浆白蛋白的浓度为0.6mM/L)，配制好的血浆白蛋白溶液置4℃环境下避光储存。

中药的提取：所述的中药包括单味中药以及由数味中药组成的复方。针对不同中药所含有效成分的理化性质，可以任选合适的溶媒进行提取。但是，将与蛋白的接触提取液，必须不会影响蛋白结构。一般以水或者低浓度的增溶剂如二甲基亚砜，吐温为宜，也就是说，对待筛的中药进行提取时可以用任何溶剂。在提取液是水液，可以直接将提取液与蛋白进行反应。如果是用其它可能影响蛋白结构的有机溶剂提取中药，对该提取液要进行一定的处理，即在去除有机溶剂后加入少量的不影响蛋白结构的增溶剂，如1％的二甲基亚砜等。原则上，加入增溶剂的含量，以不影响蛋白结构为适度，在实际操作中，这种适度通过简单测试是容易掌握的。例如：取少量待测提取液与蛋白溶液接触，观察蛋白溶液的变化，如有沉淀现象则表明该提取液需要进一步降低增溶剂的浓度。提取液中提取物的浓度只要达到可以检测的限度就行，浓度对实验效果并无显著影响。

透析：

平衡透析实验中，可根据实验要求选择不同的PH值的缓冲液进行透析，4℃透析时一般达到平衡需要24小时，而25℃透析时达到平衡只需12小时，随着温度的升高，达到平衡的时间将会缩短，但当温度太高时，中药提取液特别是水溶液很容易变质，因此应根据实验要求调整适宜的温度以保证既能节省时间又能维持中药成分的稳定性。

微透析实验中，可根据具体实验情况选择不同长度透析膜，透析膜长度越长则相对回收率越高，可根据药材及实验试剂的量选择不同长度的透析膜，如果药材及实验试剂的量充足，可选择5cm长度的透析膜；如果药材及实验试剂的量较少，可选择1cm长度的透析膜进行微透析。微透析灌流液的流速与相对回收率成反比，为保证样品有一个较高的相对回收率，同时又能节省样品采集时间，在实验中一般将灌流速度控制在1-2μl/min的范围内。实验温度的要求与平衡透析相同。

色谱检测：高效液相具有很高的分离效能，由于中药中含有许多成分，中药提取液通过高效液相会出现许多峰，一般而言，在一种洗脱条件下，一个峰就代表一个成分或者结构相似的几个成分。同时，如果在某种洗脱条件下不能分开的成分，可以换一种洗脱条件将之分开。在实验中用高效液相分别检测药物-蛋白透析液和空白对照药物透析液，比较两者图谱的改变，其图谱中峰面积改变的相对百分比即表明其与蛋白作用的强弱，结合定量分析方法，可以得到中药中各成分的蛋白结合率。复方中药提取物各成分之间与蛋白相互作用有何差异，也可以进一步考察，如：阿魏酸单体，当归提取液中的阿魏酸，当归补血汤提取液中的阿魏酸分别与蛋白作用有何差别，及中药中的其它成分对其是否有协同或拮抗效应，我们可以通过比较它们与蛋白作用后峰面积的改变是否一致来看出中药中其它成分是否对其与蛋白的相互作用有影响。

附图说明

图1-a是当归补血汤在280nm的检测条件下与牛血浆白蛋白结合微透析后与空白药物对照比较图谱；(其中A图谱是空白对比图谱，B图谱是牛血浆白蛋白结合后的图谱，下同)

图1-b是当归补血汤中20个成分蛋白结合率的柱状图。

图2-a是黄芪提取液在280nm的检测条件下与牛血浆白蛋白结合微透析后与空白药物对照比较图谱；

图2-b是黄芪提取液中18个成分蛋白结合率的柱状图。

图3-a是当归提取液在280nm的检测条件下与牛血浆白蛋白结合微透析后与空白药物对照比较图谱；

图3-b是当归提取液中15个成分蛋白结合率的柱状图。

图4-a图4-a是玄参提取液在278nm的检测条件下与牛血浆白蛋白结合微透析后与空白药物对照比较图谱；

图4-b是玄参提取液中6个成分蛋白结合率的柱状图。

注：①各色谱图谱中A图谱为空白药物图谱；B图谱为药物加牛血浆白蛋白混合反应后的图谱

②结合率柱状图中“Binding degree(％)”表示蛋白结合率；“Peaks”表示色谱峰

具体实施方式

                                  实施例1

筛选当归补血汤中的有效成分

当归补血汤由当归和黄芪两味药组成，其临床比例为1∶5。临床上主要用于治疗各种贫血症。该方成分极为复杂，含有多糖，皂苷，黄酮，生物碱，挥发油等多种成分，将其一一制备出来进行活性筛选无疑是一个耗时，费力，效率又低的过程。采用本发明筛选方法可以通过该方中所含药物成分与血浆白蛋白的作用信息—蛋白结合率来对各成分进行活性评价，并从中筛选出可能的有效成分。

当归补血汤的提取：取粉碎当归(市售)5g，黄芪(市售)25g，加入10倍量的70％甲醇浸泡1h，回流提取1h，提取液在50℃条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，剩余部分加入30ml含0.5％二甲基亚砜的pH为7.0的磷酸缓冲液充分溶解，5000rpm/min离心10min，普通滤纸过滤，置-20℃冰箱中保存备用。

牛血浆白蛋白(BSA)的制备：精密称量牛血浆白蛋白冻干粉4.08g，用50ml的磷酸缓冲液(pH7.0)充分溶解，配置成1.2mM/L浓度的牛血浆白蛋白溶液，置4℃冰箱中保存备用。

微透析：将1ml当归补血汤(0.5g/ml)和1ml(1.2mM/L)BSA均匀混合，在25℃环境下静置10h，然后装上微透析装置开始取样，透析膜长度为1cm，透析膜截留分子量为18KD，灌流速度为1μl/min，取样时间为30min，收集透析液，进高效液相进行分析。另外在同等条件下，收集不含BSA的药物透析液。

检测条件：C₁₈色谱柱，Angilent系列高效液相色谱系统，DAD紫外检测器；流动相：乙腈∶水(各含0.1％甲酸)梯度洗脱；检测波长：280nm；流速：0.8ml/min。对能够达到基线分离的峰进行定量分析，计算出各个峰的蛋白结合率。

检测结果：图1-a是当归补血汤与BSA结合后微透析与空白药物对照比较图谱，共对20个峰(成分)进行了定量分析，(21号峰经鉴定为藁本内酯，因为是挥发性成分，经25℃，10h后，含量低于检测限，所以无法进行定量分析)图1-b是当归补血汤中20个成分蛋白结合率的柱状图。从图1-b可以看出蛋白结合率最低的为1号成分(6.93％)，最高的为19号成分(86.6％)，如前所述，药物在体内都会有一个合适的蛋白结合率，既能维持一定的效应强度和时间，又能保证在体内被充分的代谢，药物的蛋白结合率过低或过高都会影响药物在体内的代谢、分布。因此，从药物代谢、分布的角度来看，在中药中的那些蛋白结合率过低或过高的成分就可认为不具有活性(如1号和19号成分)。我们对当归补血汤中的一些成分进行了鉴定，如3号峰(绿原酸)；5号峰(毛蕊异黄酮苷)；6号峰(阿魏酸)；12号峰(芒柄花苷)；16号峰(毛蕊异黄酮)。当归补血汤为金元时代李东垣所创，由黄芪和当归两味药组成，方中黄芪补气生阳，为补气诸药之最，与当归补气和血配伍，则阳生阴长，气血两旺。用于劳倦内伤，气弱血虚等，为益气升阳、补血活血的要方。现代研究表明，当归补血汤能够促进机体免疫功能，能够通过促进造血及改善造血调控，发挥补血作用；能够改善微循环，改善组织细胞的缺血缺氧，发挥活血作用。我们通过蛋白结合率鉴定的这些成分中经文献报道均有与之相关的药理活性，如6号峰(阿魏酸)它能通过促进血虚模型动物骨髓有核细胞DNA合成来促进造血^[1]；5号峰(毛蕊异黄酮苷)、12号峰(芒柄花苷)和16号峰(毛蕊异黄酮)这三种成分能促进血虚模型动物的T淋巴细胞免疫^[2]，能改善脑组织、内皮细胞的缺血、缺氧损伤来发挥活血作用^[3，4]；3号峰(绿原酸)能够抑制自由基引起脂质过氧化损伤，改善血液循环功能^[5]。这些活性成分的蛋白结合率从22.9％到50.1％之间(见图1-b)，因此说明本发明的有效成分活性筛选方法是合理可行的。通过本发明筛选方法还可以发现其它的具有适中蛋白结合率的成分，进行深入研究有可能发现潜在的新药(如8、9、10、13、14、15、20号峰)。

                              实施例2

筛选黄芪提取液的有效成分

黄芪提取液的制备：取粉碎的黄芪20g，加入8倍量90％的乙醇浸泡1h，水浴回流提取1h，提取液在45℃条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，剩余部分加入20mlpH为7.4的醋酸缓冲液充分溶解，4000rpm/min离心10min，普通滤纸过滤，置-20℃冰箱中保存备用。

牛血浆白蛋白(BSA)的制备：同实施例1

微透析：将1ml黄芪提取液(1g/ml)和1ml(1.2mM/L)BSA均匀混合，在25℃环境下静置10h，然后装上微透析装置开始取样，透析膜长度为1cm，透析膜截留分子量为18KD，灌流速度为1μl/min，取样时间为30min，收集透析液，进高效液相进行分析。另外在同等条件下，收集不含BSA的药物透析液。

检测条件：同实施例1

检测结果：图2-a是黄芪提取液与BSA结合后微透析与空白药物对照比较图谱，共对18个峰(成分)进行了定量分析。图2-b是黄芪提取液中18个成分蛋白结合率的柱状图。其中，已鉴定的3个成分，5号峰(毛蕊异黄酮苷)；10号峰(芒柄花苷)；13号峰(毛蕊异黄酮)的蛋白结合率分别为25.7％；36.3％；41.8％。和实施例1当归补血汤中相比毛蕊异黄酮苷的蛋白结合率降低了10.8％；芒柄花苷的蛋白结合率提高了7.1％；毛蕊异黄酮的蛋白结合率降低了8.3％。说明在实施例1中当归中的某些成分产生了蛋白结合的“协同”或“拮抗”效应，从而使黄芪某些成分的蛋白结合率提高(协同效应)或降低(竞争效应)。第6、7、11、12、14、15、16号峰(成分)的蛋白结合率适中，是可能具有活性的成分。

                                 实施例3

筛选当归提取液的有效成分

当归提取液：取粉碎的当归10g，加入15倍量水浸泡1h，100℃油浴回流提取1h，提取液在50℃条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，剩余部分加入5ml pH为7.0的磷酸缓冲液充分溶解，4000rpm/min离心10min，普通滤纸过滤，置-20℃冰箱中保存备用。

牛血浆白蛋白(BSA)的制备：同实施例1

微透析：将1ml当归提取液(0.2g/ml)和1ml(1.2mM/L)BSA均匀混合，在25℃环境下静置10h，然后装上微透析装置开始取样，透析膜长度为1cm，透析膜截留分子量为18KD，灌流速度为1μl/min，取样时间为30min，收集透析液，进高效液相进行分析。另外在同等条件下，收集不含BSA的药物透析液。

检测结果：图3-a是当归提取液与BSA结合后微透析与空白药物对照比较图谱，共对15个峰(成分)进行了定量分析。图3-b是当归提取液中15个成分蛋白结合率的柱状图。其中，已鉴定的2个成分，3号峰(绿原酸)和8号峰(阿魏酸)的蛋白结合率分别为：38.7％和46.1％。和实施例1当归补血汤中相比，绿原酸的蛋白结合率提高了15.8％，阿魏酸的蛋白结合率提高了9.9％，说明在实施例1中黄芪中的某些成分产生了蛋白结合的“拮抗”效应，第5、6、11、13、14、15号峰(成分)的蛋白结合率适中，是可能具有活性的成分。

                               实施例4

筛选玄参提取液中的有效成分

玄参提取液的制备：将1g玄参粉碎后，用25ml甲醇溶液(30％)冷浸1h后，超声30min，提取液滤纸过滤后在60℃条件下用旋转蒸发仪除掉溶剂，用pH为7.0的磷酸缓冲液溶解并定溶到10ml，置-20℃冰箱中保存备用。

牛血浆白蛋白(BSA)的制备：同实施例1

平衡透析：取长约7cm的分子截留量为12000的透析袋一个，将一端用细线扎紧。加入1ml玄参提取液和1mlBSA溶液，然后将另一端扎紧。放入一个装有8mlpH为7.0的磷酸缓冲液中的试管中，在25℃环境下静置10h使透析袋内外达到平衡，另外在同等条件下，取1个透析袋做平行空白对照。

检测条件：C₁₈色谱柱，Angilent系列高效液相色谱系统，单波长紫外检测器；流动相：乙腈(含1％醋酸)∶水(梯度洗脱；检测波长：278nm；流速：1ml/min。对能够达到基线分离的峰进行定量分析，计算出各个峰的蛋白结合率。

检测结果：

图4-a是玄参提取液与BSA结合后微透析与空白药物对照比较图谱，共对6个峰进行了定量分析，图4-b是玄参提取液中6个成分蛋白结合率的柱状图。我们对玄参提取液中的一些成分进行了鉴定，如2号峰(阿克替苷)；4号峰(安格洛苷)；5号峰(肉桂酸)；6号峰(哈巴俄苷)。玄参属清热解毒类中药，具有凉血滋阴、泻火解毒的功效，现在研究表明玄参具有抗菌、抗炎、抗血小板凝集等作用。我们鉴定的这些成分中经文献报道均有不同的药理活性，如2号峰(阿克替苷)和6号峰(哈巴俄苷)具有抗炎活性^[6，7]；4号峰(安格洛苷)具有抗血小板凝集的作用^[8]；5号峰(肉桂酸)具有抗菌活性^[9]。2号峰(阿克替苷)、4号峰(安格洛苷)、5号峰(肉桂酸)和6号峰(哈巴俄苷)的蛋白结合率分别为34.6％，15.2％，59.8％和26.9％。

药理活性报道的部分文献：

[1]宁炼，陈长勋，金若敏等.当归补血汤促进造血功能的成分及其作用的研究.中国中药杂志，2002，27(1)：50-53

[2]王燕平，李晓玉，宋纯清等.当归补血汤中不同组分对正常及血虚小鼠免疫功能的影响中草药，2002，33(2)：135-137

[3]李晨旭，卢景芬，古力努尔等.补阳还五汤及其有效成分体外给药对脑细胞膜流动性的影响，中国药学杂志，2001，36(8)：528-531

[4]Yi Fan，Da-Zheng Wu，Yan-Qing Gong et al Effects of calycosin on the impairmentof barrier function induced by hypoxia in human umbilical vein endothelial cells，European Journal of Pharmacology，81(2003)33-40

[5]Kono Y，Kashine S，Yoneyama T，Sakamoto Y，Iron chelation by chlorogenic acid as a naturalantioxidant，Biosci.Biotech.Biochem，62(1998)22-27.

[6]杨芳艳，蒲小平.类叶升麻苷对鱼藤酮致SH-SY5Y细胞凋亡的保护作用.中国药理学通报，2006，22(2)：159-164

[7]B.L.Fiebich，M.Heinrich，K.-O.Hiller et al Inhibition of TNF-a synthesis in LPS-stimulatedprimary human monocytes by Harpagophytum extract SteiHap 69，Phytomedicine，.8(2001)28-30

[8]黄才国，李医明，贺祥等.玄参中苯丙素苷XS-8对兔血小板cAMP和兔血浆中PGI₂/TXA₂的影响.第二军医大学学报，2004，25(8)：920-921

[9]张春乐，宋康康，陈祥仁等.肉桂酸及其衍生物的抑菌活性研究，厦门大学学报(自然科学版)，2006，45：16-18。

Claims (6)

1、一种中药有效成分的筛选方法，包括：

a、将待测的中药提取液和血浆白蛋白溶液混合，通过平衡透析或微透析取样并收集反应透析液；

b、在与上述步骤相同的条件下，将待测的中药提取液和不含血清白蛋白空白的溶液混合均匀，通过平衡透析或微透析取样收集空白透析液；

c、将上述反应透析液和空白透析液在相同的条件下进行高效液相色谱分析；

d、计算出各药物成分的蛋白结合率。

2、权利要求1的筛选方法，其中提取中药的溶剂选自水、C₁-C₅的低级醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚，或它们的混合物。

3、权利要求2的筛选方法，其中提取中药的溶剂是水和/或乙醇。

4、权利要求1的筛选方法，其中血浆白蛋白选自人血浆白蛋白或牛血浆白蛋白。

5、权利要求1的筛选方法，其中中药提取液中含有提取液0.1-3％体积的增溶剂。

6、权利要求5的筛选方法，其中增溶剂选自吐温、二甲基亚砜、聚乙二醇、曲拉通或它们的混合物。

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