CN106124647B - 一种用平行人工膜渗透模型预测农药生物富集系数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于污染物环境评价领域，提供了一种用平行人工膜渗透模型预测农药生物富集系数的方法。本发明对于现有测定生物富集系数技术的不足，建立一种高通量快速预测农药生物富集系数的PAMPA测试技术。该发明通过PAMPA技术，通过GC‑MS测定农药的渗透率，建立渗透率及农药基本理化性质与生物富集系数的相关性，进而有效预测农药的生物富集系数。所述方法包括如下步骤：(1)确定胃及肠道PAMPA模型条件；(2)农药的渗透率测定；(3)农药生物富集(BCF)的预测。本发明是一种操作简单、预测性好且适用性强的预测技术。
Description
技术领域
本发明属于污染物环境评价领域，具体涉及一种用平行人工膜渗透模型(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay,PAMPA)预测农药生物富集系数的方法。
背景技术
农药的应用是20世纪农业生产取得快速发展的一个重要因素，但农药的不合理使用也会给人们带来严重风险。农药的使用是一把双刃剑，其一方面发挥除草、杀虫、杀菌等作用，保障了农业的丰收，确保了粮食的供应；另一方面，农药在使用过程中会残留在环境中，通过直接或间接的途径进入生物体对其产生危害。
农药残留可通过多种途径透过生物膜，被生物体吸收，产生毒害效应。然而现在多数的农药膳食风险评估只是通过检测食物中单个农药的残留浓度来评价其风险，这种评估方法没有考虑到农药真正的生物吸收，因此有必要将生物吸收考虑到膳食风险评估模型中，而生物富集系数(BCF)是评价生物吸收的重要指标。传统的BCF测定需要进行生物体实验，但该方法周期长，实验操作麻烦且成本较大。因此，建立一种可以高通量快速预测农药生物富集系数的方法就显得尤为重要。
平行人工膜渗透模型(Parallel Artificial Membrane Permeability Assay,PAMPA)，是一种比传统生物学方法更经济、高效、便捷的方法。PAMPA模型是由96孔滤膜(孔径为0.45μm)板和96孔板组成的“三明治”结构，药物溶液填充在下层供体池中，上层的受体池中是缓冲溶液，中间的疏水性膜支架上则是人工仿生生物膜，在恒温培养箱中培养6-15h后，由仪器测试分开的接收池和供 体池中的溶液。其通过“三明治”结构模拟不同的生物膜来测试不同生物组织的渗透率，从而评估化合物的生物富集系数。
发明内容
本发明对于现有测定生物富集系数(BCF)技术的不足，建立一种用平行人工膜渗透模型(PAMPA)预测农药生物富集系数的方法，该方法通过模拟胃肠生物膜的渗透率，建立农药生物富集因子(BCF)与渗透率等基本理化性质相关关系，进而评估化合物的生物富集系数。
本发明的技术方案：
一种用平行人工膜渗透模型预测农药生物富集系数的方法，步骤如下：
(1)确定胃及肠道PAMPA模型条件
建立PAMPA模型，胆固醇与蛋黄卵磷脂按照质量比为1：10制备人工膜，人工膜用于模拟胃和肠的生物膜；人工膜置于缓冲溶液中，人工膜与缓冲溶液的质量体积比为10％；所述的缓冲溶液为Na2HPO4和NaH2PO4混合溶液；
通过缓冲溶液调节pH＝2.7模拟胃的生物膜条件，即为胃生物膜体液；
通过缓冲溶液调节pH＝5.8模拟肠的生物膜条件，即为肠生物膜体液。
(2)农药的渗透率测定
供体池中加入0.05～1.0μg/mL农药溶液，在接收池中加入步骤(1)中得到的胃生物膜体液或肠生物膜体液，供体池中农药溶液和接收池中胃生物膜体液、肠生物膜体液二者的体积相同；然后将供体池放入接收池中，确保人工膜和接收池中的缓冲溶液完全接触；37℃孵育16h后，分别移取供体池和接收池中的溶液，然后通过气相色谱-质谱连用(GC-MS)进行分析得到农药的峰面积AU，测定农药的浓度C标准曲线；根据浓度C标准曲线计算对应农药的浓度，并计算人工膜的表观渗透率Pa和有效渗透率Pe。
通过人工膜的表观渗透率Pa由方程计算，其公式如下
其中，VA为接收池的体积(cm3)；VD为供体池的体积(cm3)；A为有效膜面积，为膜面积与膜孔隙率的乘积(0.24cm2)；t为样品培养时间(s)，CA(t)为接收池中农药培养后的浓度(mg/L)；CD(0)为供体池最初的浓度(mg/L)。
化合物在渗透过程中会有小部分化合物停留在膜中，因此需要引进化合物在人工膜中的截留系数R，则可得到Pe，计算公式如下：
其中，VD为供体池的体积(cm3)；VA为接收池的体积(cm3)；A为有效膜面积，为膜面积与膜孔隙率的乘积(0.24cm2)；t为样品培养时间(s)，CA(t)为接收池中化合物培养后的浓度(mg/L)；CD(0)为供体池最初的浓度(mg/L)；CD(t)为供体池培养后的浓度(mg/L)。
(3)农药生物富集系数(BCF)的预测
对生物富集系数(BCF)与人工膜的表观渗透率Pa、有效渗透率Pe及其基本理化性质(分子量、分子体积、分子极性、熔点、沸点、溶解度、辛醇-水分配系数)的相关性进行分析，以BCF为因变量，将人工膜的表观渗透率Pa、有效渗透率Pe分别纳入自变量内进行回归分析，得到BCF的预测模型方程，依据回归分析结果计算得到BCF计算值，并分析该计算值与实测值的线性拟合结果。
胃、肠表观渗透率Pa的BCF预测模型方程：
Log BCF＝0.23X1-0.416X2+0.088X8+0.193X9+2.669(R2＝0.755)
胃、肠有效渗透率Pe的BCF预测模型方程：
Log BCF＝0.166X1-0.41X2-0.523X10+0.671X11+2.222(R2＝0.760)
其中，X1为农药的辛醇-水分配系数取Log值；X2为农药的溶解度取Log值；X8为肠道表观渗透率取Log值；X9为胃表观渗透率取Log值；X10为肠道有效渗透率取Log值；X11为胃有效渗透率取Log值。
本发明的有益效果：本发明采用PAMPA测试技术，通过GC-MS测定51种农药的渗透率，建立农药生物富集因子(BCF)与渗透率等基本理化性质相关关系，用于预测农药的生物富集(BCF)。本发明是一种操作简单、预测性好且适用性强的预测技术。
附图说明
图1(a)为表观渗透率Pa条件下BCF的预测值与实验值对比图。
图1(b)为有效渗透率Pe条件下BCF的预测值与实验值对比图。
图2是PAMPA模型示意图。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
实施例1 确定胃及肠道PAMPA模型条件
(1)人工膜的制备
准确称量0.1g蛋黄卵磷脂，0.01g胆固醇，混合后充分溶解在1.1ml正十二烷溶液中，超声至呈黄色透明液体形成人工膜溶液。
(2)缓冲溶液的配制
胃和小肠是药物和食物吸收的主要部位，其中胃液偏酸性，其pH值在2左右，小肠的pH为5～8。因此本发明设置胃的pH为2.7，肠道pH为5.8、6.5、7.4。
磷酸缓冲液的配制：将31.21g NaH2PO4和71.64g Na2HPO4分别溶于1L超纯水中待用。
分别取上述配好的8mL Na2HPO4和92mL NaH2PO4溶液于烧杯中即得pH＝5.8的缓冲溶液；
分别取上述配好的Na2HPO4和NaH2PO4溶液32mL和68mL于烧杯中即得pH＝6.5的缓冲溶液；
分别取上述配好的Na2HPO4和NaH2PO4溶液81mL和19mL于烧杯中即得pH＝7.4的缓冲溶液。
醋酸缓冲液的配制(pH＝2.7)：取12mL醋酸超纯水定容至1L即得。
本发明建立PAMPA模型，胆固醇与蛋黄卵磷脂按照质量比为1：10制备人工膜，人工膜用于模拟胃和肠的生物膜；选取pH＝2.7缓冲溶液来模拟胃的条件，肠道分别选取pH＝5.8、6.5、7.4的缓冲溶液进行模型验证。验证结果中肠道条件下pH＝5.8时相关性最好(R2＝0.806)，在胃的条件下pH＝2.7时相关性最好(R2＝0.807)，得到模型最优结果(如表1)；选取拟合结果最优的pH条件来进行后续的肠道渗透性实验。
表1实验结果
实施例2 农药的渗透率测定
供体池中加入0.05μg/mL～1.0μg/mL农药溶液，在接收池中加入步骤(1)中得到的胃、肠生物膜体液，供体池中农药溶液和接收池中胃、肠生物膜体液二者的体积相同，均为200μL；然后将供体池放入接收池中，确保人工膜和接收池中的缓冲溶液完全接触；在培养箱中37℃孵育16h后，分别移取上层供体池 和下层接收池中的溶液，然后气相色谱-质谱连用(GC-MS)进行分析得到农药的峰面积AU，进而得到农药的浓度C标准曲线；根据浓度C标准曲线计算对应农药的浓度，计算人工膜的表观渗透率Pa和有效渗透率Pe。
农药测定采用气相色谱-质谱连用进行测定，色谱柱为石英毛细管柱。具体测试条件见表2。
表2：GC-MS的测试条件
通过人工膜的表观渗透率Pa由方程计算，其公式如下
其中，VA为接收池的体积(cm3)；VD为供体池的体积(cm3)；A为有效膜面积，为膜面积与膜孔隙率的乘积(0.24cm2)；t为样品培养时间(s)，CA(t)为接收池中农药培养后的浓度(mg/L)；CD(0)为供体池最初的浓度(mg/L)。
化合物在渗透过程中会有小部分化合物停留在膜中，因此需要引进化合物在人工膜中的截留系数R，则可得到Pe，计算公式如下：
其中，VD为供体池的体积(cm3)；VA为接收池的体积(cm3)；A为有效膜面积，为膜面积与膜孔隙率的乘积(0.24cm2)；t为样品培养时间(s)，CA(t)为接收池中化合物培养后的浓度(mg/L)；CD(0)为供体池最初的浓度(mg/L)；CD(t)为供体池培养后的浓度(mg/L)。
通过实验测得农药的表观渗透率(Pa)和有效渗透率(Pe)如下表3所示。
表3农药相关信息表
注：#表示渗透率值很小，不可定量计算
-表示渗透培养后接收池浓度高于1/2原始浓度
实施例3 农药生物富集系数(BCF)的预测
对表4中农药的生物富集系数(BCF)与测定的农药渗透率及其他基本性质的相关性进行分析。农药渗透率包括肠道表观/有效渗透率、胃表观/有效渗透率， 基本理化性质包括分子量、分子体积、熔点、分子极性、沸点、溶解度、辛醇-水分配系数等(表4)，进行逐步线性回归分析，构建多元线性回归模型，以考察渗透性和理化性质与BCF的关系。具体构建模型代表符号如表5所示。
表4农药相关信息表
注：-表示准确数据无法获取；a来源于US EPA EPI SuiteTM(Version 4.1)的计算值；
b来源于US EPA EPI SuiteTM(Version 4.1)的实验值；c源于http:// www.chemspider.com
表5方程中各项相关信息
构建的预测模型方程如下，依据回归分析结果计算得到BCF计算值，并分析该计算值与实测值的线性拟合结果(图1(a),图1(b))，建立用平行人工膜渗透模型(PAMPA)预测农药生物富集系数的方法。
胃、肠表观渗透率Pa的BCF预测模型方程：
Log BCF＝0.23X1-0.416X2+0.088X8+0.193X9+2.669(R2＝0.755)
胃、肠有效渗透率Pe的BCF预测模型方程：
Log BCF＝0.166X1-0.41X2-0.523X10+0.671X11+2.222(R2＝0.76)
其中，X1为农药辛醇-水分配系数取Log值；X2为农药溶解度取Log值；X8为肠道表观渗透率取Log值；X9为胃表观渗透率取Log值；X10为肠道有效渗透率取Log值；X11为胃有效渗透率取Log值。
Claims (2)
1.一种用平行人工膜渗透模型预测农药生物富集系数的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)确定胃及肠道PAMPA模型条件
建立PAMPA模型，胆固醇与蛋黄卵磷脂按照质量比为1：10制备人工膜，人工膜用于模拟胃和肠的生物膜；人工膜置于缓冲溶液中，人工膜与缓冲溶液的质量体积比为10％；所述的缓冲溶液为Na2HPO4和NaH2PO4混合溶液；
通过醋酸缓冲溶液调节pH＝2.7模拟胃的生物膜条件，即为胃生物膜体液；
通过缓冲溶液调节pH＝5.8模拟肠的生物膜条件，即为肠生物膜体液；
(2)农药的渗透率测定
供体池中加入0.05～1.0μg/mL农药溶液，在接收池中加入步骤(1)中得到的胃生物膜体液或肠生物膜体液，供体池中农药溶液和接收池中胃生物膜体液、肠生物膜体液二者的体积相同；然后将供体池放入接收池中，确保人工膜和接收池中的缓冲溶液完全接触；37℃孵育16h后，分别移取供体池和接收池中的溶液，然后通过气相色谱-质谱连用(GC-MS)进行分析得到农药的峰面积AU，测定农药的浓度C标准曲线；根据浓度C标准曲线计算对应农药的浓度，并计算人工膜的表观渗透率Pa和有效渗透率Pe；
(3)农药生物富集系数BCF的预测
对生物富集系数与人工膜的表观渗透率Pa、有效渗透率Pe及其理化性质的相关性进行分析，以BCF为因变量，将人工膜的表观渗透率Pa、有效渗透率Pe分别纳入自变量内进行回归分析，得到BCF的预测模型方程，依据回归分析结果计算得到BCF计算值，并分析该计算值与实测值的线性拟合结果；
胃、肠表观渗透率Pa的BCF预测模型方程：
Log BCF＝0.23X1-0.416X2+0.088X8+0.193X9+2.669(R2＝0.755)
胃、肠有效渗透率Pe的BCF预测模型方程：
Log BCF＝0.166X1-0.41X2-0.523X10+0.671X11+2.222(R2＝0.760)
其中，X1为农药的辛醇-水分配系数取Log值；X2为农药的溶解度取Log值；X8为肠道表观渗透率取Log值；X9为胃表观渗透率取Log值；X10为肠道有效渗透率取Log值；X11为胃有效渗透率取Log值。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的理化性质包括分子量、分子体积、分子极性、熔点、沸点、溶解度和辛醇-水分配系数。
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