CN102465167A - 一种发光细菌的快速、高通量急性毒性测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种发光细菌的快速、高通量急性毒性测试方法，属于分析检测与技术范畴。通过研发一种发光细菌的复苏溶液，可在30分钟内将发光细菌冻干粉、冷冻保存的菌种快速复苏，复苏后的菌液无需前培养，搅拌一定时间后即可作为工作菌液直接用于毒性测试。同时，选择微孔板作为毒性测试的暴露容器和检测池，在孔中加入待测样品和工作菌液，暴露15分钟后即可采用化学发光酶标仪进行发光强度测试。采用该方法既省去了烦琐、耗时的工作菌液前培养程序，又节省了检测时间，降低了成本，提高了测试结果的准确性，实现了毒性测试的高通量化，具有广阔的推广应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种发光细菌的快速、高通量急性毒性测试方法，属于环境检测和评价技术范畴。
背景技术
随着社会进步和工农业生产的发展，越来越多的化学品被生产和使用，目前已登记的化学品数量超过数千万种之多，日常使用的化学品超过10万种。这些化学品在生产和使用过程中可能通过多种途径进入环境，进而蓄积在人体、生物体中，对生态环境和人体健康造成严重威胁。为有效管理化学品、准确评价环境样品的安全性，生物毒性测试逐渐发展成为一种必不可少且最为直观有效的方法。
发光细菌毒性检测是建立在细菌发光生物传感方法基础上的毒性检测技术，具有快速、经济、重现性好、与鱼等其他毒性测试结果可比性高等诸多优势。发光细菌的发光过程是菌体内一种新陈代谢的生理过程，发光的波长在490nm左右。当有毒有害物质与发光细菌接触时会影响发光菌的新陈代谢，发光强度的减弱与毒性物质的浓度成正比。目前，发光细菌法已广泛应用于质检、环境监测、水产养殖等领域，被国内外多国权威机构列为标准方法，如ISO11348、GB/T15441-1995、DIN38412等。
传统的发光细菌毒性检测方法是，在15℃温度下，以不含毒性物质的溶液作为对照，化学品或环境样品溶液与测试菌液接触15min后，测定化学品对发光细菌的抑制率。待测样品的毒性结果以LID值(达到一定抑制率时样品的稀释倍数)、EC值(造成一定抑制率时样品的浓度)表示。而我国标准GB/T15441-1995中水质的毒性水平是以氯化汞的当量浓度来表征。
然而，传统的发光细菌毒性测试方法或多或少存在一些不足，首先，传统方法多推荐使用冻干粉保存发光细菌菌种，冻干粉菌种的复苏过程一般比较费时，快的需要几个小时，慢的需要几天，这样需要花费较多时间进行菌种的复苏或前培养，延长了毒性测试的时间。其次，大多数传统毒性测试方法采用试管作为暴露容器，测试所需的样品量较大，而且工作菌液的加入量也较多，这样不可避免地稀释了待测溶液的浓度，导致结果不够准确。此外，传统方法测试一般每次可以测试的样品数量有限，不利于对大量样品的毒性筛查。因此，开发一种发光细菌的快速、高通量急性毒性测试方法十分迫切。
发明内容
本发明的目的是为克服传统发光细菌急性毒性测试中工作菌液前培养时间长、待测样品需要量较大、实验操作时间长、难以保证准确的暴露时间和暴露浓度、测试误差较大、难以开展大量样品的快速筛查等不足，提供一种发光细菌快速的复苏方法，为有毒化学污染物和环境样品的高通量毒性筛查方法提供技术保障。
本发明的目的通过以下方式实现：开发出一种复苏溶液，能快速复苏以冻干粉、或冷冻保存的发光细菌菌种，将保存的菌种接入复苏溶液后经过一定时间的搅拌，即可直接用于毒性测试；同时，采用微孔板作为毒性测试的暴露容器和检测池，既减少了测试所需样品的体积，又避免了传统测试过程中对待测样品的不必要稀释；通过采用多道移液器转移溶液和酶标仪检测发光强度，既缩短了测试时间，又提高了结果的准确性，实现了高通量化。
本发明的优点主要体现在以下几个方面：(1)开发了一种针对发光细菌冻干粉和冷冻保存菌种的复苏溶液，可快速复苏菌种，无需繁琐、费时的菌液前培养，即可用于毒性测试；(2)采用微孔板既作为毒性测试中暴露容器，又作为菌液发光强度的检测池，减少了测试所需样品的体积；(3)采用多道移液器转移待测样品和工作菌液，减少了实验操作时间；(4)用化学发光酶标仪检测发光细菌的发光强度，加快了检测速度，也提高了检测的灵敏度和数据的准确性；(5)采用微孔板测试，可以同时测定多个样品，通过设定平行样，降低了实验误差，保证了实验结果的可靠性，实现了毒性测试的高通量化。
综上，本发明通过开发一种针对发光细菌菌种快速复苏的溶液、采用微孔板作为毒性测试的暴露容器和检测池，既实现了菌种的快速复苏，又缩短了毒性测试时间，也提高了测试的灵敏度和测试数据的准确性，实现了急性毒性测试方法的快速、准确和高通量化，所得测试结果与原标准方法一致。
附图说明
图1.发光细菌快速毒性测定法与国标方法测试结果比较
图2.发光强度随复苏时间的变化
实施例：
取一支市售的发光细菌冻干粉或冷冻保存的冻存管，在20℃条件下快速解冻，向管中加入1.0mL复苏溶液，混合均匀后，小心将管中的混合液转入100mL复苏溶液，在20℃条件下以500转/分钟的速度搅拌30分钟。在一只96微孔板上，用8通道移液器向微孔板中移入245μL体积的待测样品溶液，然后再快速向每孔移入5μL体积的工作菌液，开始计时。15分钟后在化学发光酶标仪上测试微孔板每个孔的发光强度，并记录结果。
Claims (6)
1.一种发光细菌的快速、高通量测试方法，属于环境检测和评价技术范畴。通过开发一种发光细菌的复苏溶液，能在30分钟内快速复苏发光细菌的冻干粉或冷冻保存的菌种，复苏后的菌液无需前培养即可作为毒性测试的工作菌液。同时采用微孔板作为毒性测试的暴露容器和检测池，缩短了实验操作时间，减少了待测样品的用量，加快了测试速度，提高了测试的准确性，便于推广应用。
2.权利要求1所述的一种发光细菌的快速、高通量测试方法，其特征在于：不仅适用于明亮发光杆菌T3小种、费氏弧菌等海洋型菌，也适用于青海弧菌等淡水型菌。
3.权利要求1所述的一种发光细菌的快速、高通量测试方法，其特征还在于：不仅适用于发光细菌的冻干粉菌种，也适用于冷冻保存的菌种。
4.权利要求1所述的一种发光细菌的快速、高通量测试方法，其特征还在于：快速复苏溶液的组成，包括氯化钠、磷酸盐、氯化镁、氯化钾等无机组分，以及胰蛋白胨、酵母膏、氨基酸、甘油、维生素、葡萄糖等有机组分。
5.权利要求1所述的一种发光细菌的快速、高通量测试方法，其特征还在于：采用微孔板作为毒性测试的暴露容器和检测池，减小了待测样品的体积，缩短了实验操作的时间，提高了毒性测试的速度和实验数据的准确性。
6.权利要求1所述的一种发光细菌的快速、高通量测试方法，其特征还在于：不仅适用于12孔板、24孔板、96孔板、还适用于384孔板。
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