CN103239506B - 通脉口服液原料药提取物 - Google Patents

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CN103239506B CN201310210235.9A CN201310210235A CN103239506B CN 103239506 B CN103239506 B CN 103239506B CN 201310210235 A CN201310210235 A CN 201310210235A CN 103239506 B CN103239506 B CN 103239506B
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Abstract

本发明提供了通脉口服液原料药提取物,其特征在于:通脉口服液原料药配比为:丹参:葛根:川芎=1:1:1;所述原料药提取物中,有效成分含量重量比如下:丹参素:葛根素:阿魏酸:丹参酮IIA=(0.9~1.3):(1.0~1.3):(1.0~1.2):1.0。本发明中以醇、水为溶剂,对通脉口服液原料药进行合并提取,虽然对有效成分的提取效率不及60%醇提,然而,该方法制备的原料药提取物,药效活性明显优于原制剂工艺以及有效成分含量最高的60%醇提物,取得了意料不到的技术效果,为心脑血管疾病患者带来了福音。

Description

通脉口服液原料药提取物
技术领域
本发明涉及通脉口服液原料药提取物及其制备方法和用途。
背景技术
通脉口服液由丹参、川芎、葛根三味药组成,功能活血通脉,用于缺血性心脑血管疾病,动脉硬化,脑血栓,脑缺血,冠心病,心绞痛的治疗,收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二十册。通脉口服液组方经典、药味精炼、剂量充分、疗效肯定,然而众多原因导致其市场占有率不甚理想,阻碍了成长为中成药大品种的步伐。
通脉方具有活血通脉的功效,临床上主要用于治疗缺血性心脑血管疾病、动脉硬化、冠心病等。据文献报道,通脉口服液的有效成分主要为三种药材所含有的水溶性成分,如丹参素、阿魏酸、葛根素等。然而,现代研究表明,丹参治疗心脑血管疾病的药效物质基础主要为脂溶性的菲醌类成分(丹参酮ⅡA、隐丹参酮等)和水溶性的酚酸类成分(丹参素、丹参酚酸B等)。丹参酮ⅡA能增加冠脉血流量,改善缺氧后引起的心肌代谢紊乱,从而提高心肌耐缺氧的能力。丹参素具有显著扩张冠状动脉,增加冠脉血流量,降低心肌耗氧量和增加心肌收缩力的作用。另外,川芎所含有的有效成分主要分为三类:以川芎嗪为代表的含氮化合物,以藁本内酯为主的苯肽类和以阿魏酸为代表的有机酸类成分,其中川芎嗪和藁本内酯易溶于乙醇等有机溶剂,而阿魏酸易溶于水。川芎嗪具有扩张冠状动脉、增加动脉血流量,松弛血管平滑肌的药理作用,阿魏酸能抑制血小板聚集、抗血栓、解除血管平滑肌痉挛,并能改善心肌缺血。
因此,发明人从现有技术推断得出初步结论:通脉口服液现行的制备工艺存在一定的缺陷,它只强调了三种药材的水溶性成分,而忽略了丹参酮ⅡA、藁本内酯等脂溶性的有效成分。为了提高中药材资源的利用率,增强原有制剂的药效活性,亟待一种通脉口服液原料药的提取新方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种药效活性更好的通脉口服液原料药提取物及其制备方法和用途。
本发明提供了一种通脉口服液原料药提取物,其中,通脉口服液原料药提取物,其特征在于:通脉口服液原料药配比为:丹参:葛根:川芎=1:1:1;所述原料药提取物中,有效成分含量重量比如下:丹参素:葛根素:阿魏酸:丹参酮IIA=(0.9~1.3):(1.0~1.3):(1.0~1.2):1.0。
进一步地,所述原料药提取物中,含有如下重量百分比的有效成分:
丹参素1.5~2.4%,葛根素1.4~2.5%,阿魏酸1.3~2.5%,丹参酮IIA1.1~2.4%。
优选地,经高效液相色谱检测后,所述原料药提取物的色谱图中,丹参素色谱峰保留时间为5.7±0.2min,葛根素色谱峰保留时间为11.8±0.2min,阿魏酸色谱峰保留时间为19.7±0.2min,丹参酮IIA色谱峰保留时间为51.9±0.2min;
色谱条件如下:
色谱柱:十八烷基键合硅胶柱;
检测波长:280nm;
柱温:30°C;
流速:1.0ml/min;
流动相:以乙腈-0.1%冰醋酸水溶液梯度洗脱,洗脱程序如下:
优选地地,所述原料药提取物的色谱图如图14所示。
本发明还提供了上述通脉口服液原料药提取物的制备方法,它包括如下操作步骤:
(1)按重量配比称取原料药:丹参、川芎、葛根;
(2)将原料药混匀,依次以70~95%v/v乙醇、40~60%v/v乙醇、水提取,合并各提取产物,即得原料药提取物。
进一步地,步骤(2)中,依次以85~95%v/v乙醇、50~60%v/v乙醇、水提取。
更近一步地,步骤(2)中,依次以95%v/v乙醇、50%v/v或60%v/v乙醇、水提取。
优选地,步骤(2)的提取工艺具体操作如下:先加入原料药重量20~40倍体积的70~95%v/v乙醇,加热回流1h,药渣再加原料药重量20~40倍体积的40~60%v/v乙醇,加热回流1小时,药渣最后加入原料药重量20~40倍体积的水,煎煮2小时。
本发明还提供了上述通脉口服液原料药提取物在制备预防或治疗心肌缺血或脑缺血的药物中的用途。
进一步地,所述药物是改善心肌缺血所致心肌损伤的药物。
进一步地,所述药物是改善脑缺血所致脑组织损伤的药物。
本发明工艺以醇、水为溶剂,对通脉口服液原料药进行合并提取,虽然对有效成分的提取效率不及50~70%醇提,然而,该方法制备的原料药提取物,药效活性明显优于原制剂工艺以及有效成分含量最高的70%醇提物,取得了意料不到的技术效果,为心脑血管疾病患者带来了福音。
附图说明
图1丹参素对照品(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图2葛根素对照品(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图3阿魏酸对照品(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图4盐酸川芎嗪对照品(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图5丹参酚酸B对照品(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图6丹参酮IIA对照品(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图7混合对照品(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图8川芎药材(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图9葛根药材(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图10丹参药材(A)及供试品溶液(B)的HPLC-DAD色谱图
图11提取工艺2(A)及提取工艺1(B)的HPLC-DAD色谱图
图12提取工艺1(A)、提取工艺2(B)和复方丹参片(C)的HPLC-DAD色谱图
图13提取工艺1(A)、提取工艺2(B)和通脉口服液(C)的HPLC-DAD色谱图
图14本发明原料药提取物的HPLC色谱图。
具体实施方式
实施例1本发明原料药提取物的制备
取丹参、葛根和川芎药材各10g(1:1:1),混匀,加入95%v/v乙醇300mL,加热回流1h,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣加50%v/v乙醇300mL,加热回流1小时,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣再加水300mL,煎煮2小时,煎液滤过,蒸干,将三种浸膏合并,即得本发明原料药提取物。
实施例2本发明原料药提取物的制备
取丹参、葛根和川芎药材各10g(1:1:1),混匀,加入70%v/v乙醇400mL,加热回流1h,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣加40%v/v乙醇300mL,加热回流1小时,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣再加水300mL,煎煮2小时,煎液滤过,蒸干,将三种浸膏合并,即得本发明原料药提取物。
实施例3本发明原料药提取物的制备
取丹参、葛根和川芎药材各10g(1:1:1),混匀,加入85%v/v乙醇200mL,加热回流1h,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣加60%v/v乙醇200mL,加热回流1小时,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣再加水200mL,煎煮2小时,煎液滤过,蒸干,将三种浸膏合并,即得本发明原料药提取物。
实施例4本发明制备方法的筛选
一、以有效成分作参考进行筛选
1.试验仪器与材料
1.1仪器、试剂
安捷伦1200系列高效液相色谱仪(美国安捷伦公司),配置:四元泵(G1354A),在线真空脱气机(G1322A/G1379B),标准自动进样器(G1329A),二极管阵列检测器(G1315B/C),仪器控制及数据处理系统(AgilentChemstation),HT-340K柱温箱。
Sartorius BP121s电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);AS10200超声波清洗器(天津奥特赛斯仪器有限公司);W201恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司);ULUP-I-10T优普超纯水机(成都超纯科技有限公司);
乙腈为色谱纯(Fisher),水为超纯水,其余试剂均为分析纯。
1.2试药
川芎、葛根和丹参药材均购于成都市国际商贸城荷花池中药材专业市场。
通脉口服液购于成都宝元堂大药房(生产厂家:湖南中南科伦药业有限公司),复方丹参片购于成都金牛区蓉乐大药房(生产厂家:广州白云山和记黄埔中药有限公司)。
丹参素对照品(批号:D-014-120706);丹参酚酸B对照品(批号:D-012-120629)购自成都瑞芬思生物科技有限公司。
阿魏酸对照品(批号:0773-9708,供含量测定用)、葛根素对照品(批号:0752-9806,供含量测定用)、丹参酮IIA对照品(批号:10766-200314,供含量测定用)和盐酸川芎嗪对照品(批号:110817-200305,供含量测定用)均购自中国药品生物制品检定所;
2.方法与结果
2.1样品制备
(1)原工艺:取丹参、葛根和川芎药材各10g(1:1:1),以上三味,加水煎煮二次,第一次1.5小时,第二次1小时,合并煎液,滤过,滤液浓缩至相对密度1.18~1.22(50℃),放冷,加乙醇使含醇量达65%。冷藏48小时,滤过,滤液回收乙醇至无醇味,并浓缩至相对密度为1.10~1.14(50℃)(通脉提取物A)。
(2)新工艺①:取丹参、葛根和川芎药材各10g(1:1:1),混匀,加入乙醇300mL,加热回流1h,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣加40%乙醇300mL,加热回流1小时,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣再加水300mL,煎煮2小时,煎液滤过,蒸干,将三种浸膏合并,备用。(通脉提取物B1)。
新工艺①:取丹参、葛根和川芎药材各10g(1:1:1),混匀,加入乙醇300mL,加热回流1h,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣加50%乙醇300mL,加热回流1小时,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣再加水300mL,煎煮2小时,煎液滤过,蒸干,将三种浸膏合并,备用。(通脉提取物B2)。
新工艺①:取丹参、葛根和川芎药材各10g(1:1:1),混匀,加入乙醇300mL,加热回流1h,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣加60%乙醇300mL,加热回流1小时,提取液滤过,滤液回收乙醇并浓缩至适量。药渣再加水300mL,煎煮2小时,煎液滤过,蒸干,将三种浸膏合,备用。(通脉提取物B3)。
(3)新工艺②:取丹参、川芎、葛根药材各10g(1:1:1),混匀,加入50%乙醇300mL,加热回流1小时,重复提取三次,提取液滤过,合并,滤液回收乙醇并浓缩至浸膏(通脉提取物C1)。
新工艺②:取丹参、川芎、葛根药材各10g(1:1:1),混匀,加入60%乙醇300mL,加热回流1小时,重复提取三次,提取液滤过,合并,滤液回收乙醇并浓缩至浸膏(通脉提取物C2)。
新工艺②:取丹参、川芎、葛根药材各10g(1:1:1),混匀,加入70%乙醇300mL,加热回流1小时,重复提取三次,提取液滤过,合并,滤液回收乙醇并浓缩至浸膏(通脉提取物C3)。
2.2色谱条件的考察
2.2.1流动相的选择
主要考查了乙腈-水、甲醇-0.1%冰乙酸、乙腈-0.1%冰乙酸等流动相系统。结果表明,乙腈-0.1%冰乙酸系统最好,能使主要色谱峰的分离度提高,峰形良好,故最终确定流动相系统为:A泵:乙腈;B泵:0.1%冰乙酸水溶液。2.2.2色谱柱的选择
考察了Welchrom C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)和XtimateTM C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),按拟定的色谱条件使用二种色谱柱对同一样品进行分析,根据具体的分离情况,最终选择XtimateTM C18色谱柱。
2.2.3梯度洗脱条件的优化
在确定了流动相的组成后,考察了梯度洗脱程序。以10%乙腈为起始比例,以75%乙腈为结束比例。以主要色谱峰的分离度为评价标准,最终确定了最佳的梯度洗脱条件。
2.2.4检测波长的选择
采用二极管阵列检测器(DAD)做全波长扫描,考察不同吸收波长下的指纹图谱。参考相应文献,重点考察了254nm、280nm和320nm处的谱图特征。结果表明254nm处部分色谱峰(如阿魏酸)缺失,320nm处后段色谱峰(如丹参酮IIA)有缺失。而在280nm处各成分具有较好的紫外吸收,色谱信息最为丰富,因此选择280nm为指纹图谱的检测波长。
2.2.5最终采用的色谱条件
根据上述研究结果,确定最佳色谱条件为:XtimateTM C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);检测波长:280nm;柱温:30°C;流速:1.0mL/min;进样量:10μL;采样时间:60min;流动相:A相为乙腈,B相为0.1%冰醋酸水溶液,进行二元梯度洗脱,洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序
2.3供试品溶液的制备
(1)提取工艺1:
取通脉提取物B1~3,精密称定,置于锥形瓶中,精密加入甲醇溶液50mL,密塞,称定重量,超声提取30min,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,过0.45μm微孔滤膜,即得供试品溶液。
(2)提取工艺2:
取通脉提取物C1~3,精密称定,置于锥形瓶中,精密加入甲醇溶液50mL,密塞,称定重量,超声提取30min,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,过0.45μm微孔滤膜,即得供试品溶液。
(3)通脉口服液原工艺:
取通脉提取物A,精密称定,置于锥形瓶中,精密加入甲醇溶液50mL,密塞,称定重量,超声提取30min,取出,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,过0.45μm微孔滤膜,即得供试品溶液3.色谱峰的定性鉴别及信号归属
3.1对照品对照进行信号鉴别
以“提取工艺1”的供试品溶液为研究对象。
对照品溶液的制备:取丹参素、葛根素、丹参酚酸B、盐酸川芎嗪、阿魏酸、丹参酮IIA对照品适量,分别加甲醇制成一定浓度的溶液,即得各对照品溶液。在上述色谱条件下进行供试品溶液色谱峰的定性鉴别,进样量为10μL。鉴定结果分别见下面的图1-图7。
(1)丹参素
结果:供试品溶液(提取工艺1)HPLC图谱的5.780min峰定性为丹参素。
(2)葛根素
结果:供试品溶液(提取工艺1)HPLC图谱的11.807min峰定性为葛根素。
(3)阿魏酸
结果:供试品溶液(提取工艺1)HPLC图谱的19.673min峰定性为阿魏酸。
(4)盐酸川芎嗪
结果:供试品溶液(提取工艺1)中没有检出盐酸川芎嗪,这可能是由于该成分在供试品溶液中含量太低没有达到检测限。
(5)丹参酚酸B
结果:供试品溶液(提取工艺1)中丹参酚酸B的峰形矮胖,不对称。查阅相关文献,发现这与流动相加入的酸有关。因此,为了兼顾定性定量其他四个成分,本研究舍弃丹参酚酸B,不做分析。
(6)丹参酮IIA
结果:供试品溶液(提取工艺1)HPLC图谱的51.942min峰定性为丹参酮IIA。
(7)混合对照品
结果:供试品溶液(提取工艺1)HPLC图谱的5.780min峰定性为丹参素、11.807min峰定性为葛根素、19.673min峰定性为阿魏酸、51.942min峰定性为丹参酮IIA。
3.2单味药材对照进行信号归属
川芎药材供试品溶液的制备:取川芎药材粉末1.0g,精密称定,加入70%甲醇溶液50mL,室温下超声提取30min,滤过,取续滤液,过0.45μm微孔滤膜,即得川芎药材供试品溶液。
葛根药材供试品溶液的制备:取葛根药材粉末1.0g,精密称定,加入70%甲醇溶液50mL,室温下超声提取30min,滤过,取续滤液,过0.45μm微孔滤膜,即得葛根药材供试品溶液。
丹参药材供试品溶液的制备:取丹参药材粉末1.0g,精密称定,加入70%甲醇溶液50mL,室温下超声提取30min,滤过,取续滤液,过0.45μm微孔滤膜,即得丹参药材供试品溶液。
(1)供试品溶液(提取工艺1)与川芎药材对照
结果:供试品溶液(提取工艺1)HPLC图谱中主要有5个峰来自于川芎药材,包括阿魏酸及藁本内酯等低极性的苯肽类成分(见图8)。
(2)供试品溶液(提取工艺1)与葛根药材对照
结果:供试品溶液(提取工艺1)HPLC图谱中主要有4个峰来自于葛根药材,如葛根素(见图9)。
(3)供试品溶液(提取工艺1)与丹参药材对照
结果:供试品溶液(提取工艺1)HPLC图谱中主要有5类峰来自于丹参药材,包括丹参素、丹参酚酸类成分、丹参酮IIA及几个脂溶性成分(见图10)。
4.不同提取工艺条件下通脉口服液HPLC图谱的比较与分析
4.1直观分析
(1)提取工艺1和提取工艺2的比较
结果:提取工艺1和工艺2的色谱图轮廓非常相似。提取工艺1以乙醇-50%乙醇-水分别回流提取,因此即保留了三味药材的水溶性成分,又提取了脂溶性成分,而提取工艺2是以60%乙醇回流提取三次。从图11的结果来看,提取工艺1和提取工艺2差别不大,均得到了良好的提取效果。
(2)提取工艺1、提取工艺2和复方丹参片比较
从图12可以看出,提取工艺1、提取工艺2与复方丹参片的色谱图有相似之处,均含有丹参素、丹参酚酸类、丹参酮IIA等丹参药材中含有的有效成分。当然,由于复方丹参片的处方不同,其余色谱峰有明显的差别。但是通过三者的比较研究,可以发现提取工艺1、工艺2和复方丹参片的提取效果一样,均能获得丹参药材中的脂溶性和水溶性成分。
(3)提取工艺1、提取工艺2和通脉口服液的比较
从图13可以看出,通脉口服液与提取工艺1和提取工艺2的色谱图有明显的差异。通脉口服液中丹参素和葛根素的含量与其他两组差别不大,但阿魏酸含量明显更低。另外,通脉口服液的后半段色谱峰基本缺失,表明不含有丹参酮IIA、隐丹参酮、藁本内酯等脂溶性成分。显然,这与通脉口服液的制备工艺息息相关。通脉口服液主要采用水煎煮工艺,因此提取了丹参、葛根和川芎药材中的水溶性成分,而没有提取三种药材的脂溶性成分。
提取工艺1和提取工艺2的色谱峰最为全面,包括了三种药材的水溶性成分和脂溶性成分。其中脂溶性成分主要来自于川芎和丹参药材,如川芎药材含有的藁本内酯等苯肽类有效成分及丹参药材含有的丹参酮IIA等有效成分。
4.2不同提取工艺条件下的四种有效成分含量比较研究
分别精密称取丹参素、葛根素、阿魏酸和丹参酮IIA对照品适量,置于不同的量瓶中,以甲醇溶液溶解并稀释至刻度,摇匀,得各对照品储备液(浓度依次为0.38、1.25、0.45、0.61mg/mL)。分别精密吸取上述丹参素储备液5mL、葛根素储备液5mL、阿魏酸储备液8mL、丹参酮IIA储备液6mL于50mL量瓶中,加甲醇溶液定容至刻度,作为混合对照品溶液。
精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各10μL,在上述色谱条件下进样测定,记录峰面积,按外标法计算不同样品中丹参素、葛根素、阿魏酸和丹参酮IIA的含量,结果见表2。
表2四种有效成分的含量比较(mg/g)
结果表明,丹参、葛根和川芎药材(混合比例1:1:1)在不同的制备工艺条件下,其有效成分(丹参素、葛根素、阿魏酸和丹参酮IIA)的含量有明显的差异。丹参素平均含量:新工艺②>新工艺①>原工艺;葛根素平均含量:新工艺②>新工艺①>原工艺;阿魏酸平均含量:新工艺②>新工艺①>原工艺;丹参酮IIA平均含量:新工艺②>新工艺①>原工艺。
其中有两点值得特别注意:
(1)通脉口服液不含有脂溶性的丹参酮IIA成分;并且水溶性的阿魏酸成分含量也较低。
(2)工艺1中,虽然采用不同浓度的醇、水进行提取,但其提取物中有效成分含量却低于工艺2。上述实验表明,从有效成分含量来看,采用50~70%乙醇溶剂对通脉口服液原料药的提取效果最好,工艺1的提取方法次之。
二、以药效试验作参考进行筛选
由“一”项中研究内容可知,工艺2对各药材有效成分的提取率最高,工艺1次之。但有效成分的有效溶出能否增强通脉的药理作用,仍需要通过药理实验加以验证。
本实验拟采用小鼠缺血性心脏病模型和大鼠缺血性脑病模型对不同工艺制备的通脉样品药理作用强弱加以对比,旨在找出最佳的原料药提取工艺。
1对小鼠缺血性心脏病的影响
1.1受试药物
通脉提取物A。
通脉提取物B1。
通脉提取物B2。
通脉提取物B3。
通脉提取物C1。
通脉提取物C2。
通脉提取物C3。
复方丹参片:批号D2A025,生产厂家:广州白云山和记黄埔中药有限公司生产。
1.2实验动物
KM小鼠,SPF级,♀/♂各半,体重18.5~22.5g,由成都达硕生物科技有限公司提供,实验动物质量合格证号:scxkc(111)2008-24。
SD大鼠,SPF级,♀/♂各半,体重180~220g,由成都达硕生物科技有限公司提供,实验动物质量合格证号:scxkc(111)2008-24。
1.3实验仪器
▲Thermo全功能酶标仪,BIS-2113,美国Thermo Fisher Scientific仪器有限公司生产。
▲恒温摇床:QYC-200型,上海福玛仪器有限公司。
▲低温离心机:TG2-16C型,上海安亭科学仪器厂。
▲电热恒温水浴锅:型号SK12-6,浙江宁波医疗器械厂。
▲AS10200超声波清洗器(天津奥特赛斯仪器有限公司)。
▲W201恒温水浴锅(上海申顺生物科技有限公司)。
▲ULUP-I-10T优普超纯水机(成都超纯科技有限公司)。
1.4试剂盒
Mice ATP Elisa试剂盒:批号:121028,购于上海生物工程技术有限公司。
Rats Glu Elisa试剂盒,批号:121015,购于上海生物工程技术有限公司。
Rats Asp Elisa试剂盒,批号:121026,购于上海生物工程技术有限公司。
Rats GABA Elisa试剂盒,批号:121020,购于上海生物工程技术有限公司。
1.5统计方法
用SPSS17.0软件进行统计分析。数据以均数±标准差表示,组间采用单因素方差分析,方差齐者组间进行LSD检验,方差不齐者进行Tamhane’s T2检验。
1.6实验内容与方法
1.6.1实验分组及给药
KM小鼠按体重随机分为10组,每组10只,分别作为:①模型对照组:等体积纯净水;②通脉提取物A组:7.5g·kg-1;③通脉提取物B1组:7.5g·kg-1;④通脉提取液B2组:7.5g·kg-1;⑤通脉提取物B3组:7.5g·kg-1;⑥通脉提取物C1组:7.5g·kg-1;⑦通脉提取液C2组:7.5g·kg-1;⑧通脉提取物C3组:7.5g·kg-1;⑨阳性组(复方丹参片):3.6g·kg-1。另按体重随机称取10只正常小鼠作为正常对照组⑩:等体积纯净水。每组小鼠每天灌胃1次,连续7天。
1.6.2小鼠心肌缺血模型复制方法
实验第6d开始,除空白组外,其余各组小鼠按3mg/kg剂量腹腔注射异丙肾上腺素,连续两天。空白组小鼠腹腔注射给予同等剂量生理盐水。
1.1.3检测指标
①心肌代谢指标测定:小鼠心脏穿刺采集血液,4000r·min-1离心10min,收集上清液,Elisa法测定血浆中ATP含量。
②心肌组织损伤指数:将各实验组小鼠心肌组织显微镜观察结果进行等级评分,作为药物治疗心肌缺血等疗效的量化指标,结果以心肌组织损伤指数计。
1.2实验结果
1.2.1对小鼠血浆ATP含量的影响
结果见表3。
表3各实验组小鼠血浆中ATP含量
注:与模型组比较:**P<0.01;*P<0.05;与提取物A组比较:△△P<0.01,△P<0.05。
由表3可知,与模型组比较,通脉提取物B1、B2及B3组小鼠血浆ATP含量均有极显著升高(P<0.01),通脉提取物C1、C2及C3组显著升高(P<0.05);与通脉提取物A比较,提取物B1、B2和B3组小鼠血浆ATP含量均有显著升高(P<0.05)。提取物B1、B2和B3组小鼠血浆ATP含量组间比较无统计学意义;与通脉提取物A组比较,提取物C1、C2和C3组小鼠血浆ATP含量无统计学意义。
1.2.2对小鼠心肌组织损伤指数的影响
结果见表4。
心肌组织显微镜检查评分标准:0分:无坏死性损伤或炎症;1分:血管轻度扩张、水肿;2分:血管扩张,组织炎性浸润,轻度坏死;3分:严重坏死,血管严重扩张,淋巴滤泡增生。
表4各实验组小鼠心肌组织损伤指数
注:与模型组比较:**P<0.01;*P<0.05;与提取物A组比较:△△P<0.01,△P<0.05。
由表4可知,与模型组比较,通脉提取物B1、B2、B3、C1、C2及C3组小鼠心肌病理损伤指数均有显著减小(P<0.05);与通脉提取物A比较,提取物B1、B2和B3组小鼠心肌病理损伤指数均有显著减小(P<0.05);提取物B1、B2和B3组小鼠心肌病理损伤指数组间比较无统计学意义。与通脉提取物A比较,提取物C3组小鼠心肌病理损伤指数有显著减小(P<0.05),提取物C1和C2组无统计学意义。
2对大鼠缺血性脑病的影响
2.1实验内容与方法
2.1.1实验分组及给药
SD大鼠按体重随机分为10组,每组10只,分别作为:①模型对照组:等体积纯净水;②通脉提取物A组:4.5g·kg-1;③通脉提取物B1组:4.5g·kg-1;④通脉提取液B2组:4.5g·kg-1;⑤通脉提取物B3组:4.5g·kg-1;⑥通脉提取物C1组:4.5g·kg-1;⑦通脉提取液C2组:4.5g·kg-1;⑧通脉提取物C3组:4.5g·kg-1;⑨阳性组(复方丹参片):2.16g·kg-1。另按体重随机称取10只正常小鼠作为正常对照组⑩:等体积纯净水。每组小鼠每天灌胃1次,连续7天。
2.2.2大鼠脑缺血模型复制方法
实验第7天给药后1h,各实验组大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35g/kg)麻醉,分离右侧颈总动脉,除空白组外,其余各组大鼠以5号针头向头部方向进针注射花生四烯酸0.5mg·kg-1,空白组注射同等剂量生理盐水。10min后,注入0.2%伊文思兰100g体重0.5mL,再过5min后,由右颈总动脉插管采血3mL,加入装有0.3m的2%EDTA-Na2的塑料试管,即刻混匀,于4℃保存。然后迅速断头,取大脑备用。
2.2.3检测指标
①神经递质:取脑组织,以生理盐水为匀浆介质,4000r·min-1离心15min,收集上清液,Elisa法测定血浆中谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)含量。
②大脑组织损伤指数:将各实验组大鼠脑组织显微镜观察结果进行等级评分,作为药物治疗脑缺血等疗效的量化指标,结果以脑组织损伤指数计。
2.2实验结果
2.2.1对大鼠缺血性脑组织Glu含量的影响
结果见表5。
表5各实验组大鼠脑组织Glu含量
注:与模型组比较:**P<0.01;*P<0.05;与提取物A组比较:△△P<0.01,△P<0.05。
由表5可知,与模型组比较,通脉提取物B2和B3组大鼠脑组织Glu含量均有极显著减小(P<0.01),B1组有显著减小;C1、C2及C3组有显著减小(P<0.05);提取物A组无统计学意义;与通脉提取物A比较,通脉提取物B1、B2和B3组大鼠脑组织Glu含量均有显著减小(P<0.05),提取物B1、B2和B3组大鼠脑组织Glu含量组间比较无统计学意义;与通脉提取物A比较,通脉提取物C2和C3组大鼠脑组织Glu含量有显著减小。
2.2.2对大鼠缺血性脑组织Asp含量的影响
结果见表6。
表6各实验组大鼠脑组织Asp含量
注:与模型组比较:**P<0.01;*P<0.05;与提取物A组比较:△△P<0.01,△P<0.05。
由表6可知,与模型组比较,通脉提取物B1、B2及B3组大鼠脑组织Asp含量均有极显著减小(P<0.01);C1、C2及C3组有显著减小(P<0.05);提取物A组无统计学意义;与通脉提取物A比较,提取物B1、B2和B3组大鼠脑组织Asp含量均有极显著减小(P<0.01),提取物B1、B2和B3组大鼠脑组织Asp含量组间比较无统计学意义。与通脉提取物A比较,提取物C1、C2和C3组大鼠脑组织Asp含量有显著减小(P<0.05)。
2.2.3对大鼠缺血性脑组织GABA含量的影响
结果见表7。
表7各实验组大鼠脑组织GABA含量
注:与模型组比较:**P<0.01;*P<0.05;与提取物A组比较:△△P<0.01,△P<0.05。
由表7可知,与模型组比较,通脉提取物B1、B2及B3组大鼠脑组织GABA含量均有极显著增大(P<0.01),通脉提取物C1、C2和C3组大鼠脑组织GABA含量有显著增大(P<0.05);提取物A组无统计学意义;与通脉提取物A比较,提取物B1、B2和B3组大鼠脑组织GABA含量均有极显著增大(P<0.01),提取物B1、B2和B3组大鼠脑组织GABA含量组间比较无统计学意义;与通脉提取物A比较,提取物C1、C2和C3组大鼠脑组织GABA含量有显著增大(P<0.05)。
2.2.5对大鼠脑组织损伤指数的影响
结果见表10。
脑组织显微镜检查评分标准:0分:无坏死性损伤、水肿或炎症;1分:脑组织轻度坏死、水肿;2分:脑组织中度坏死,水肿及组织炎性浸润;3分:脑组织严重坏死,炎细胞浸润,淋巴滤泡增生。
表10各实验组大鼠脑组织损伤指数
注:与模型组比较:**P<0.01;*P<0.05;与提取物A组比较:△△P<0.01,△P<0.05。
由表7可知,与模型组比较,通脉提取物B2和B3组大鼠脑组织病理损伤指数均有极显著减小(P<0.01),B1组有显著减小(P<0.05);通脉提取物C1、C2和C3大鼠脑组织病理损伤指数有显著减小(P<0.05);组提取物A组无统计学意义;与通脉提取物A比较,通脉提取物B2和B3组大鼠脑组织病理损伤指数均有极显著减小(P<0.01),B1组有显著减小(P<0.05);提取物B1、B2和B3组大鼠脑组织病理损伤指数组间比较无统计学意义;与通脉提取物A比较,通脉提取物C1、C2和C3组大鼠脑组织病理损伤指数均有显著减小(P<0.05)。
三、实验小结
本实验通过两种不同制备工艺制备了通脉方提取物,采用HPLC法对两种不同提取物中丹参素、葛根素、阿魏酸和丹参酮IIA的含量进了测定,并采用小鼠心肌缺血模型和大鼠脑缺血模型对这两种工艺制备的通脉提取物的药理作用进行比较,结果表明:
(1)通脉口服液不含有脂溶性的丹参酮IIA成分,且水溶性的阿魏酸成分含量也较低。新工艺能明显保留脂溶性的丹参酮IIA,且增加阿魏酸的含量。
(2)新工艺制备的通脉提取物中丹参素、葛根素、阿魏酸和丹参酮IIA四种有效成分平均含量均较原工艺更高。
(3)对于小鼠缺血性心脏病的治疗:新工艺比原工艺更能提高缺血性心肌细胞ATP含量,更能改善小鼠缺血性心肌坏死。
(4)对于大鼠脑缺血的治疗:新工艺比原工艺更能降低缺血性脑组织Glu、Asp的含量,而更能够升高GABA含量,也更能够改善脑组织缺血性坏死。
四、总结
由上述筛选试验可知,工艺2提取方法能够提高药材中有效成分的提取效率,所得提取物中有效成分含量最高,且药效活性显著优于药典方法;工艺1提取方法,虽然对有效成分的提取效率不及工艺2,然而,令人意想不到的是,工艺2所得提取物对缺血性心肌组织和脑组织的保护作用,却显著优于工艺2和药典方法。因此,本发明以药效作用为参考,拟定工艺1为通脉口服液原料药的最佳提取方法,即:
取丹参、葛根和川芎药材各10g(1:1:1),混匀,先加入95%v/v乙醇提取,药渣再用40~60%v/v乙醇提取,药渣再用水提取;将三种提取物合并,得本发明原料药提取物。
综上所述,本发明中以醇、水为溶剂,对通脉口服液原料药进行合并提取,虽然对有效成分的提取效率不及50~70%醇提,然而,该方法制备的原料药提取物,药效活性明显优于原制剂工艺以及有效成分含量最高的70%醇提物,取得了意料不到的技术效果,为心脑血管疾病患者带来了福音。

Claims (5)

1.通脉口服液原料药提取物的制备方法,其特征在于:它包括如下操作步骤:
(1)按重量配比称取原料药:丹参:葛根:川芎=1:1:1;
(2)将原料药混匀,依次以85~95%v/v乙醇、50~60%v/v乙醇、水提取,合并各提取产物,即得原料药提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:步骤(2)的提取工艺具体操作如下:先加入原料药重量20~40倍体积的85~95%v/v乙醇,加热回流1h,药渣再加原料药重量20~40倍体积的50~60%v/v乙醇,加热回流1小时,药渣最后加入原料药重量20~40倍体积的水,煎煮2小时。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:所述原料药提取物中,含有如下重量百分比的有效成分:丹参素1.5~2.4%,葛根素1.4~2.5%,阿魏酸1.3~2.5%,丹参酮IIA1.1~2.4%;
各有效成分含量重量比如下:丹参素:葛根素:阿魏酸:丹参酮IIA=(0.9~1.3):(1.0~1.3):(1.0~1.2):1.0。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:经高效液相色谱检测后,所述原料药提取物的色谱图中,丹参素色谱峰保留时间为5.7±0.2min,葛根素色谱峰保留时间为11.8±0.2min,阿魏酸色谱峰保留时间为19.7±0.2min,丹参酮IIA色谱峰保留时间为51.9±0.2min;
色谱条件如下:
色谱柱:十八烷基键合硅胶柱;
检测波长:280nm;
柱温:30℃;
流速:1.0ml/min;
流动相:以乙腈-0.1%冰醋酸水溶液梯度洗脱,洗脱程序如下:
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于:所述原料药提取物的色谱图如图14所示。
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